Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
2.1. Лейцин-богатьте белки, содержащие LRR-домен 8
2.1.1. Структура и функции LRR-белков 8
2.1.2. Разнообразие LRR-содержащих белков 12
2.2. Развитие сердца млекопитающих 17
2.2.1.Предшествеиники различных сердечных клеточных типов локализованы в эпибласте 17
2.2.2. Паттернизация и детерминация клеток- предшественниц к фенотипу, характерному для кардиомиоцитов
2.2.3. Формирование проводящей системы сердца в развивающемся органе 25
2.2.4. Формирование системы сосудов в сердце 30
2.2.5. Транскрипционная регуляция развития сердца 32
2.2.5.1. Механизмы индукции и основные молекулярные события раннего развития сердца беспозвоночных и позвоночных животных 32
2.2.5.2. Основные траискрипционные факторы сердечного развития 41
2.2.5.3 Транскрипционная регуляция процессов пространственного морфогенеза сердца, паттернизации и формирования дифференцированнтлх регионов в составе сердца
Экспериментальная часть.
3.1. Объекты и методы исследований 54
3.1.1. Объекты исследований 54
3.1.2. Основные методы исследований 54
3.2. Результаты и их обсулсдение 72
3.2.1. Идентификация Сер дина-1 методами компьютерного (In Silico) анализа 72
3.2.2. Экспериментальное подтверждение уникальной экспрессии Сердина-1 в сердце на уровне мРНК 79
3.2.3. Анализ экспрессии Сердина-1 на уровне белка 85
3.2.4. Поиск белкового партнера, взаимодействующего с Сердином-1 93
3.2.5. Идентификация геномных регуляторных областей, отвечающих за. специфичность экспрессии Сердина-1 99
3.2.6. Обсулсдение потенциальной фугасции Сердина-1 в контексте полученных данных 102
IV. Выводы 112
V. Цитированная литература 113
- Разнообразие LRR-содержащих белков
- Формирование проводящей системы сердца в развивающемся органе
- Основные методы исследований
- Анализ экспрессии Сердина-1 на уровне белка
Введение к работе
Сердце - одна из первых структур, возникающих в органогенезе (DeRuiter et al., 1992; Icardo, 1996). Несмотря на то. что к настоящему времени известно большое количество регуляторных и структурных белков, специфично экспрессирутощихся в развивающемся сердце, точные механизмы формирования эмбрионального сердца позвоночных остаются загадочными. Более глубокое проникновение в суть подобных механизмов дифференцировки и органогенеза подразумевает идентификацию и анализ белков, играющих специфическую роль в эмбриональном сердечном развитии. Сложность процесса кардиогенеза отражает высокий процент врожденных дефектов у человека : 5-8 случаев из 10 000 новорожденных (Bower, Ramsey, 1994; Wren, O Sullivan, 2001; McConnell, Elixson, 2002; Трисветова, 2003). Множественные внутриклеточные взаимодействия и морфогенетические стратегии необходимы для полноценного своевременного реформирования примитивного эмбрионального сердца в зрелый четырехкамерный орган (Mably, Liew, 1996; Olson, Shneider, 2003).
Идентификация новых сердечно-специфических белков и выяснение их функции являются необходимым подходом для углубления наших знаний о природе и механизмах эмбрионального кардиогенеза, экспрессии и регуляции определенных генов в течение этого сложного процесса (Small, Kreig, 2004). Наиболее стандартным подходом для идентификации новых генов позвоночных является позиционное клонирование или изоляция по принципу интересующей исследователя гомологии с последующим анализом специфичности экспрессии и обратной генетики (Федоров, 2004). И, хотя позиционное клонирование остается актуальным до сих пор, технологии обратной генетики (генный таргетинг, траисгенные мыши) являются сложными, дорогостоящими и зарезервированы, как правило, для генов с хорошо охарактеризованными функциональными доменами. Необходимо отметить, что в качестве относительно недорогой и производительной альтернативы для поиска и идентификации новых генов несомненно выгодно использование ключевого преимущества доступных компьютерных баз данных, содержащих случайно отсеквеннированные короткие экспрессиругощиеся последовательности (EST) (Маїта et al., 1999).
Все вышесказанное обуславливает развитие разнообразных In Silico (компьютерных) алгоритмов, направленных на идентификацию белков, обладающих заданными свойствами, и расширению количества транскриптомных баз данных, доступных для открытого анализа.
В последние несколько лет исследования в области кардиогенеза были сфокусированы в основном на изучении роли нескольких семейств транскрипционных факторов, вовлеченных в комбинированную регуляцию развития сердца, а также белков, имеющих в своем составе определенные домены или области, охарактеризованные функционально.
Таким образом, логично предположить, что некоторые белки, не имеющие в своем составе охарактеризованных структур, остались неидеитифицированными, хотя их важность для кардиогенеза может быть весьма велика. Именно поэтому разработка методов, позволяющих идентифицировать подобные белки, весьма актуальна. В конкретном случае сердца важность роли белка для процесса кардиогенеза может быть отражена через высокую пространственно-временную специфичность экспрессии, а отсутствие известных к настоящему времени доменов может приводить к характеризации принципиально новых структур, ответственных за неизвестные на сегодняшний день функции. Несмотря на постоянно увеличивающееся количество работ, посвященных вопросам клонирования новых сердечно-специфичных белков, тем или иным способом участвующих в процессах кардиогенеза, вопрос о множественных механизмах, лежащих в основе сердечного развития, остается открытым, что обуславливает высокую актуальность проведенного исследования.
Разнообразие LRR-содержащих белков
Одним из наиболее важных белков в клетке является СНА (class її transactivator), который можно назвать мастер-регулятором транскрипции генов кластера МНСП (Chin et al., 1994; Chang et al., 1994; Steimle et al., 1994). В ряде работ было выяснено, что данный белок демонстрирует комплексное поведение относительно олигомеризации (Linhoff el; al., 2001), ядерно-цитоплазменного транспорта и трансактивации генов МНСП (Reith et al., 2001; Ting et al., 2002), были исследованы механизмы доминантно-негативного регулирования генной активности и ядерно-цитоплазматического транспорта, в котором, как было показано, важную роль играет С-концевой LRR - богатый домен (Hake et al., 2000; Towey et al., 2001; Harton et al., 2002). Мутации в LRR-повторе (в предполагаемой позиции, ответственной за взаимодействие) приводили к полной или частичной блокировке ядерно-цитотшазматического транспорта (Camacho-Carvajal et al., 2000). Однако некоторые мутации приводили к интенсификации трафика цитоплазма-ядро. Интересно, что мутации в области N-конца приводили только к изменению доминантно-негативной способности менять уровень транскрипции: генов, однако совершенно никак не влияли на внутриклеточную локализацию. Такие мутантные белки обнаруживались как в ядре, так и в цитоплазме аналогично ситуации с белком дикого типа. Также было показано, что интеграция LRR совершенно необходима для функционирования СНА в качестве транскрипционного трансактиватора среди обоих типов мутантов. Было определено, что негативные мутации в LRR-повторе являются доминантными над комплексными белками с экзогенно введенными множественными сигналами ядерной локализации. При комплексном рассмотрении результатов становится очевидно, что LRR-богатый домен может регулировать валидиость нескольких сигналов ядерной локализации, входящих в состав белка, и контролирует ядерный импорт и экспорт. При этом способность к олигомбризации не была затронута среди всех групп мутантов. Таким образом, в данной работе в качестве вывода приводится, что взаимодействие LRR с неизвестным белком-партнером может быть необходимым для импорта, в ядро и трансактиваторнои транскрипционной активности (Camacho-Carvajal et al., 2000).
Многочисленные исследования говорят о разнообразии функций LRR-содержащих рецепторов, как, например, участие в развитии нервной системы, формировании гонад и ряде других процессов. Эти рецепторы содержат LRR в экстраклеточной части и, как правило, обладают трансмембранным доменом, либо заякорены на плазматической мембране посредством связи с гликозилфофатидилинозитолом (GPI). Конечно, в отличие от растительных LRR-содержащих киназ (Dievart et al., 2004), животные LRR-белки не обладают цитоплазматическим киназным доменом, однако вместо этого способны траисдуцировать сигнал через активацию ряда рецепторов. Тем не менее, LRR-мотив, обнаруженный в экстраклеточной части этих рецепторов схож в растительных и животных объектах, что говорит о том, что и те, и другие могут использовать одинаковые механизмы активации и связывания лигандов .
Суперсемейство LRR-белков также включает в себя большую группу растительных трансмембранных рецепторов, таких как ТМК1 и рецептороподобиых RLK5 (Tichtinsky et al., 2003), спосбных связывать специфические лиганды. Многие гены устойчивости растений к инфекциям, как например Cf-9 или Ха-21, содержат экстраклеточный LRR-домен (Shiu, Bleecker, 2002). Другие гены растительной устойчивости, куда относятся N-ген табака и RPS2 из Arabidopsis, также относятся к LRR-суперсемейству, однако содержат только цитозольный LRR-домен (Eui et al., 2004). Во взаимодействии растение-патоген структура LRR-мотива может функционировать как специфически связывающая платформа для лигандов собственно растительного происхождения (например индуцированных патогеном) и для элиситоров-производных организма-патогена.
В Drosophila melanogaster обнаружено и охарактеризовано около десяти различных LRR-содержащих белков (Buchanan et al., 1998). В данную группу входят такие молекулы, как трансмембранный рецептор Toll (Hashimoto et al., 1988), белок клеточной адгезии хаоптин (Reinke et al., 1988) и flightlessl, цитоплазматическиЙ белок с актин-связывающим доменом (Campbell et al., 1993). Большинство LRR-содержащих белков дрозофилы играют критическую роль в эмбриональном развитии, и мутации в них вызывают серьезные морфогенетические дефекты. Один из таких белков - LRR47 (Ntwasa et al., 1994; Buchanan et a]., 1998), содержащий восемь лейцин-богатьгх повторов, обладает способностью взаимодействовать с Ras ГТФ-азами и наиболее близок к мышиному rspl, функция которого заключается в подавлении активированных форм ras. Распределение данного белка в организме дрозофилы необычно, так, например, было показано, что транскрипты LRR47 встречаются во время начальных этапов дробления и почти исчезают на стадии формирования бластодермы. Данный белок присутствует как в ядре, так и в цитоплазме до начала гаструляции, после чего наблюдается в основном в ядре на протяжении более поздних стадий развития. Также этот белок был обнаружен как постоянно присутствующий в линии клеток SL2, при этом в клетках он локализуется и в ядре, и в цитоплазме.
С момента первой публикации другого примера в .1994 году - белка LANP (Leucine-rich Acidic Nuclear Protein), было выяснено, что данный белок может выполнять ряд функций и имеет несколько типов внутриклеточной локализации, начиная с плазматической мембраны и заканчивая ядром (Vaesen et al., 1994). LANP имеет модульную архитектуру, отчасти напоминая головастика, голова (N-конец) которого образована доменом, состоящим из пяти лейцин-богатых повторов, а хвост (С-конец) состоит преимущественно из отрицательно заряженных аминокислот (Matsuoka et. al, 1994). Таким образом, LANP также принадлежит к большой группе LRR-содержащих белков, где лейцин-богатые повторы служат для белок-белкового узнавания и взаимодействия.
Формирование проводящей системы сердца в развивающемся органе
Первичная сердечная трубка формируется в ходе слияния двух сердечных примордиев, которые возникают из вентральной спланхномезодермы. Эти парные примордии сливаются начиная спереди и формируя таким образом примитивные тубуляриые сегменты (De la Cruz et al., 1989). Каждый сегмент состоит из внутреннего эндотелия, окруженного наружным миокардиальным листком. Между этими двумя слоями присутствует сложная прослойка внеклеточного матрикса. Сегменты трубки демаркированы конструкциями и различаются по сократительной способности, экспрессии актина и специфичных миозинов (Kubalak et al., 1994; O Brien et al., 1993), а также компонентов матрикса (MjaatvedtetaL, 1991).
Формирование эндокардиальной подушки происходит на последующей стадии развития сердечной трубки, главным образом в двух сегментах (из пяти): атрио-вентрикулярном и конусно-стволовом. Эндокардиальный и миокардиалъиый эпителий, присутствующий в этих областях, включает субпопуляции клеток, которые функционально различаются по их способности формировать ткань подушки. Популяция клеток, компетентных для формирования эндокардиальной подушки, происходит из уникальной линии клеток эндокарда, найденной также и в других отделах сердечной трубки (Wunsch et al., 1994). Незадолго до начала формирования эндокардиальной подушки, одиночная сердечная трубка начинает процесс петлеобразования или выпетливания (looping). Выпетливание начинается с изгиба в районе соединения примитивного правого и левого желудочков, что функционально делит сердечную трубку на входящий (inlet) и исходящий (outlet) сегменты. Направление выпетливания определяется работой специальных генов «латеральности» (laterality genes), таких как inv/iv (Brueckner et al., 1989), «левосторонних» генов (lefty genes) (Meno et al., 1996), sonic hedgehog, а также активина и активин-подобных лигандов, способных узнаваться Actlla рецептором (Levin et al., 1995; Levin et al., 1997).
На заключительных стадиях выпетливания входящий и исходящий сегменты сердечной трубки оказываются рядом благодаря процессу «морфогенетических сдвигов» (morphogenetic shifts), что приводит к сближению пяти септ в правильном выравнивании и образованию нормального четырехкамерного сердца. Очень важно отметить, что ни один из сегментов примитивной сердечной трубки сам по себе не дает независимого начала той или иной самостоятельной камере будущего сердца. Определенные камеры и отделы сердца формируются благодаря комплексной интеграции и ремоделингу примитивных сегментов (Mjaavedt et al, 1998). Механизмы развития, благодаря которым формируется эндокардиалъная подушка и появляются предпосылки к морфогенетическим сдвигам, будут обсуждаться в дальнейшем. Эндокардиальная подушка может быть разделена на ттролиферативную и дифференциаторную зоны. Пролиферативная зона являет собой область мезенхимы, расположенной дистально относительно листка миокарда и находящейся непосредствеш-то под внутренним краем эндокардиальной подушки, все сильнее вдающейся внуть сердечной камеры. Было показано, что клетки мезенхимы, принадлежащие пролиферативной зоне, экспрессирутот многие маркеры клеточной пролиферации, такие как FGF, Msxl, Prxl и Id. Зона диффереицировки расположена более проксимально к листку миокарда, то есть находится непосредственно между зоной пролиферации и собственно миокардом. Мезенхима в этом районе значительно менее пролиферативна и не экспресспрует Msxl и Id, зато наблюдается экспрессия гена Meoxl и гена Prxl, для которого известна способность изменять локальные свойства внеклеточного матрикса и облегчать инвазию эндокардиальной подушки в области внутреннего изгиба сердечной трубки. И, хотя матрикс подушки сильно населен клетками мезенхимы на протяжении всего внутреннего изгиба на стадии 12 DPC в мышиных эмбрионах, миокардиализация этой популяции клеток не наступает, пока не происходит достижение определенного временного порога. Таким образом, можно сделать предположение, что дифференцировка подушечной мезенхимы не менее валена, чем инициация ее образования. Стимуляция экспрессии нового набора генов Б «дифференцированных» клетках мезенхимы подушки может вызывать активную инвазию миокардиальньгх клеток.
Таким образом, эндокардиальная подушка имеет несколько важных функций, таких как формирование право-левосторонней асимметрии, формирование примитивных листков клапанов и индукция миокардиализации сердечной трубки.
Формирование и дифференцировка эндокардиальной подушки, а также процессы выпетливания сердечной трубки являются центральными событиями, необходимыми для реорганизации примитивного сердца и формирования сложного четырехкамерного органа. Оба эти события регулируются благодаря сложной экспрессии сегментно-распределенных генов вдоль передне-задней оси сердечной трубки.
Зрелые листки атрио-вентрикулярного клапана у млекопитающих состоят главным образом из равных частей клеток мезенхимы (фибробластоподобных клеток) и сердечной (непосредственно миокардиальнои) ткани. Предыдущие работы показали, что развитие и интеграция этих двух тканевых типов зависит от процесса нормального созревания эндокардиальной подушки (Bouchey et al., 1996; Lamers et al, 1995; Wunsch et al., 1994). Мезенхима из атриовентршсулярнои подушки распространяется внутрь полости желудочка вдоль внутреннего изгиба по направлению к предсердию в плоскости ассоциированной с прямой атриальной перегородкой. На этой стадии уже начинает появляться соединение листков будущего клапана с палпилярнои мускулатурой желудочка. В итоге, образование клапанов сердца является результатом процесса септирования - формирования примитивных перегородок между эмбриональными камерами.
В области пролиферирующей подушечной мезенхимы распределение клапанных фибробластов коррелирует с экспрессией определенных факторов роста и транскрипционных регуляторов. Распространение многих морфогенов и факторов роста совпадает с пролиферативной зоной эндокардиальной подушки, включающей экспрессирующихся представителей группы факторов роста фибробластов, таких как FGF-3, FGF-2 и FGF-4 (Choy et al., 1996), представителей инсулинового семейства факторов роста IGF-1, 1GF-2 и 1GF-ассоциировэнный ген HI 9, также здесь следует упомянуть такие белки; как desert hedgehog и ВМР-2 (Bitgood, McMahon, 1995). Гомеобокс-содержащие гены (Argao et al., 1995) и некоторые другие транскрипционные факторы также экспрессируются в пролиферативной зоне подушки, сюда входят Msx-1 (Chan Thomas et al., 1993), Prxl и Prx2 (Leussink et al., 1995), Sox4 (Schilham et al., 1996), NF-ATc (Park et al, 1996).
Основные методы исследований
GATA-6 также требуется для выживания ранних эмбрионов, однако конкретная роль этого белка в кардиогенезе в настоящее время продолжает активно изучаться. В противоположность этому, GATA-5 не является необходимым фактором в сердечном развитии. GATA-4 -/- нокаутиые мыши демонстрируют летальный фенотип (Molkentin et al., 1997). Эмбрионы погибают на стадии между ES.5 и ЕЮ.5, обнаруживая при этом острые дефекты в области общего развития эмбриона и нарушенный сердечный морфогенез. Инициаторная стадия кардиогєнеза (спецификация прекардиомиоцитов) в GATA-Y- эмбрионах протекает нормально, однако вторая стадия проходит с явными нарушениями: детерминированные прекардиомиоциты оказываются неспособными мигрировать к вентральной средней линии эмбриона чтобы сформировать там сердечную трубку. Мыши, гомозиготные по GATA-4 нулевому аллелю продуцируют кардиомиоциты, но являются эмбриональными деталями, так как кардиальные клеточные поля не сливаются, чтобы сформировать первичную сердечную трубку, развитие энтодермы в таких мышах тоже существенно нарушено. Данный исход может являться результатом общего нарушения вентрального морфогенеза. Таким образом, можно сделать вывод, что GATA-4 не является необходимым фактором для спецификации прекардиомиоцитов, однако вьтодняет ключевую роль во время миграции детермш-шрованных клеток-предшественников из области передней дорсальной мезодермы в каудально-вентральный регион для правильного формирования будущего сердца (Molkentin et al., 1997).
Сходный фенотип получен у эмбрионов кур, у которых экспрессия GATA-4, GATA-5 или GATA-6 специфически подавлялась с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Ингибирование экспрессии GATA-4 в мышиных эмбриональньтх стволовых клетках линии Р19 или эктопическая экспрессия геш GATA-4, -5 или -6 у эмбрионов Xenopus вызывали снижение (в первом случае) или повышение количества кардиомиоцитов и влияли на транскрипцию сердечно-специфичных генов.
Предварительный анализ развития мышей, несущих нулевую мутацию по GATA-6 (GATA-6-V), показал летальность иа стадии гаструляции, наступающую раньше стадии Е7.5, что делает анализ кардиоваскулярного фенотипа затрудненным (Zhao et аЦ 2005).
eHAND и dl-IAND. Представители суперсемейства bHLH-транскрипционных факторов регулируют развитие сердечной и скелетной мускулатуры (Olson, Klein, 1994; Weintraub, 1993), нейронов (Lee at al., 1995) и гематопоэтических клеток (Zhuang et al., 1994; Shivdasani et al., 1995). HLH-мотив опосредует димеризацию, которая способствует формированию двусоставного ДНК-связывающего домена, способного узнавать Е-Ъох консенсусную последовательность CATslNTG в регуляторных областях ДНК генов-мишеней (Ни et al., 1992).
Анализ регуляторных областей некоторых структурных сердечно-специфичных генов с использованием трансгенных моделей представил молекулярные доказательства посегментной регуляции развивающегося сердца (Li et al., 1996; Ross et al., 1996). Эти совокупные данные соответствуют модели, согласно которой уникальные регуляторные пути контролируют и направляют индивидуальное развитие каждой камеры формирующегося сердца (Franco et al., 1997). Открытие HLH-траскригщионных факторов eHAND и dHAND позволило изучить роль основных транскрипционных регуляторов, построенных по принципу спираль-виток-спираль, в развитии дифференцированных сегментов сердца.
В противоположность равномерной сердечной экспрессии в куриных эмбрионах, экспрессия этих двух белков в развивающихся мышах является более чётко обозначенной. Оба гена начинают экспрессироваться в лрекардиальной мезодерме, затем dHAND продолжает экспрессироваться в линейной сердечной трубке, однако чуть позднее остается только в сегменте, формирующем в процессе выпетливания отдел правого желудочка (Snvastava et al., 1995, 1997). Экспрессия eHAND ограничена исключительно передним и задним сегментами сердечной трубки, которые впоследствии дают начало конусу аорты и левому желудочку соответственно. Такой прерванный передне-задний паттерн экспрессии поддерживается до стадии выпетливания, когда он переходит в выраженную лево-правостороннюю асимметрию с дифференциальной экспрессией базального транскрипционного фактора eHAND в левом желудочке (Biben, Harvey, 1997). Пространственно различная экспрессия eHAND и dHAND делает эти гены кандидатами, потенциально контролирующими сегментарное развитие сердечной трубки. Так, например, поднимаются вопросы о том, что эти два фактора вовлечены в спецификацито будущих камер сердца и в определение направления выпетливания примитивной сердечной трубки (Lowe et аІ., 1996; Levin, 1997).
Эксперименты по разрушению мРНК eHAND и dHAND в совокупности приводили к остановке сердечного развития и летальному исходу сразу после завершения стадии вьтетливания развивающегося сердца (Snvastava et al., 1995).
Значительный объем информации о роли HAND-генов был получен в результате анализа нокаутных моделей. Гетерозиготные eHAND+/-мыши доживали до репродуктивного возраста, тогда как гомозиготы eHAND-/- погибали на стадии ЕЮ.5 (эмбриональный день 10.5) от сердечной недостаточности (Snvastava et al., 1997). Гомозиготные нокаутные dHAND-/- эмбрионы начинали процесс выпетливания сердечной трубки, однако в последствии оказывались неспособными формировать сегмент будущего правого желудочка, что по смыслу совпадает с данными об особенностях экспрессии гена dHAND.
Анализ экспрессии Сердина-1 на уровне белка
Именно секвенирование больших объемов кДНК последовательностей в виде кДНК библиотек различных организмов и даже целых геномов, измеряемых миллионами пар нуклеотидов, поставило перед исследователями задачу определения функционального значения полученной генетической информации. Для этого были созданы базы данных по структуре обширных библиотек EST высших организмов и открытых рамок считывания (ORF) в полностью отсеквет-гарованных геномах. Именно это направление и получило название функциональной геномики.
Одним из методов высокопродуктивного и информативного исследования структуры транскриптов и их дифференциального пространственно-временного распределения является метод EST, который в значительной степени использовался в биоинформатическои части настоящей работы. Определим, что же такое, собственно, ESTs (Expressed Sequence Tags). Обычно это короткие (около 300-500 пар нуклеотидов), прочитанные за один раз (single-pass reads) фрагменты кДНК. Они представляют собой «слепок», «отпечаток» (snapshot) с продуктов гена, экспрессированных в определенной ткани или на определенной стадии развития, являясь метками (tags, тагами) экспрессии гена внутри определенной библиотеки кДНК. Принципы метода EST позволяют проводить анализ совокупности прочитанных фрагментов, ассоциированных с каким-либо геном, реконструировать структуру транскриптов гена, а после сравнения ее со структурой геномного района -структуру самого гена.. В пределах определенным образом приготовленной библиотеки кДНК частотное распределение клонов в целом соответствует исходному распределению транскриптов в популяции мРНК, из которой приготовлена библиотека. Данный принцип был предложен в статье Adams et al., .1991. Количественное приложение разработано в статье Okubo et al., 1992.
Одним из инструментов, помогающим определить функцию генов, является дифференциальное исследование генной экспрессии. Определяя, какие гены экспрессируются, а какие репрессируются в данной ситуации, можно определить их функциональное значение. Для этого была создана система UniGene - база данных, сформированная путем автоматического разделения EST последовательностей на кластеры, состоящие из гомологичных последовательностей. Каждый кластер в UniGene содержит последовательности, которые представляют как уникальный ген, так и связанную с ним информацию, такую как тип ткани, в которой был обнаружен отдельный транскрипт, и его расположение в геноме.
Кластеры, соответствующие генам с высоким уровнем экспрессии, содержат множество EST последовательностей, тем самым эта коллекция может служить для оценки уровня экспрессии одного гена в разных тканях. В кластеры UniGene попадают не все EST последовательности, например, туда не входят последовательности с низким процентом гомологии. Следовательно, большинство последовательностей, не попавших в UniGene, не являются биологически значимыми за. редким исключением. Такое исключение могут составлять альтернативные транскрипты или продукты хромосомных транслокаций, которые имеют протяженные участки гомологии, но не удовлетворяют условиям формирования кластера.
На стадии планирования эксперимента было сделано важное предположение, что несколько сердечно-специфических белков, играющих важную роль в сердечном морфогенезе, могут быть обнаружены по причине отсутствия в них функционального мотива, которым исследователи могли бы воспользоваться в большинстве экспериментов ПО скринированию баз данных. Поэтому в данной работе приоритеты отбора клонов сконцентрировались на. специфичности сердечной экспрессии и только потом уже на наличии известных функциональных доменов.
Для идентификации белков с выраженной специфичной сердечной экспрессией была произведена процедура In Silico скрининга EST-содержащих баз данных системы UniGene. В частности, для первичного отбора клонов . была проанализирована библиотеку кДНК из эмбрионального сердца NCBI dbEST Libraiy ГО.5466 (RIKEN full-length enriched 13-day embiyo heart libraiy), содержащую 8308 независимых клонов (Bogy iM.S:J.pjHi.LM .Xol sv.CM,; 1993). Технически эксперимент выглядел как сращивание от 3 до 7 тагов в единую последовательность (в зависимости от их индивидуальной длины) с последующим поиском последовательностей по гомологии среди всех находящихся в открытом доступе мышиных EST-coдержащих библиотек (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/lbrowse2.cgi?TAXLD=10090). Данная стадия исследования проводилась с использованием программы BLAST, размещенной в открытом доступе на сайте NCBI ШЩ}ЖУ1У1)!;(Л}ЙАМй:В9УІЗ АБТ0- В результате такого скрининга можно получать информацию о профиле экспрессии каждого тага, встречающегося в главной библиотеке из эмбрионального сердца dbEST Libraiy ID. 5466 (рис. 1). В ходе первой части процедуры сегрегации подвергались EST кДНК-таги, встречающиеся только в данной библиотеке и других, исключительно сердечных библиотеках. Также в первичный лист было включено несколько последовательностей с преимущественно сердечной экспрессией, которые впоследствии отсеялись на последующих этапах отбора. Последовательности, демонстрирующие экспрессию не только в сердце, но и в других тканях и органах, не проходили в дальнейшие стадии эксперимента (рис. 2).
Похожие диссертации на Идентификация, клонирование и биохимическая характеристика нового сердечно-специфического белка Сердина-1
