Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Серологические и молекулярные методы типирования тромбоцитспецифических антигенов системы HP а человека 9
1.1.1. Иммуносерологические методы 10
1.1.2. Методы, основанные на ДНК-диагностике 12
1.2. Иммуногенетика антигенов тромбоцитов человека 21
1.2.1. Параметры иммуногенетики 21
1.2.2. Особенности распределетт антигенов среди представителей различных рас и этнических групп 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы 29
2.1. Материалы исследования 29
2.2. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров 29
2.3. Статистическая обработка данных 32
ГЛАВА 3. Результаты 38
3.1. Полимеразная цепная реакция с использованием модифицированных сиквенс-специфических праймеров 38
3.2 Параметры тромъощгг-специфических антигенов у кадровых доноров крови г. москвы и у представителей армянской и хакасской национальностей 39
3.2.1. Иммуногенетические параметры HP А у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы 40
3.2.2. Частоты аллелей и генотипов HP А среди представителей армянской национальности 50
3.2.3. Частоты аллелей и генотипов среди представителей хакасской национальности 51
3.2.4. Сравнение частоты аллелей и генотипов HP А в обследованных выборках разных этнических групп. 52
3.3. Частота аллелей генов тромбоцитспецифических антигенов среди жителей россии как основа формирования контингента типированных доноров 55
ГЛАВА 4. Заключение ..60
4.1. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфическихпраймеров 60
4.2. Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у жителей России 61
4.3. Частота аллелей и генотипов hp а в выборках из некоторых этнических групп 63
Выводы. 64
Список по теме диссертации 65
Литература 66
- Иммуносерологические методы
- Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров
- Иммуногенетические параметры HP А у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы
- Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у жителей России
Введение к работе
Антигены тромбоцитов человека (HPА) включают 16 известных на сегодняшний день биаллельных систем [Ouwehand W. et al, 2000]. Каждый аллоантиген, как было показано, является результатом изменения единичного нуклеотида в последовательности ДНК, приводящего к замене аминокислоты на белковом уровне. Это приводит к изменению третичной структуры мембранных гликопротеинов и, соответственно, возникновению разных эпитопов - мишеней для трансфузионной аллоиммунизации [Norton A. et al., 2004]. Кроме HP А на тромбоцитах локализуются антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). По некоторым данным трансфузия концентратов тромбоцитов без примеси лейкоцитов не вызывает первичную аллоиммунизацию к HLA [Novotay V.M.J, et al, 1995]. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов может вызывать пост-трансфузионную пурпуру и рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов, кроме того, при беременности аллоиммунизация может быть причиной тромбоцитопении новорожденного [Waters А.Н. et al, 1992, Murphy M.F. et al., 1999, Kekomaki S. et al, 1998]. Необходимым компонентом диагностики и последующего лечения пациентов с этими синдромами является возможность быстрого и точного типирования антигенов тромбоцитов. Традиционно, при определении фенотипа тромбоцитов используют аллоиммунную сыворотку человека, однако, не ко всем антигенам системы HP А получены антитела [Simsek S. et al, 1994]. Кроме того, в случаях заболеваний системы крови низкий уровень тромбоцитов у значительной части пациентов ограничивает возможность серологического типирования тромбоцитов.
В последнее время для типирования НРА применяют методы, основанные на ДНК-диагностике, такие как полимеразная цепная реакция с последующей рестрикцией полиморфных фрагментов (PCR-RFLP) и секвенйрование ДНК [Newmen P.J. et al., 1994]. Эти методы достаточно сложны и дорогостоящи. В отличие от них новый подход с использованием в полимеразной цепной реакции сиквенс-специфичных праймеров представляет собой технически простой и экономичный метод генотипирования HP А. Эффективная амплификация возможна только тогда, когда З'коыец праймера комплементарен последовательности сайта аллелъной вариации. Используя серию праймеров, каждый из которых специфично амшшфицирует только один аллель HP А, можно сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующих антигенов.
Частоты аллоантигенов тромбоцитов человека различаются между расами и этническими группами. Недавние популяционные исследования показали существенные различия в распределении НРА у представителей европеоидной [Sirnsek S. et al., 1993, Kekomaki S. et al.,1995, Kim H. et al., 1995, Covas D. Et al., 1997, Drzewek K. Et al., 1998] и монголоидной рас [Seo D. et al., 1998, Chang Y.et al., 1998, Chiba A. et al., 2000]. Получены данные о встречаемости НРА-генов в выборках жителей России [Зотиков Б.А. и др., 2003, Головкина Л. Л. и др., 2004, Golovkina L. et al., 2004]. Изучение частоты аллелей НРА позволяет сделать вывод о перемещении генов и получить важную иммуногенетическую характеристику популяции. Практическое значение генотипирования НРА в первую очередь проявляется в трансфузиологии, поскольку лица белой расы с выраженным полиморфизмом генов НРА-1, -2, -5 являются «реактивными» донорами для реципиентов монголоидной расы, для которой полиморфизм указанных генов не характерен.
Генотипирование антигенов тромбоцитов человека методом полимеразной цепной реакции позволит проводить трансфузии тромбоцитов с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ.
На основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфичных праимеров разработать тест-систему для изучения распределения пяти клинически важных антигенов тромбоцитов (HPА 1-5) у кадровых доноров компонентов крови.
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Оптимизация тест-системы на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праимеров; сравнение результатов генотипирования, полученных с помощью модифицированной нами тест-системы и тест-системы фирмы «PROTRANS».
Использование модифицированной тест-системы для генотипирования кадровых доноров компонентов крови по системе HP А.
Изучение иммуногенетических параметров НРА у кадровых доноров компонентов крови и представителей некоторых этнических групп России.
Вычисление величины контингента НРА-типированных доноров, необходимого для обеспечения НРА-совместимых трансфузий.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.
Разработана модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реаіщии с использованием сиквенс-специфических праимеров для генотипирования антигенов тромбоцитов человека. Впервые в России рассчитаны все иммуногенетические параметры НРА у кадровых доноров компонентов крови, а также получены ориентировочные данные о распределении частот аллелей и генотипов в двух генетически отдаленных этнических группах (армяне и хакасы). Предложен подход к формированию контингента НРА-типированных доноров в России.
ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ.
Предложенная в работе модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реакции рекомендуется к использованию для генотипирования антигенов тромбоцитов доноров и реципиентов с целью предотвращения посттрансфузионных осложнений и создания контингента типированных по НРА кадровых доноров компонентов крови.
ПУБЛИКАЦИИ.
По материалам диссертации опубликованы 4 работы. Результаты диссертации доложены на 19-й Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Стамбул, 2005г.) и на 28-й конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2005г.).
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.
Диссертация изложена на 74 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 8 рисунков, 3 диаграммы и 14 таблиц.
Иммуносерологические методы
Аллоантигены тромбоцитов человека включают несколько биаллельных систем, которые являются результатом изменения единичного нуклеотида в кодирующем регионе мембранных гликопротеинов тромбоцитов. Эти замены приводят к появлению различных эпитопов - мишеней для трансфузионной аллоиммунизации - в гликопротеидных комплексах, таких как: GPIa/IIa, GPIIb/ІПа и GPIb/V/ГХ. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов может вызывать пост-трансфузионную пурпуру и рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов при переливании крови и ее компонентов. Кроме того, аллоиммунизация может быть причиной тромбоцитопении новорожденных [dem Borne et al., 1990; Mueller et al., 1994; Santoso et al., 1998]. Необходимым компонентом диагностики и последующего лечения пациентов с этими синдромами является возможность быстрого и точного типирования антигенов тромбоцитов, создание регистра НРА-типированных доноров компонентов крови [Bussel et al., 1997; Kroll et al., 1998; Porcelijn et al., 1998; Rozman et al.,2002]. Методы типирования антигенов тромбоцитов, использующиеся в настоящее время, можно разделить на две группы. В первую группу входят методы, основанные на выявлении взаимодействия антигенов тромбоцитов и антител, направленных против них: иммунофлуоресцентный тест, различные иммунохимичесісие методы (ELISA), радиоиммунный анализ, метод иммобилизации антигенов на моноклональных антителах (МАЕРА) и твердофазный метод. Во вторую группу входят методы, основанные на ДІПС-диагностике: полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров (PCR-SSP), полимеразная цепная реакция с последующей рестрикцией полиморфных фрагментов (PCR-RFLP), полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических олигонуклеотидов (PCR-SSO), конкурентная гибридизация (PHFA), полимеразная цепная реакция в реальном времени (realime PCR) и секвенирование ДНК [Kroll Н. et al., 1998].
Иммунофлуоресцентный метод, предложенный А.Е. von dem Borne с соавторами [Von dem Borne А.Е. et al, 1978], дает возможность оценить результаты только специфической реакции, так как визуализируется свечение целых тромбоцитов и исключается свечение их фрагментов. К положительным качествам этого метода следует также отнести возможность параллельной идентификации находящихся на тромбоцитах антител класса IgG, IgM, IgA. Чувствительность метода имеет количественные ограничения, поскольку для получения положительной реакции на поверхности тромбоцита должно фиксироваться, по крайней мере, 1000 молекул IgG [Tijhuis GJ. et al., 1991].
Характерной особенностью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) является иммобилизация на твердом носителе одного из участников реакции антиген-антитело, что позволяет простой промывкой избавиться от балластных, не вошедших в иммунный комплекс антигенов [Allen D.L. etal., 1999].
Модифицированный иммуноферментный метод дает возможность освободиться от HLA антигенов на тромбоцитах, так как кислая среда разрушает их. После этого все реакции становятся обусловленными тромбоцитспецифическими антигенами [Красникова Н.А. и др., 2000]. Лимфоцитотоксический тест применяется с целью выявления лимфоцитотоксических антител в сыворотках [Cael В. et al., 2000]. При заключении о характере антител принимаются во внимание данные последовательного сіфининга сывороток в ЛИТ, ИФА с пулом и нативных, и модифицировшшых тромбоцитов, а также с тромбоцитами отдельных доноров. Необходимо учитывать анамнестические данные, количество тромбоцитов на день исследования, наличие предшествующих трансфузий и/или беременностей, применение гормонотерапии, наличие в сыворотке циркулирующих иммунных комплексов, сведения о специфической лекарственной терапии. Явный недостаток метода -поливариантные шумовые эффекты.
Часто используют методы фиксации антигенов после разрушения питоскелета тромбоцитов, в частности, метод иммобилизации тромбоцитарных антигенов на моноклональных специфических антителах (МАГРА) [Kiefel V. ct al., 1987, Morel-Kopp M.C. et aL, 1996]. Этот метод имеет преимущество и перспективы развития, так как позволяет объективно определить по степени окраски гликопротеиды с направленными против них антителами. К недостаткам метода можно отнести отсутствие моноклональных антител ко всем гликопротеидам тромбоцитов человека, а также дороговизну моноклональных и меченых вторых антител.
I.Cordiano с соавторами преложили метод выявления антитромбоцитарных антител с использованием иммобилизации на стрептавидине меченных биотипом тромбоцитарных гликопротеидов [Cordiano I. et aL, 1995]. После прикрепления тромбоцитов на твердую фазу тест проводят далее либо как при обычном иммуноферментном анализе, либо выполняют лизис цитоскелета, как при МАГРА. В обоих случаях связанные антитела определяют с помощью антииммуноглобулина к IgG человека, конъюгированного с алкалин-фосфатазой. Чувствительность этого метода, по утверждению авторов, сопоставима с чувствительностью МАГРА.
Смешанный метод прилипания эритроцитов (твердофазный метод) основан на фиксации тромбоцитов на лунках микропланшетов, покрытых антитромбоцитарными антителами, с последующей инкубацией их с исследуемыми сыворотками и отмыванием. Затем добавляются эритроциты, покрытые анти-IgG антителами. Если произошла сенсибилизация тромбоцитов антителами, то эритроциты покрывают тромбоциты монослоем, иначе индикаторные клетки будут сбиваться на дне в центре лунки. Описана модификация этого метода с использованием раствора с низкой ионной силой при сенсибилизации тромбоцитов [Rachel I et al., 1985].
Радиоиммунный метод предназначен для измерения тромбоцит-ассоциированных иммуноглобулинов: после инкубации отмытых от плазмы тромбоцитов с IgG антииммуноглобулином, меченным 1251, определяют радиоактивность осадка тромбоцитов на счетчике гамма-излучения. Количество связанных антител, меченных 1251, выражают в нанограммах на 106 тромбоцитов (Кузнецов А.И. и др., 1991). Неспецифические результаты могут быть обусловлены присутствием фрагментов тромбоцитов в суспензии кровяных пластинок.
Недостатком перечисленных выше иммунохимических методов является отсутствие антител ко всем гликопротеинам тромбоцитов. Кроме того, низкий уровень тромбоцитов у значительной части больных является лимитирующим фактором для серологического типирования тромбоцитов.
Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров
В Испании повышена частота аллельного гена HP A-lb (36,4%) по сравнению со средним значением для европейской популяции [Corral et al., 1997]. Более того, в пределах одной страны население разных районов может различаться по полиморфизму генов и антигенов HP А. Так, на севере Франции частота антигенов HP A-lb составляют 2%, НРА-2Ь - 0,6%, НРА-5Ь - 2%, что значительно ниже, чем в других странах Европы и Северной Америки [Merieux Y. et al., 1997]. В то же время на юге Франции и в Провансе - частота встречаемости НРА-1 а (97%), НРА-За (88,1%) сходна со средним показателем для европейских стран, но отличается от частоты среди представителей белой расы Восточной и Южной Америки. В то же время этот регион Франции характеризуется и своими особенностями: большей частототой антигена HPA-5b (23,8%) [Kiefel V. et al., 1995].
Население Великобритании (Англии и Шотландии), Швеции имеет более низкую частоту антигена HP A-lb, составляющую соответственно 2,4% [Garner S.F. et al, 2000]; 1,47% [Watkins N.A. et al., 1999]; 4,2% [Forsberg B. et al., 1995], чем средние показатели для белой расы. То же касается и населения Канады, где антиген HP A-lb зарегистрирован у 2,5%, а антиген НРА-ЗЬ-у 0,35% [Denomme G. et al., 1996].
Частота HPA-5b аллеля (10%) у финнов ниже, чем в популяции Центральной или Южной Европы (20-30%). Частоты аллелей НРА-1, -2, -3 не отличаются от частот, наблюдаемых в других европейских популяциях. Редкий HPA-6bw антиген обнаружен у 3 из 127 индивидов из юго-восточной Финляндии, что составляет 2,4% [Kekomaki R. et al., 2000], то есть чаще, чем это было принято ранее (0,0067% или 1:150) [Kekomaki R. et al., 1995].
В Польше частоты антигенов НРА-2 и НРА-5 отличаются от частоты распространения этих антигенов в других европейских популяциях - в Германии и Австрии. Частота аллелей НРА-5 более схожа с частотой, наблюдаемой в финской популяции [Drzewek К. et al., 1998].
Популяции Дании [Simsek S. et al., 1993, Steffensen R. et at, 1996], Германии [Unkelbach K. et al., 1995, Legler TJ. et al., 1996], Италии [Tazzari PJL. et al., 1998], Австрии [Holensteiner A. et al., 1995] имеет частоты тромбоцитепецифичесісих антигенов, характерные для европейской популяции. У японской популяции практически отсутствует полиморфизм антигена НРА-1 [Tanaka S. et al., 1996]. У населения Китая также практически отсутствует полиморфизм антигенов НРА-1, -2, -4, -5 [Chang Y.W. et al., 1998]. Распределение НРА среди китайцев о.Тайвань несколько отличается от такового у населения на материке, белой расы и японцев. При сравнении с европейцами у китайцев наблюдается значительное преобладание НРА-1а и НРА-5Ъ, низкая частота встречаемости НРА-2Ь и НРА-За. Китайцы, как и японцы, являются носителями НРА-1а почти в 100% случаев. Однако показатели частоты встречаемости НРА-2Ь и НРА-4Ъ значительно ниже у китайцев, чем у Японцев, а показатели встречаемости НРА-За несколько выше у китайцев, чем у японцев [Tsao K.S. et al., 1992]. В Корее частота НРА-lb составляет 2,0%, что значительно выше, чем в японской или китайской популяции (0,3%) [Seo D.H. et al., 1998]. У населения Таиланда отсутствует полиморфизм антигена НРА-1 [Urwijitaroon Y. et al., 1995]. В Индонезии есть различия в распределении антигенов тромбоцитов среди белой и монголоидной рас [Santoso S. et al., 1999]. В Бразилии все амазонские индейцы имели НРА-2а и НРА-5 а аллели, а аллели НРА-1Ь - НРА-4Ь отсутствовали в индейской популяции (монголоидная раса), что сближает их с жителями Востока. Все бразильские доноры (смешанная популяция) имели антигены НРА-1а, НРА-4а и НРА-5 а, частота НРА аллелей сравнима с таковой у жителей Северной Америки и Европы. Генные частоты НРА-1 (Р 0,001), НРА-2 (Р=0,001) и НРА-5 (Р 0,001) значительно отличались у амазонских индейцев и бразильских доноров [Chiba А.К. et al., 2000]. Кроме того, америісанские индейцы Амазонки имеют частоту встречаемости гена HPA-2b, равную 0,042. Это самое низкое значение частоты распространения гена в монголоидной расе [Covas D.T. et al., 1997]. Американцы белой и негроидной рас отличаются частотами антигенов НРА-2Ь и НРА-5Ь: у афроамериканцев указанные антигены встречаются в два раза чаще, чем у белых американцев (0,18 и 0,21 против 0,09 и 0,11, соответственно) [KimH.O. eta!., 1995]. В табл.1 представлены генные частоты антигенов системы НРА у разных народов. Из этой таблицы и из приведенных выше данных следует для реципиентов монголоидной расы от доноров белой расы повторное переливание тромбоцитов в виду более высокой частоты НРА-lb, НРА-2Ъ, НРА-ЗЬ существует риск аялоиммунизации и возникновения поеттрансфузионных осложнений негемолитического типа. И наоборот, доноры монголоидной расы с антигенами НРА- 1а, НРА-За, НРА-5а могут представлять ту же опасность для реципиентов белой расы, гомозиготных по редко встречающимся аллельным антигенам. В настоящее время интенсивно продолжается популяционное изучение аллоантигенов системы НРА. Антигенный полиморфизм установлен далеко не для всех этнических групп. Это может быть связано с нечеткой выборкой антропологической группы, а также методическими, техническими трудностями идентификации генов и антигенов тромбоцитов. Необходимо отметить, что работа по генотипированию антигенов тромбоцитов системы НРА многонационального населения России находится в самом начале [Головкина Л. Л. и др., 2002]. Поэтому изучение частоты полиморфных генов для отдельных этнических групп России является актуальной задачей иммуногематологии. Таким образом, анализ имеющихся на сегодняшний день литературных данных показал, что: 1) изучение антигенного полиморфизма системы HP А имеет важное значение при проведении трансфузий тромбоцитов пациентам с аплазией кроветворения; 2) частоты аллельиых генов и генотипов HP А установлены не во всех этнических группах; 3) одним из самых простых и экономичных методов является полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфичных праймеров.
Иммуногенетические параметры HP А у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы
Использование комбинации сиквенс-специфических праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель HP А, позволяет сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующего гена всех пяти локусов HP A: НРА-1, НРА-2, НРА-3, НРА-4 и НРА-5. Кроме того, добавление в каждую пробирку дополнительной пары праймеров, амплифицирующей фрагмент гена фактора роста человека, обеспечивает положительный контроль для каждой реакции амплификации. Генотипирование «слепым» методом образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS".
Предлагаемая нами тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров имеет несколько отличий от аналогичных зарубежных систем.
Во-первых, использование модифицированных нами праймеров для НРА-3, -5 локусов позволяет проводить специфическую амплификацию всех пяти локусов НРА при одинаковой температуре (68С). В аналогичных тест-системах предлагается проводить отжиг праймеров для разных локусов НРА в несколысих температурных режимах [Cavanagti G. et al., 1996, Jau-Yi Lyou et al., 2003].
Во- вторых, применение 96-луночных планшет с праймерами позволяет одновременно генотипировать 9 образцов ДНК, а также значительно сокращает время постановки реакции. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров является достаточно простой процедурой, которая включает только два пост-амплифшсационных шага - электрофорез и визуальную интерпретацию [Kluter Н. et al., 1996, Kroll H. et at, 1998, Darke C. et al., 1996]. Кроме того, существует возможность применения метода Realime (полимеразная цепная решения в реальном времени) для генотипирования НРА, преимуществом которого является отсутствие пост-амгглифшеационных шагов. Таким образом, техника полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров является недорогим, простым и точным методом генотипирования системы НРА как для клинических исследований, так и для создания регистра доноров крови [Sellers J. et al., 1999]. Ранее было показано, что большие расы и локальные популяции населения Земного шара различаются по частоте НРА-генов [Simsek S. et al., 1993, Kekomaki S. et al., 1995, Kim И.О. et al, 1995, Covas D.T. et al., 1997, Drzewek K. et al., 1998]. С помощью модифицированной нами тест-системы получены данные о частоте аллелей и генотипов НРА у 197 жителей России (кадровые доноры крови и ее компонентов). Эти данные позволили рассчитать все иммуногенетичесісие параметры: частоты аллелей, генов и генотипов НРА, величину неравновесного сцепления и генетическую дистанцию. Кроме того, на основании этих данных можно рассчитать необходимую численность контингента типированных по НРА доноров, обеспечивающую возможность иммунологически неконфликтной трансфузии для любого реципиента. Сведения о частоте аллелей и генотипов НРА у жителей России, полученные путем прямого подсчета, оказались сопоставимы с соответствующими частотами генов в европейской популяции. Так частоты HPA-la, -2а, -2Ь, -За, -ЗЬ, -5а и -5Ь не отличались заметно от соответствующих данных в Австрии [Holensteiner A. et al., 1995], Финляндии [Kekomaki S. et al., 1995], Германии [Simsek S. et at, 1993] или Польше [Drzewek К. et al., 1998]. Аллель HPA-4b отсутствовал как по нашим данным, так и по данным для других популяций (Дания, Германия, Польша) [Simsek S. et al, 1993, Steffensen R. et al., 1996, Unkelbach K. et al., 1995, Legler T.J. et al., 1996]. Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров г.Москвы выявлена увеличенная частота гена НРА-2Ъ — 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы - 13,2%. Отсутствие расхождений между ожидаемыми и расчетными данными свидетельствовало о корректности проведенного исследования и о нахождении популяции в равновесии с законом Харди-Вайнберга. Генные частоты «а» и «Ь» аллелей НРА определены как 0,86 и 0,14 для локусов НРА-1 и НРА-2; 0,55 и 0,45 для локуса НРА-3; 0,93 и 0,07 для локуса НРА-5. Частота гена HPА-4а составила 1,0. Частоту гаплотипов НРА-1, -3 вычисляли непосредственно по реультатам генотигшрования. Наиболее часто встречались гаплотипы НРА-1 а/3 а и НРА-1а/ЗЬ. Определение величины неравновесного сцепления генов с учетом частоты аллелей НРА выявило незначительную гаметную ассоциацию между генами НРА-1а и НРА-3 а, а также между генами НРА-lb иНРА-ЗЬ. Изучение генетической дистанции между народами показало близость российских жителей к европейскому населению. Так величина генетической дистанции между жителями России и Польши составила (1=3,6x10", а между жителями России и Финляндии - а 4,2х10 2, что подтверждает ранее полученные данные при сопоставлении генных частот HLA-системы [Зарецкая Ю.М., 1983]. Иммуногенетические параметры НРА-генов у кадровых доноров г.Москвы указывают на выраженный полиморфизм локусов НРА-1, -2, -3, -5. Поэтому трансфузии тромбоцитов должны проводиться с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента. Это является важным для предотвращения аллоиммунизации больных, развития у них посттрансфузионной тромбоцитопенической пурпуры и иммунологической рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов. Учитывая различия в распределении частот НРА-генов и необходимость подбора НРА-совместимых доноров, а также неоднородность российской популяции, изучение частот аллелей и генотипов НРА в некоторых этнических группах представляет несомненный интерес. Нами получены предварительные данные о распределении генов и генотипов в двух этнических группах: у 32 представителей армянской национальности и 28 представителей хакасской национальности (национальность устанавливали путем опроса с учетом этнической принадлежности не менее чем в 3-х поколениях). Рассчитать все иммуногенетические параметры, а именно частоты генотипов, гаплотипов и генетическую дистанцию, оказалось невозможным в виду недостаточного объема исследуемых выборок. На основании полученных нами данных выявлены достоверные различия частот аллелей и генотипов в выборках кадровых доноров г.Москвы, представителей армянской и хакасской национальностей (р 0,05). Полученные данные позволяют предложить формирование локальных (национальных) когорт доноров.
Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у жителей России
Использование комбинации сиквенс-специфических праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель HP А, позволяет сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующего гена всех пяти локусов HP A: НРА-1, НРА-2, НРА-3, НРА-4 и НРА-5. Кроме того, добавление в каждую пробирку дополнительной пары праймеров, амплифицирующей фрагмент гена фактора роста человека, обеспечивает положительный контроль для каждой реакции амплификации. Генотипирование «слепым» методом образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS".
Предлагаемая нами тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров имеет несколько отличий от аналогичных зарубежных систем.
Во-первых, использование модифицированных нами праймеров для НРА-3, -5 локусов позволяет проводить специфическую амплификацию всех пяти локусов НРА при одинаковой температуре (68С). В аналогичных тест-системах предлагается проводить отжиг праймеров для разных локусов НРА в несколысих температурных режимах [Cavanagti G. et al., 1996, Jau-Yi Lyou et al., 2003].
Во- вторых, применение 96-луночных планшет с праймерами позволяет одновременно генотипировать 9 образцов ДНК, а также значительно сокращает время постановки реакции. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров является достаточно простой процедурой, которая включает только два пост-амплифшсационных шага - электрофорез и визуальную интерпретацию [Kluter Н. et al., 1996, Kroll H. et at, 1998, Darke C. et al., 1996]. Кроме того, существует возможность применения метода Realime (полимеразная цепная решения в реальном времени) для генотипирования НРА, преимуществом которого является отсутствие пост-амгглифшеационных шагов. Таким образом, техника полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров является недорогим, простым и точным методом генотипирования системы НРА как для клинических исследований, так и для создания регистра доноров крови [Sellers J. et al., 1999]. Ранее было показано, что большие расы и локальные популяции населения Земного шара различаются по частоте НРА-генов [Simsek S. et al., 1993, Kekomaki S. et al., 1995, Kim И.О. et al, 1995, Covas D.T. et al., 1997, Drzewek K. et al., 1998]. С помощью модифицированной нами тест-системы получены данные о частоте аллелей и генотипов НРА у 197 жителей России (кадровые доноры крови и ее компонентов). Эти данные позволили рассчитать все иммуногенетичесісие параметры: частоты аллелей, генов и генотипов НРА, величину неравновесного сцепления и генетическую дистанцию. Кроме того, на основании этих данных можно рассчитать необходимую численность контингента типированных по НРА доноров, обеспечивающую возможность иммунологически неконфликтной трансфузии для любого реципиента. Сведения о частоте аллелей и генотипов НРА у жителей России, полученные путем прямого подсчета, оказались сопоставимы с соответствующими частотами генов в европейской популяции. Так частоты HPA-la, -2а, -2Ь, -За, -ЗЬ, -5а и -5Ь не отличались заметно от соответствующих данных в Австрии [Holensteiner A. et al., 1995], Финляндии [Kekomaki S. et al., 1995], Германии [Simsek S. et at, 1993] или Польше [Drzewek К. et al., 1998]. Аллель HPA-4b отсутствовал как по нашим данным, так и по данным для других популяций (Дания, Германия, Польша) [Simsek S. et al, 1993, Steffensen R. et al., 1996, Unkelbach K. et al., 1995, Legler T.J. et al., 1996]. Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров г.Москвы выявлена увеличенная частота гена НРА-2Ъ — 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы - 13,2%. Отсутствие расхождений между ожидаемыми и расчетными данными свидетельствовало о корректности проведенного исследования и о нахождении популяции в равновесии с законом Харди-Вайнберга. Генные частоты «а» и «Ь» аллелей НРА определены как 0,86 и 0,14 для локусов НРА-1 и НРА-2; 0,55 и 0,45 для локуса НРА-3; 0,93 и 0,07 для локуса НРА-5. Частота гена HPА-4а составила 1,0. Частоту гаплотипов НРА-1, -3 вычисляли непосредственно по реультатам генотигшрования. Наиболее часто встречались гаплотипы НРА-1 а/3 а и НРА-1а/ЗЬ. Определение величины неравновесного сцепления генов с учетом частоты аллелей НРА выявило незначительную гаметную ассоциацию между генами НРА-1а и НРА-3 а, а также между генами НРА-lb иНРА-ЗЬ. Изучение генетической дистанции между народами показало близость российских жителей к европейскому населению. Так величина генетической дистанции между жителями России и Польши составила (1=3,6x10", а между жителями России и Финляндии - а 4,2х10 2, что подтверждает ранее полученные данные при сопоставлении генных частот HLA-системы [Зарецкая Ю.М., 1983]. Иммуногенетические параметры НРА-генов у кадровых доноров г.Москвы указывают на выраженный полиморфизм локусов НРА-1, -2, -3, -5. Поэтому трансфузии тромбоцитов должны проводиться с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента. Это является важным для предотвращения аллоиммунизации больных, развития у них посттрансфузионной тромбоцитопенической пурпуры и иммунологической рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов. Учитывая различия в распределении частот НРА-генов и необходимость подбора НРА-совместимых доноров, а также неоднородность российской популяции, изучение частот аллелей и генотипов НРА в некоторых этнических группах представляет несомненный интерес. Нами получены предварительные данные о распределении генов и генотипов в двух этнических группах: у 32 представителей армянской национальности и 28 представителей хакасской национальности (национальность устанавливали путем опроса с учетом этнической принадлежности не менее чем в 3-х поколениях). Рассчитать все иммуногенетические параметры, а именно частоты генотипов, гаплотипов и генетическую дистанцию, оказалось невозможным в виду недостаточного объема исследуемых выборок.
Похожие диссертации на Молекулярные возможности генотипирования антигенов тромбоцитов человека
