Введение к работе
Актуальность проблемы.
Важную роль в осуществлении иммунного ответа организма играют цитокины -белковые факторы, продуцируемые в основном лимфоцитами и другими клетками иммунной системы. Цитокины составляют особый класс секреторных белков, которые действуют через рецептор-опосредованные пути и регулируют различные межклеточные взаимодействия, вызывая гуморальный ответ как иммунных, так и тканевых клеток организма. Ціггокиньї, таким образом, вызывают широчайший спектр клеточных ответов: активацию, пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов и других клеток крови, направленную миграцию клеток-эффекторов, активизацию процессов программируемой клеточной гибели и т.п. Изучение как самих цигокинов, так и всего многообразия опосредованных ими клеточных ответов имеет традиционно важное значение для развития новейших методов иммунотерапии онкологических заболеваний.
Последние исследования в данной области показали, что наряду с лимфоцитами и другими иммунными клетками важную роль в проведении сигналов и осуществлении как противовоспалительных, так и противоопухолевых функций играют клетки крови, основные "задачи" которых напрямую не связаны с модуляцией иммунных ответов организма. К таким клеткам относятся, например, тромбоциты, основными функциями которых являются, как известно, адгезивно-аггрегационная и абсорбционно-транспортная способности. Наряду с этими функциями тромбоциты, как было показано (Ibele et al., 1985), осуществляют активное участие в процессах цитолиза различных опухолевых клеток.
В ряде последних работ показано, что тромбоциты проявляют IgG-, lgE-опосредованную цитотоксичность как в отношении паразитических одноклеточных
микроорганизмов (Joseph et a!., 1983; Yong et al., 1991), так и в отношении эндотелиальных клеток (Jorgensen et al., 1970; Kishi et al., 1972) и эритроцитов (Okada et al., 1993). Лизис опухолевых клеток-мишеней тромбоцитами может быть опосредован, также, белками комплемента (Slezak et al., 1987). Как активированные, так и неактивированные тромбоциты способны эффективно лизировать различные линии опухолевых клеток в отсутствии специфических антител и белков комплемента (Быковская и др., 1988; Sagawa et al., 1993). Таким образом, тромбоциты можно рассматривать в качестве полноценных эффекторных клеток иммунной системы. Хотя эти кровяные тельца довольно малы по сравнению с лимфоцитами и макрофагами и, кроме того, не обладают ядром, по общему количеству и общей площади поверхности клеточных мембран находящиеся в кровяном русле организма тромбоциты значительно превосходят как лимфоциты, так и любые другие "классические" клетки-эффекторы иммунной системы. Таким образом, роль тромбоцитов в активизации защитных процессов организма на клеточном уровне заслуживает пристального внимания.
Электронно-микроскопические исследования показали, что характер морфологических изменений тромбоцита (изменение формы клеточной мембраны после образования фокального межклеточного контакта, гипертрофия аппарата Гольджи, укрупнение секреторных гранул и скопление их в зоне контакта) при его взаимодействии с клеткой-мишенью, предшествующих гибели последней, очень похожи на аналогичные морфологические реакции лимфоцитов (Bykovskaya et al., 1991). Кроме того, активация тромбоцитов может быть опосредована оккупацией специфических мембранных рецепторов, идентичных VLA-2, VLA-5 и CD69 активационным рецепторам Т-лимфоцитов (Testi et al., 1990). По характеру поверхностной экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости, тромбоциты близки к полиморфно-ядерным лейкоцитам и моноцитам (Ломакин, 1990). Киллинг опухолевых клеток, опосредованный
тромбоцитами, по некоторым данным (Okada et al., 1996) может происходить посредством выделения в зону межклеточного контакта окиси азота, впервые охарактеризованной как эффекторный агент, продуцируемый макрофагами (Hibbs et al., 1988).
Все вышеперечисленные факты дают основание предполагать существование секретируемьгх тромбоцитами белковых факторов, способных оказывать прямое цитолитическое воздействие на опухолевые клетки, а также белковых медиаторов, участвующих в активации других эффекторных клеток. В целом, можно полагать, что механизмы противоопухолевой активности тромбоцитов и других эффекторных клеток иммунной системы (лимфоцитов, макрофагов, моноцитов и др.) имеют много общего.
Цель работы.
Основной целью данной работы являлось изучение механизмов стимуляции тромбоцитов различными экзогенными агентами (Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином) и последующее выделение из полученного клеточного материала белковых медиаторов, способных оказывать прямое цитолитическое воздействие на опухолевые клетки, либо активирующих мононуклеарные клетки периферической крови.
В ходе исследования предполагалось решение следующих задач:
-
Изучение цитотоксической активности очищенных тромбоцитов человека против клеток линии К 562 после стимуляции первых различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА в наномольных концентрациях и рицином в пикомольных концентрациях, а также определение наличия апоптотической гибели клеток-мишеней.
-
Определение возможной активации очищенных тромбоцитов человека по циклооксигеназному пути при стимуляции различными экзогенными агентами: Са-
ионофором А23187, ФАТ, ФГА в наномольных концентрациях и рицином в пикомольных концентрациях.
-
Получение и исследование лизатов и супернатантов очищенных тромбоцитов человека, активированных различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином.
-
Выделение цитотоксическнх белковьк факторов из полученных лизатов и супернатантов, определение их N-концевых аминокислотных последовательностей и изучение опосредованного ими механизма гибели клеток-мишеней.
-
Выделение из полученных супернатантов белковых медиаторов, активирующих мононуклеарные клетки периферической крови, определение их N-концевых аминокислотных последовательностей и изучение механизмов воздействия.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В настоящей работе на примере клеток линии К562 было показано, что противоопухолевая цитотоксичность тромбоцитов человека может быть эффективно стимулирована различными экзогенными агентами: Са-ионофором A23I87, ФАТ, ФГА и рицином в наномольных и пикомольных концентрациях. При этом стимуляция цитотоксичности сопровождается активацией тромбоцитов по классическому циклооксигеназному пути. При этом, стимулированные всеми вышеперечисленными экзогенными агентами тромбоциты человека не опосредуют апоптоз клеток-мишеней.
Также, было показано, что стимулированные всеми вышеперечисленными экзогенными агентами тромбоциты человека накапливают и секретируют в межклеточное пространство специфические медиаторы белковой природы (цитотоксические тромбоцитарные факторы) ЦТФ-14 и ЦТФ-28. Данные медиаторы, однако, не способны вызывать апоптоз клеток-мишеней.
Вышеупомянутые цнтотоксическне тромбоцитарные факторы были выделены и их активность в разных концентрациях против клеток К 562 была изучена. Впервые определена N-концевая аминокислотная последовательность цитотоксического белка тромбоцитов массой 28 кДа.
Из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором А23187 был выделен ранее не описанный белок массой 14 кДа, способный усиливать пролиферативный ответ мононуклеарных клеток периферической крови человека на стимуляцию конканавалином А. Была определена N-концевая аминокислотная последовательность данного белкового фактора.
Апробация работы.
Результаты данной работы были представлены на межлабораторном научном семинаре Лаборатории спектрального анализа Института Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и Лаборатории клеточного иммунитета НИИ Клинической Онкологии Российского Онкологического Научного Центра РАМН, а также на V Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство".
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем диссертации.
