Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Организация ферментов биосинтеза дНТФ 9
1.1.1. Биосинтез дНТФ в клетках E.coli, инфицированных бактериофагом Т4 9
1.1.2. дНТФ-синтезирующие комплексы (ДСК) 10
1.1.3. Связь ДСК с репликационным аппаратом 14
1.1.4. Организация ферментов биосинтеза дНТФ в других организмах 15
1.2. Особенности физиологии бактериофага Т5 17
1.2.1. Общие черты бактериофага Т5 , 17
1.2.2. Особенности структуры ДНК 17
1.2.3. FST-механизм транспорта ДНК в клетку 19
1.2.4. Регуляция транскрипции генов 19
1.2.5. Разрушение ДНК клетки-хозяина.. 20
1.2.6. Ферменты биосинтеза дНТФ 22
1.2.7. Степень изученности генома бактериофага 24
1.3. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 25
1.3.1. Роль фермента в метаболизме ., 25
1.3.2. Описание фермента и его свойства 26
1.3.3. Пространственная структура нуклеозидмонофосфаткиназ 27
1.3.4. Структурные основы субстратной специфичности 31
2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Микробиологические методы 33
2.1.1.Штаммы бактерий, бактериофаги, плазмиды и среды 33
2.1.2. Получение бактериофага Т5 в высоком титре 33
2.1.3. Получение биомассы клеток Ксоїї, инфицированных бактериофагом Т5 34
2.2. Аналитические методы 34
2.2.1. Метод определения белка 34
2.2.2. Электрофорез белков в ПААГ 34
2.2.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот 35
2.2.4. Изоэлектрофокусирование 35
2.2.5. Определение молекулярной массы дНМФ-киназы бактериофага Т5 35
2.3. Определение активности дНМФ-киназ 35
2.3.1. ХроматографическиЙ метод 35
2.3.2. Спектрофотометрический метод 36
2.3.3. Тестирование активности методом тонкослойной хроматографии 37
2.4. Методы очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5 37
2.4.1.. Приготовление клеточного экстракта 37
2.4.2. Удаление нуклеиновых кислот 37
2.4.3. Фракционирование сульфатом аммония 38
2.4.4. Ионообменная хроматография 38
2.4.5. Аффинная хроматография 39
2.5. Методы молекулярной биологии 39
2.5.1. Выделение ДНК 39
2.5.2. Гидролиз ДНК 40
2.5.3. Лигирование фрагментов ДНК , 41
2.5.4. Полимеразная цепная реакция 41
2.5.5. Определение первичной последовательности ДНК , 42
2.5.6. Праймеры , 43
2.5.7. Получение компетентных клеток и их трансформация 46
2.5.8. Скрининг рекомбинантных клонов 46
2.5.9. Экспрессия рекомбинантных плазмид 47
2.5.10. Гибридизация ДНК бактериофагов с зондом 48
2.6. Компьютерные методы 49
2.6.1. Анализ нуклеотидных последовательностей 49
2.6.2. Анализ аминокислотных последовательностей 49
2.6.3. Определение потенциальной пространственной структуры белка 49
2.7. Методы биотехнологии 49
2.7.1. Иммобилизация дНМФ-киназы бактериофага Т5 49
2.7.2, Синтез дНТФ при помощи ИФП дНМФ-киназы бактериофага Т5 50
3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Выделение и очистка дНМФ-киназы бактериофага Т5 51
3.1.1. Очистка дНМФ-киназы 51
3.1.2. Физико-химические свойства белка 52
3.1.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот 56
3.2. Структурная организация фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 (13-19,5% генома) 56
3.2.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности 56
3.2.2. Локализация генов и открытых рамок считывания и анализ потенциальных функций их продуктов 60
3.2.3. Потенциальные регуляторные элементы 65
3.2.4. Клонирование генаlysn его экспрессия 67
3.2.5. Идентификация продукта гена lys - лизоцима 67
3.3. Функциональная характеристика гена dnk 68
3.3.1. Клонирование гена dnk и его экспрессия ъЕхоН 68
3.3.2. Очистка рекомбинантной дНМФ-киназы и ее свойства 70
3.3.3. Анализ потенциальной структуры фермента 71
3.3.4. Ферментативный синтез дезоксирибоаденозин-а-тиотрифосфата (дАТФа8).,74
3.4.. Исследование широкоспецифичных киназ других бактериофагов 75
3.4.1. Ген 52 бактериофага (рСЗ 1: клонирование и экспрессия в Е. coli 75
3.4.2. Ген 52 кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности 76
3.4.3. Бактериофаг Т4-типа RB49 также кодирует дНМФ-киназу 78
3.4.4. Анализ строения фаговых киназ 80
Выводы 83
Список литературы 85
Приложение 98
- Организация ферментов биосинтеза дНТФ в других организмах
- Пространственная структура нуклеозидмонофосфаткиназ
- Физико-химические свойства белка
- Клонирование гена dnk и его экспрессия ъЕхоН
Введение к работе
Нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК - являются незаменимыми компонентами живой клетки, выполняя функцию хранения, передачи и реализации генетической информации. Нарушение структуры и биосинтеза нуклеиновых кислот лежит в основе многих заболеваний наследственной и вирусной этиологии. Предшественники нуклеиновых кислот, нуклеозидтрифосфаты, как соединения, обладающие макроэргическими связями, помимо функции предшественников нуклеиновых кислот, играют большую роль в процессах синтеза и распада белков, липидов и углеводов, являются кофакторами целого ряда ферментов. Поддержание нормальных концентраций и соотношения дНТФ в клетках является одним из важных показателей гомеостаза. В связи с этим большое значение в биологии и медицине имеет исследование метаболизма предшественников нуклеиновых кислот.
Фосфорилирование дезоксирибонуклеозидмонофосфатов до соответствующих дифосфатов является одним из ключевых этапов синтеза предшественников ДНК — дезоксирибонуклеозидтрифосфатов - в клетках про- и эукариот. Эти реакции в живых клетках катализируют ферменты класса трансфераз - нуклеозидмонофосфаткиназы (НМФ-киназы), в качестве донора фосфорила использующие АТФ или дАТФ. дНМФ+(д)АТФ <=> дНДФ+(д)АДФ
Бактерии, дрожжи и высшие эукариоты, как правило, индуцируют по крайней мере четыре нуклеозидмонофосфаткиназы, специфичные к азотистому основанию субстрата.
Инфекция Escherichia coli колифагом сопровождается активной репликацией фаговой ДНК. При этом количество вновь синтезированной ДНК превышает количество ДНК клетки-хозяина примерно в 4,5 раза (Crawford, 1959). Т-четные бактериофаги (Т2,Т4, Т6) используют для синтеза своей ДНК пул нуклеотидов клетки хозяина, и только часть их синтезируется de novo. Тем не менее, для обеспечения потребности в трифосфатах эти фаги индуцируют дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы (КФ 2.7.4.12), катализирующие фосфорилирование трех из четырех дезоксирибонуклеозидмонофосфатов, входящих в ДНК этих фагов (дТМФ, дГМФ, гм-дЦМФ).
Бактериофаг Т5 также кодирует дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназу (КФ 2.7.4.13), продукт гена dnk. Однако, в отличие от Т-четных фагов, бактериофаг Т5 использует для быстрой репликации своей ДНК только дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, синтезированные de novo. Цитозин в ДНК фага не гидроксиметилирован; вероятно, поэтому киназа бактериофага Т5 фосфорилирует все четыре монофосфата, соответствующие каноническим основаниям ДНК. дНМФ-киназа бактериофага Т5 пока является единственным ферментом группы нуклеозидмонофосфаткиназ, обладающим такой широкой субстратной специфичностью.
Этот фермент представляет интерес для исследования механизмов биосинтеза предшественников ДНК в инфицированных бактериофагом клетках, регуляции этого процесса в зависимости от клеточных нужд и роли в нем фаговых и клеточных белков. Изучение структуры и функций ферментов, участвующих в биосинтезе предшественников ДНК, в том числе дНМФ-киназы бактериофага Т5, способно дать информацию, необходимую для понимания их биологической роли. Кроме того, широкая специфичность фермента бактериофага Т5 - потенциальный источник знаний о молекулярных основах взаимодействия белок-субстрат, ключ к пониманию структурных основ специфичности киназ. Особое значение приобретает исследование широкоспецифичной киназы бактериофага Т5 в связи с потенциальным использованием такого фермента в технологии энзиматического синтеза дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, которые в настоящее время широко используются в научных исследованиях и в медицине.
Целью настоящей работы явилось структурно-функциональное и генетическое исследование дНМФ-киназы бактериофага Т5, а также выявление новых дНМФ-киназ широкой специфичности.
К моменту начала работы данный фермент был частично очищен (Bessman et all, 1964), что позволило авторам определить ряд его биохимических свойств -относительную скорость реакции, субстратную специфичность, константы Михаэлиса для различных субстратов и константы ингабирования. При этом невысокая степень очистки не позволила авторам определить молекулярную массу фермента и его удельную активность. Кроме того, отсутствовали данные о первичной структуре гена. Ранее неоднократно предпринимались попытки "шотган"-клонирования фрагментов генома бактериофага Т5, но они не дали результата применительно к ранней области генома, в которой находится ген dnk.
Исходя из имеющихся данных, для достижения выбранной цели были поставлены следующие задачи;
Выделить и очистить до гомогенного состояния дНМФ-киназу бактериофага Т5 из инфицированной фагом биомассы E.coli, определить молекулярную массу белка, изучить физико-химические свойства фермента.
Секвенировать область генома бактериофага Т5, содержащую ген dnk, кодирующий фермент, и идентифицировать ген, пользуясь данными о ферменте.
Клонировать ген dnk и экспрессировать его в Е.соН, разработать простой способ очистки целевого белка из клеток штамма-продуцента с высоким выходом.
Провести анализ компьютерных баз данных на основании полученной информации о структуре киназ с целью поиска гомологичных ферментов из других источников.
В настоящей работе впервые описан процесс очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5 до гомогенного состояния из инфицированной фагом биомассы К соН и определены ее ранее неизвестные физико-химические свойства - молекулярная масса, изоэлектрическая точка, температурная стабильность, - а также аминокислотная последовательность N-конца белка. Выполнены секвенирование фрагмента области С генома бактериофага, содержащего ген dnk, и его описание (включающее открытые рамки считывания, потенциальные промоторы и терминаторы транскрипции), Ген dnk идентифицирован и клонирован в плазмиду с эффективным промотором. Рекомбинантная дНМФ-киназа бактериофага Т5 очищена из клеток штамма-продуцента с высоким выходом двумя альтернативными способами. На основании полученной информации о первичной структуре дНМФ-киназы Т5 сделано предположение о возможной пространственной структуре белка. В рамках исследования фаговых дНМФ-киназ выделен и клонирован ген новой дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы широкой специфичности, кодируемой бактериофагом фС31.
Организация ферментов биосинтеза дНТФ в других организмах
Ввиду того, что дНТФ используются почти исключительно для синтеза ДНК, весьма интересным представляется вопрос о связи ДСК с репликационным аппаратом. В пользу существования такой связи говорят следующие предпосылки. Во-первых, скорость синтеза ДНК в инфицированных бактериофагом клетках Е.соїі очень высокая - порядка 1500 нуклеотидов в секунду при 37 на каждую вилку репликации. Во-вторых, сродство репликационного аппарата прокариот к дНТФ низкое. Поэтому целесообразным представляется существование функциональной взаимосвязи между репликационным аппаратом клетки и дНТФ-синтезирующим комплексом, поддерживающим высокие концентрации нуклеотидов у сайтов репликации и служащим таким образом субстратным каналом (Mathews, 1991),
Ранее было обнаружено, что в клетках, пермеабилизованных сахарозой, рибонуклеозиддифосфаты или дезоксирибонуклеозидмонофосфаты (более отдаленные предшественники) встраиваются в ДНК быстрее, чем прямые предшественники — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (Reddy and Mathews, 1978). В связи с этим было выдвинуто предположение о существовании двух пулов предшественников ДНК — более концентрированного малого, быстро обращающегося и используемого для репликации, и большого, менее концентрированного и медленно замещающегося, который мог бы использоваться для репарации и рекомбинации. Такая функциональная компартментализация могла бы обеспечиваться ДСК, связанными с репликационным аппаратом и создающим высокие концентрации дНТФ у репликационных сайтов. В пользу гипотезы о существовании функциональной компартментализации предшественников ДНК говорят данные исследования концентрации дТТФ, при которой скорость репликации максимальна, проведенного лабораторией Мэтьюза (Mathews and Sinha, 1982). Оказалось, что in vitro концентрация дТТФ составляет 250 мкМ, в то время как in vivo внутриклеточная концентрация дТТФ достигает только 65 мкМ. Следовательно, либо пулы дНТФ действительно функционально разделены в клетке, либо организация ферментов в комплекс в 3-4 раза снижает Km. Как бы то ни было, эти данные позволили постулировать наличие субстратных каналов к сайтам репликации, которыми служат ДСК.
Имеются генетические доказательства связи ДСК с репликационным аппаратом. К ним относятся данные о супрессии мутаций гена 42 (дЦМФ-гидроксиметилаза) мутациями в гене 43 (ДНК-полимераза), что говорит о взаимодействии этих белков (Chao et al., 1977). Имеется также мутация в гене 41 (хеликаза), супрессируемая мутацией в гене дигидрофолатредуктазы (MacDonald and Hall, 1984), и мутация в гене 32 (топоизомераза), супрессируемая мутацией в гене NrdB (малая субъединица рибонуклеотидредуктазы) (Chao et al., 1977). Кроме того, при помощи аффинного связывания белков на колонке с иммобилизованной дЦМФ-гидроксиметилазой показано, что данный фермент взаимодействует с рядом репликационных белков - праймазой, UvsX и UvsY, PseT (полинуклеотид-5 -киназа-3 -фосфатаза), а также ДНК-полимеразой (Wheeler et al., 1992).
Таким образом, белки ДСК взаимодействуют с белками репликационного аппарата. Существует гипотеза, что важную роль в осуществлении этой связи играет gp32, связывающийся непосредственно с тимидилатсинтетазой и стабилизирующий структуру одноцепочечной ДНК-матрицы (Wheeler et al., 1996). Авторы упоминаемой работы, суммируя все данные о ДСК, представили схему активного комплекса и предположили количество белков в каждом комплексе и количество ДСК на вилку репликации.
В настоящее время доказано, что ДСК играют роль в поддержании точности репликации. Так, мутация в гене дЦМФ-дезаминазы 1000-кратно увеличивала частоту реверсий АТ- ГЦ (Ji and Mathews, 1991). Обсуждается возможное участие ДСК в других процессах, требующих синтеза дНТФ, например репарации (Greenberg et al., 1994). Закономерен вопрос: существует ли связь между биосинтезом дНТФ и репликацией в других организмах, особенно эукариотических? И насколько модель, существующая для инфицированных бактериофагом Т4 клеток, приложима для понимания этой связи? В бактериальных клетках (неинфицированная Е.соЩ была описана быстро седиментирующая форма рибонуклеотидредуктазы, что говорит в пользу существования ДСК (Lunn and Pigiet, 1979). Но до сих пор не было проведено ни кинетических, ни генетических исследований этого вопроса. Для вируса энцефаломиокардита было показано, что в состав репликационных комплексов, синтезирующих РНК вируса, входят по крайней мере два фермента биосинтеза предшественников — НМФ-киназа и НДФ-киназа (Koonin and Agol, 1983). С информацией об эукариотических организмах дело обстоит гораздо сложнее — не вследствие скудости, а из-за трудности истолкования противоречивых данных. В литературе имеется несколько указаний на обнаружение агрегатов ферментов биосинтеза дНТФ (Manwaring and Fuchs, 1979, Reddy and Pardee, 1980). Но нельзя исключить неспецифическую агрегацию. Бедны также генетические и кинетические доказательства. Вообще, в рассмотрении организации дНТФ-синтезирующего комплекса у эукариот существует 2 важных вопроса - где мог бы находиться такой комплекс и нужен ли эукариотам градиент концентрации дНТФ у репликационных сайтов (Mathews and Slabaugh, 1986). Было показано, что ключевой фермент биосинтеза дНТФ -рибонуклеотидредуктаза - находится в цитоплазме в течение всех стадий клеточного цикла. Тимидилатсинтаза и дУТФаза также являются цитоплазматическими ферментами. И, хотя существуют данные о миграции ферментов биосинтеза дНТФ и самих дНТФ в ядро в S-фазе клеточного цикла, но в лаборатории Мэтьюза было показано, что в S-фазе возрастает общее содержание дНТФ, причем в основном в цитоплазме, а в ядро они мигрируют для репликации. В 1990 году иммуноцитохимические исследования показали связывание рибонуклеотидредуктазы с наружной ядерной мембраной. Пока неясно, связан ли синтез дНТФ с его транспортом в ядро (Mathews, 1993). Таким образом, доказательства существования направленного синтеза дНТФ у эукариот косвенные. Что касается возможной кинетической связи ферментов синтеза дНТФ и репликации, то есть основания сомневаться в её целесообразности. Этому есть три причины, заключающиеся в особенностях эукариотической репликации: сродство ДНК-полимеразы к дНТФ в 10 раз больше, чем у прокариот; число репликационных вилок на несколько порядков больше; максимальная скорость репликации в 10 раз ниже, чем у прокариот (Mathews, 1993). Возможно, что потребности в предшественниках обеспечиваются простой диффузией дНТФ к репликационным сайтам.
Пространственная структура нуклеозидмонофосфаткиназ
Изучение структуры нуклеозидмонофосфаткиназ представляет отдельное направление молекулярной биологии, имеющее целый ряд важнейших приложений в связи с широким применением модифицированных нуклеозидов в медицине. Помимо изучения механизмов биологического катализа на молекулярном уровне, сведения о структуре этих ферментов уже сегодня помогают создавать химерные белки, обладающие нужной специфичностью, что позволяет рассчитывать на их успешное применение в терапии рака и при лечении иммунодефицита человека (Lavie et al., 1998, Brundiers et al„ 1999). Изучение структуры киназ и дальнейшее ее сравнение со структурой других нуклеотидсвязывающих белков помогает путем выявления отличий понять функционирование более сложных молекул. Так, рассмотрение структуры гуанилаткиназоподобного домена (ГД) у белков класса MAGUK (недавно обнаруженных у всех животных, регулирующих синаптические процессы) позволило выявить отличия, препятствующие связыванию АТФ и катализу, а также сделать вывод о регуляторной роли конформационных изменений ГД, вызванных связыванием ГМФ, для образования функционально активного белок-связывающего модуля (1л et al., 2002), Таким образом, исследование структуры вирусных киназ широкой специфичности потенциально имеет большое прикладное значение.
К настоящему времени известна кристаллическая структура целого ряда нуклеозидмонофосфаткиназ из различных источников: это аденилаткиназы разных организмов (Dreusicke et al., 1988, Abele and Schulz, 1995), уридилаткиназа (Muller-Dieckmann and Schultz, 1994), тимидилаткиназы (Brundiers et al., 1999, Ostermann et al., 2003), цитидилаткиназа (Bucurenci et al., 1996), гуанилаткиназа (Sekulic et al,, 2002).
Сравнительное исследование структуры этих ферментов позволило выявить их общие особенности; особняком в их ряду стоит лишь бактериальная уридилаткиназа, уникальный гексамерный белок с нехарактерной для НМФ-киназ структурой (Bucurenci et al., 1998). Большинство известных нуклеозидмонофосфаткиназ - небольшие мономерные (реже - гомодимерные) белки, относящиеся к а/р классу, обычно состоят из 5 р-складок, окруженных 8-9 а-спиралями. Наиболее хорошо изучены аденилаткиназы: более 60 генов из разных источников секвенировано, получены кристаллы бактериального, дрожжевого и свиного фермента в присутствии и в отсутствие субстратов (Dreusicke et al., 1988, Muller and Schulz, 1992, Abele and Schulz, 1995). Большинство НМФ-киназ содержит три домена: основной, или коровый (CORE), содержащий АТФ-связывающую Ф-петлю (Р-1оор, фосфатсвязывающая петля), НМФ-связывающий и LID домены, соединенные с CORE перемычками (Yan and Tsai, 1999) (рис. 3). Считается, что движение НМФ-связывающего и LID доменов друг относительно друга, индуцированное связыванием субстратов, обеспечивает "закрытие" активного сайта, в результате чего происходит катализ (Fukami-Kobayashi et al., 1996, Sekulic et al., 2002).
Ф-петля имеет N-концевое поверхностное расположение и претерпевает сильные конформационные изменения при связывании АТФ, переходя из "открытой" в активную "закрытую" конформацию (Ostermann et al., 2003). Прямое влияние на этот конформационный переход имеет также связывание монофосфата; высказываются предположения, что конформационные изменения Ф-петли обеспечивают "индуцированное соответствие" - "induced fit" (Koshland, 1994) фермента и субстрата, а также защищают сайт от молекул воды и предотвращают гидролиз связанной АТФ (Brush, Bessman, 1993). В обобщенном виде последовательность Ф-петли выглядит так: XrXrXrXGXXgXGKg(s,t)t, где X - любая аминокислота, Хг - гидрофобная аминокислота. Самой консервативной аминокислотой Ф-петли является лизин, доказана его роль не только в связывании АТФ, но и в катализе (Zhou and Thomburg, 1998). После него обычно следует либо глицин (аминокислота, не имеющая боковой цепи и не создающая стерических препятствий связыванию АТФ), либо серин/треонин - их роль заключается в связывании иона магния, всегда "сопровождающего" АТФ. Ф-петля имеет структуру PJCCI, Кроме Ф-петли, к консервативным областям относят последовательность XrXXXrStGdXrXrR nMg -связывающий домен XrXrXrdG. LID домен большинства НМФ-киназ состоит из 30-60 аминокислот и участвует в связывании АТФ. Он содержит 3-4 остатка аргинина, стабилизирующих фосфаты АТФ и участвующих в переносе фосфорила. Дефицит аргининов в LID приводит к потере способности белка связывать АТФ, несмотря на консервативное строение Ф-петли (Li et al., 2002). Было показано, что один из аргининов участвует в связывании сахара монофосфата (Bertrand et al., 2002). Следует отметить, что именно различия в строении LID положены некоторыми исследователями в основу филогенетического древа нуклеозидмонофосфаткиназ (Fukami-Kobayashi et al., 1996).
Физико-химические свойства белка
Для получения компетентных клеток на основе штаммов E,coli XI29 и BL21(DE3) единичную колонию реципиентного штамма высевали в 5 мл LB и выращивали ночную культуру с качанием 12-14 часов при 37С. Разбавляли ночную культуру в 100 раз свежей LB и выращивали при интенсивной аэрации в качалочной колбе примерно 2 часа при 37С до достижения оптической плотности 0,4 ОЕ при длине волны 600 нм в 1-сантиметровых кюветах. Для получения компетентных клеток на основе штамма Exoli XI29, содержащих плазмиду pGPl-2, компетентные клетки штамма E.coli XI29 трансформировали этой плазмидой без прогревания, затем все операции по выращиванию клеток проводили при 28С.
Далее все процедуры проводили при 0С, во льду. Переносили культуру в стеклянные пробирки, охлаждали 10 мин и центрифугировали 10 мин при 2500-3000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость и отбирали ее остатки. Осторожно ресуспендировали клетки в растворе I (100 мМ RbCl, 50 мМ МпСЬ, 10 мМ СаСЬ, 30 мМ ацетат калия, 15% w/v глицерина) и оставляли во льду на 15-30 мин. Осаждали клетки центрифугированием в тех же условиях, сливали надосадочную жидкость, отбирали ее остатки и мягко ресуспендировали клетки в растворе 2 (10 мМ MOPS, рН 6,8,10 мМ RbCl, 75 мМ СаСІг, 15% w/v глицерина). Компетентные клетки фасовали в мини-пробирках и хранили при -70С. Полученные данным способом компетентные клетки обеспечивали уровень трансформации не менее 106 бактериальных клонов на 1 мкг ДНК.
При трансформации 1-20 мкл раствора ДНК переносили в охлажденную мини-пробирку. Добавляли 200 мкл компетентных клеток и оставляли пробирку во льду на 30-60 мин. После этого клетки подвергали тепловому шоку прогреванием при 42С (для клеток штамма ЕсоН XI29, содержащих плазмиду pGPl-2, при комнатной температуре) в течение 45 сек. После охлаждения добавляли 1 мл среды LB, перемешивали и инкубировали при 37С (28С) в течение 30-60 мин. Клетки осаждали центрифугированием в течение 1 минуты при 2000 g. Затем клетки ресуспендировали в остатках надосадочной жидкости (50-100 мкл) и растирали их стерильным шпателем на подсушенных чашках Петри с агаризованной LB, содержащей селективный антибиотик. Инкубировали чашки до появления единичных клонов размером 1-2 мм при 37С (28С).
Единичные клоны высевали каждый в 2 мл среды LB, содержащей селективный антибиотик, и выращивали 8-14 ч при 37С. Клетки осаждали центрифугированием при 2000 об/мин 2 минуты на центрифуге "Eppendorf" (Германия), ресуспендировали в 100 мкл дистиллированной воды, лизировали добавлением 200 мкл лизирующего раствора (0,2 М NaOH, 1% ДСН) и нейтрализовали 150 мкл 5М ацетата натрия (рН 5,0). Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 10000 об/мин, супернатант очищали последовательной экстракцией равным объемом фенола, смеси фенол :хлороформ (50:50) и хлороформа, как описано в п.2.5.1. Водную фазу осаждали 2,5 объемами этанола. Осадок растворяли в буфере для гидролиза. Плазмиды, содержащие вставку, гидролизовали соответствующими эндонуклеазами в рекомендованном буфере с добавлением РНКазы (0,5 мкг на один гидролиз). Анализировали плазмиды электрофорезом в 0,8-1% агарозном геле.
Синтез рекомбинантных белков индуцировали двумя способами, зависящими от типа клеток, в которых она осуществлялась, - при помощи теплового шока и ИПТГ.
Для индукции методом теплового шока плазмидой, содержащей вставку, трансформировали клетки штамма E.coli XI29, содержащего плазмиду pGPl-2, В этой конструкции ген ДНК-полимеразы фага Т7 находится под контролем pL-промотора, ингибируемого термолабильным репрессором. Репрессор кодируется геном CI857 плазмиды pGPl-2. Поэтому все операции, связанные с приготовлением компетентных клеток на основе этого штамма, осуществляются при температуре не выше 28С (см. п.2.5.7). Чашки инкубировали ночь при 28С, клетки смывали 5 мл жидкой LB, содержащей антибиотик. Далее клетки выращивали при 28 С и перемешивании до достижения оптической плотности 1,0 при 600 нм. Затем клетки прогревали при 42С в течение 10 минут, после чего выращивали при различной температуре (28, 37 и 42 С), отбирая пробы для анализа через определенные промежутки времени.
Для индукции экспрессии белка с помощью ИПТГ плазмидой, содержащей вставку, трансформировали клетки штамма E.coli BL21(DE3). В этой конструкции ген ДНК-полимеразы фага Т7 находится в геноме под контролем ИПТГ-индуцибельного 1ас-промотора. Чашки инкубировали ночь при 37С, клетки смывали 5 мл жидкой LB, содержащей антибиотик. Далее клетки растили в нужном объеме среды при 37 С и перемешивании до достижения оптической плотности 1,0 при 600 нм. Затем к культуре добавляли ИПТГ в различных концентрациях, после чего продолжали инкубацию при температуре 37С, отбирая пробы для анализа через определенные промежутки времени.
Для анализа использовали клетки, осажденные центрифугированием при 2000 об/мин, и клеточные экстракты после разрушения ультразвуком в буфере (0,05 М Трис-HCI, рН 8,0, 0,15 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ р-меркаптоэтанола) и осаждения дебриса при 10000 об/мин.
Клонирование гена dnk и его экспрессия ъЕхоН
Фосфотиоатные аналоги нуклеиновых кислот нашли широкое применение в молекулярной биологии. Практическое использование таких аналогов РНК и ДНК обусловлено в первую очередь их устойчивостью к деградации под воздействием нуклеаз, что позволяет использовать их в качестве эффективных агентов в живых клетках -например, рибозимов, специфически ингибирующих экспрессию генов. Наиболее простым способом получения фосфотиоатных аналогов нуклеиновых кислот является матричный синтез с помощью РНК- и ДНК-полимераз, которые, как оказалось, способны использовать для этой цели в качестве субстратов диастереомеры нуклеозид-а-тиотрифосфатов (Eckstein, 1985). Нуклеозид-а-тиотрифосфаты сами также широко применяются в молекулярной биологии - например, для сайт-направленного мутагенеза.
Альтернативный химическому синтезу путь получения дНТФаЗ заключается в использовании ферментативного фосфорилирования. Основным преимуществом этого пути является возможность синтеза только одного, природного (Sp, или экзо), диастереомера дНТФаБ.
Нами была исследована принципиальная возможность фосфорилирования Sp-Rp смеси химически синтезированных тиофосфатов при помощи рекомбинантной дНМФ-киназы бактериофага Т5 (Антонов и др., 2003). Для достижения поставленной цели был получен иммобилизованный ферментный препарат на основе рекомбинантного фермента и проверена способность данного и контрольного ИФП (клетки Ехоїі В) синтезировать дезоксирибонуклеозид-а-тиотрифосфат аденозина из дАМФаЗ одновременно с синтезом дАТФ из дАМФ в одних и тех же условиях (см. п. 2.7).
Вторая стадия фосфорилирования осуществлялась неспецифической бактериальной нуклеозиддифосфокиназой, содержащейся в ИФП.
Достоверно было показано, что дНМФ-киназа бактериофага TS фосфорилирует дАМФаЭ, но с меньшей эффективностью, чем дАМФ, В случае контрольного ИФП синтеза трифосфата не наблюдалось. Очевидно, дНМФ-киназы хозяина не способны фосфорилировать тиофосфаты. В случае ИФП дНМФ-киназы бактериофага Т5 полнота превращения модифицированного нуклеотида в трифосфат составила 50%. Можно предположить, что в реакцию вступает только один из смеси диастереомеров модифицированного нуклеотида.
Полученные результаты показывают, что дНМФ-киназу бактериофага Т5 можно рассматривать как потенциальный инструмент для синтеза in vitro модифицированных нуклеотидов, многие из которых являются противоопухолевыми агентами. При этом фермент специфичен к форме сахара, что является преимуществом по сравнению с химическим синтезом этих веществ.
Исследование широкоспецифичных киназ других бактериофагов 3,4.1. Ген 52 бактериофага фС31: клонирование и экспрессия в Exoli Одним из подходов к исследованию основ широкой специфичности дНМФ-киназ, помимо изучения уже известного представителя этой группы ферментов - дНМФ-киназы бактериофага Т5 - и сравнения его с дНМФ-киназой бактериофага Т4, являлся поиск новых ферментов, прежде всего фаговых, потенциально также имеющих широкую специфичность к субстрату.
С целью поиска гомологии была исследована база данных Entrez с помощью программы Blast. При этом был обнаружен ген 52 бактериофага стрептомицетов рС31, кодирующий белок длиной 188 аминокислот, проявляющий выраженное сходство с дНМФ-киназой бактериофага Т4 (Hendrix et al., 1999). Было показано, что близко к Таконіту у всех трех белков находится высококонсервативный участок GxxGxxxSGKD, который представляет собой сайт связывания АТФ. На основе данных об аминокислотной последовательности потенциального белка исследователи фага рСЗ 1 предположили, что ген 52 кодирует дНМФ-киназу (Smith et al., 1992), однако этого не было показано. Более того, конструкция, полученная посредством клонирования гена 52 вкупе с находящимся рядом репрессором "с" в pUC, осуществленного Мэгги Смит с соавторами, обладала высокой токсичностью для E.coli (M.Smith, персональное сообщение).
Для достоверного определения функции продукта ген 52 бактериофага (рСЗ 1 был клонирован по сайтам Ncol-ВатШ в плазмиду pETISb. Полученная конструкция была названа pphic31. Экспрессия гена 52 осуществлялась в различных условиях. В одном случае клетки штамма E.coli BL2I(DE3) трансформировали плазмидой pphic31, а экспрессию гена 52 индуцировали добавлением ИПТГ, Интересно, что варьирование концентрации ИПТТ от 0,1 до 10 мМ не влияло на уровень экспрессии гена (рис. 28), Во втором случае клетки штамма E.coli XI29, содержащие плазмиду pGPl-2, трансформировали плазмидой pphic31, экспрессию гена 52 индуцировали прогреванием клеток при 42С в течение 10 минут, а затем выращивали клетки при различной температуре. Электрофоретический анализ показал, что в обоих случаях в клетках штамма-продуцента имела место индукция синтеза белка с молекулярной массой, приблизительно соответствовавшей размеру ожидаемого продукта (20,927 кДа). Получение растворимого клеточного экстракта показало, что продуцируемый в больших количествах белок находится в основном в телах включения (рис. 29).
Ген 52 кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности Несмотря на то, что значительная часть продуцируемого ррЫсЗ 1 белка находилась в телах включения, измерение активности киназы в осветленных клеточных экстрактах спектрофотометрическим методом показало, что уровень этого фермента превышает активность клеточных дНМФ-киназ в сотни раз. Таким образом, бьшо показано, что ген 52 бактериофага срСЗІ действительно кодирует дНМФ-киназу. Рекомбинантный фермент проявлял активность на всех четырех канонических дезоксирибонуклеозидмонофосфатах (дАМФ, дТМФ, дГМФ и дЦМФ), оказавшись, таким образом, второй дНМФ-киназой, обладающей столь широкой специфичностью к субстрату. При этом соотношение активностей дНМФ-киназы срСЗІ на разных субстратах отличалось от такового дНМФ-киназы бактериофага Т5 (см. таблицу 5). В частности, активность на дАМФ была ниже почти в два раза по сравнению с активностью фермента Т5; при этом обе киназы наименьшую активность проявляли с дЦМФ. Однако следует помнить, что измерение активности проводилось в стандартных условиях, возможно, не оптимальных для фермента бактериофага фСЗ 1.
Похожие диссертации на Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5(2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена
