Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 7
ВВЕДЕНИЕ 10
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 22
Гетерогенность циркулирующих тромбоцитов 22
Теории тромбоцитопоэза 26
История исследования происхождения тромбоцитов 26
Образование тромбоцитов 28
Продукция тромбоцитов путем фрагментации 28 цитоплазмы
Способность к образованию пузырьков или 29 почкование
Инвагинация мембраны с дальнейшим отделением 30 тромбоцитов в виде бус
Формирование и отшнуровка протромбоцитов 30
2.3. Циркулирующие мегакариоциты 34
3. Полиплоидность ядра мегакариоцитов и ее значение 38
для тромбоцитопоэза
3.1. Плоидность мегакариоцитов и средний объем 44
тромбоцитов (СОТ)
4. Молекулярный механизм регуляции 47
мегакариоцитопоэза
ТПО и его рецептор c-Mpl 48
Транскрипционный фактор GATА-1. 50
Транскрипционный фактор NF-E2 51
Регуляция мегакариоцитопоэза цитокинами 52 4.4.1.. Интерлейкин-1 52
Интерлейкин-3 52
Интерлейкин-6 53
Интерлейкин-7 54
Интерлейкин-9 55
Интерлейкин-11 55
Интерлейкин- 12 56
ГМ-КСФ 56
Эритропоэтин 57
Молекулы адгезии 58
Катехоламины 60
Апоптоз мегакариоцитов 62
Нарушения мегакариоцитов и связанные с этим 63
изменения в тромбоцитах.
Дисковидные тромбоциты и их активация 64
Протромбоциты или биполярные тромбоциты 70
Большие и ретикулярные тромбоциты 73
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 82
Подготовка обогащенной тромбоцитами плазмы 82
Растворы антикоагулянтов 82
Взятие крови и выделение ОТП 83
Изучение морфологии тромбоцитов 84
Химические реактивы 84
Подготовка образцов 84
Визуализация тромбоцитов 85
Изучение структуры тромбоцитов 85
Функции тромбоцитов 86
Агрегационная активность 86
Адгезия тромбоцитов 87
Реакция эндо-экзоцитоза 88
Средний объем тромбоцитов (СОТ) 89
Выделение и хранение концентратов тромбоцитов 89
Модели животных 91
Создание модели гипер и гипокатехоламинемии у
крыс 91
Вживление катетеров 91
Модель метаболического стресса 91
Модель демедулированных крыс 92
Введение фармакологических препаратов 92
Определение концентрации эндогенных
катехоламинов 92
Группы здоровых лиц и пациенты 94
Здоровые лица 94
Пациенты 94
Статистический анализ 97
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 98
1. Особенности морфологии и функций тромбоцитов
человека и животных 100
Морфо-функциональное состояние тромбоцитов
человека 100
Влияние различных антикоагулянтов на морфо- 104
функциональное состояние тромбоцитов человека
Влияние способа взятия крови на морфо- 109
функциональное состояние тромбоцитов человека
Морфо-функциональные особенности тромбоцитов 112
животных разных видов
Роль катехоламинов в регуляции тромбоцитарного 113
пула
Влияние способа взятия крови на содержание ПТ в 114
крови крыс
Состояние тромбоцитов при гиперкатехоламинемии,
вызванной метаболическим стрессом 115
Морфологические свойства ПТ крыс 119
Функциональные особенности ПТ крыс 123
Агрегационная способность 123
Адгезия 126
Реакция освобождения (экзоцитоз) 130
Взаимодействие ПТ с лейкоцитами 131
Влияние демедуляции крыс на появление ПТ в крови 132
Влияние наркоза на морфо-функциональные
особенности тромбоцитов у крыс 134
Влияние адреноблокаторов на содержание ПТ в 135
крови крыс
Возможность образования ПТ в условиях in vitro 138
Влияние различных веществ на трансформацию ПТ 138
человека в условиях in vitro
'Лі
Роль Са в поддержании формы ПТ 141
Влияние интерлейкинов на тромбоциты in vitro 142
Состояние тромбоцитарного пула в условиях
хранения тромаомассы 143
Гетерогенность тромбоцитов человека с различными
патологиями 151
Состояние тромбоцитов больных бронхиальной
астмой после лечения с помощью тромбоцитафереза 151
Тромбоциты больных феохромоцитомой 153
Морфо-функциональное состояние тромбоцитов у 159
больных с воспалением
Атеросклероз 163
Влияние дезагрегантной терапии на
функциональную активность и морфологическую 170
гетерогенность пула тромбоцитов больных ИБС
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 172
ВЫВОДЫ 176
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 178
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2ДГ - 2-дезокси-Д-глкжоза
2N-512N - плоидность ядра
(3-ТГ - Р-тромбоглобулин
АДФ - аденозиндифосфат
АО - акридиновый оранжевый
АТФ - аденозинтрифосфат
БТП - бедная тромбоцитами плазма
ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колоние-стимулирующий фактор
ГП - гликопротеин
ГП Ib-V-IX - гликопротеиновый комплекс плазматической мембраны, в
котором к гликопротеину lb присоединены ГП V и ГП IX
ГП ИЬЯПа - специфичный гликопротеиновый рецептор, ответственный за
взаимодействие с фибриногеном
ГП VI - гликопротеин VI, рецептор к коллагену, ответственный за активацию
тромбоцитов
Д - тромбоциты дисковидной формы
ДМС - демаркационная мембранная система
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИЛ - интерлейкин
ИТП - иммунная тромбоцитопеническая пурпура
ИФ-у - интерферон-у
кД - килодальтон
КСФ-1 -колоние-стимулирующий фактор-1
ЛТА - лейкоцитарно-тромбоцитарные агрегаты
мкм - микрометр
М-КСФ — макрофагальный колоние-стимулирующий фактор
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
ОТП - обогащенная тромбоцитами плазма
ПТ - протромбоциты
ПТС - плотная тубулярная система
С1 - сферические тромбоциты размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или
различным числом псевдоподий, активированные формы
С2 - большие сферические тромбоциты размером 3-4 мкм с выраженными
инвагинациями плазматической мембраны
СОК - система открытых канальцев
СОТ - средний объем тромбоцитов
СЭМ - сканирующая электронная микроскопия
ТПО - тромбопоэтин
ТФ-4 - тромбоцитарный фактор 4
ТФР-р - трансформирующий фактор роста
ТХА2 - тромбоксан А2
ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия
ФВб - фактор Виллебранда
фл - фемтолитры
ФНОа - фактор некроза опухолей альфа
ФХЦ - феохромоцитома
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат
Вс1-2 - семейство антиапоптозных белков Вс1-2
Bcl-xL - антиапоптозный белок
c-Mpl - рецептор тромбопоэтина
FGF - fibroblast growth factor - фактор роста фибробластов
GATA1 - erythroid transcription factor - эритроидный транскрипционный фактор
HLA-DR - human leukocyte antigen - антиген лейкоцитов человека
hNUDC - a human homolog of a fungal nuclear migration protein - человеческий
гомолог грибкового белка ядерной миграции
hNUDC - human homolog of a fungal nuclear migration protein - человеческий
гомолог белка ядерной миграции
ICAM - intercellular adhesion molecule - межклеточная молекула адгезии
Ig - иммуноглобулин
МАРК - mitogen-activated protein kinase - митогенактивируемая протеинкиназа
NF-E2 - nucltar factor erythroid 2 - эритроидный ядерный фактор 2
NK-клетки - натуральные киллеры
N0 - оксид азота
PDGF- platelet derived growth factor - фактор роста выделяемый тромбоцитами
VCAM - vascular cell adhesion molecule - сосудистая молекула клеточной
адгезии
Введение к работе
Согласно современным представлениям, тромбоциты играют ведущую роль в запуске процесса образования тромба. Активация тромбоцитов приводит к изменению их формы из дисков, покоящихся клеток в циркулирующей крови, в сферы - активированные клетки, с повышенной способностью к адгезии, образованию агрегатов и секреции биологически активных соединений, непосредственно участвующих или влияющих на гемостаз. Кроме наиболее изученного участия тромбоцитов в гемостазе, они играют важную роль в иммунных процессах и воспалении (Weyrich A., Zimmerman G., 2004; Gawaz М., Langer Н. et.al., 2005). Активированные тромбоциты способны вступать во взаимодействие с лейкоцитами, формируя ЛТА. Образование ЛТА происходит на ранних стадиях развития воспалительного процесса, в результате активации тромбоцитов под действием появившихся в крови провоспалительных медиаторов, в том числе цитокинов, и играет важную роль в патогенезе воспаления.
Провоспалительные медиаторы, освобождаемые в основном активированными моноцитами и макрофагами, такие как ИЛ-ір, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-11 и ФНОа, а также эндотоксины, в первую очередь воздействуют на эндотелий сосудов. В его клетках синтезируются молекулы адгезии, делающие поверхность эндотелия «липкой» — клетки приобретают провоспалительный и прокоагулянтный фенотип. Вслед за этим происходит активация тромбоцитов —- ключевое событие не только гемостаза и тромбоза, но и воспалительного и иммунного ответов. В результате этого запускается замкнутый каскад реакций. С одной стороны, повышается способность тромбоцитов к адгезии, агрегации и освобождению из них ряда прокоагулянтных и провоспалительных веществ, в том числе и цитокинов, стимулирующих активное движение различных типов лейкоцитов к очагу воспаления. С другой стороны, взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами приводит к внутренней перестройке последних и выбросу из них
прокоагулянтных факторов (в частности тканевого фактора), провоцирующих реакцию свертывания крови. В итоге риск тромботических осложнений возрастает. Кроме того, увеличивается синтез и секреция цитокинов моноцитами, усиливается их прикрепление и передвижение внутрь сосудистой стенки, подавляется апоптоз, в результате чего они продолжают жить и поддерживать в крови высокий уровень цитокинов (Strukova S., 2006).
Благодаря присущей им способности к экзо-эндоцитозу, тромбоциты участвуют в защите организма-хозяина от вирусов и бактерий (Youssefmn Т., Drouin A. et al, 2002; White J. 2005), транспорте веществ, регуляции сосудистого тонуса (Harrison Р., 2005), росте, метастазировании и уничтожении раковых клеток (Okada М., Sagawa Т. et al., 1996; Gupta G., Massague J., 2004), a также в ангиогенезе и ремоделировании сосудов. Взаимодействуя с клетками-предшественниками из костного мозга, тромбоциты помогают привлечению их в зоны повреждения сосудов и выделяют большое количество ростовых факторов, влияющих на рост и развитие сосудистой сети (Jurasz P., Santos-Martinez М., Radomska A. et al., 2006; Massberg S., Konrad L, Schurzinger K. et al., 2006).
Исследование способности тромбоцитов к активации, их структурных и функциональных изменений является важной проблемой, так как понимание механизмов, лежащих в их основе, расширяет возможности профилактики и коррекции нарушений в системе гемостаза, не только отягощающих течение заболевания, но нередко определяющих его исход.
Актуальность исследования. Неоднородность циркулирующих тромбоцитов периферической крови была обнаружена еще в начале прошлого века. Первоначально рассматривались только морфологические и количественные изменения, часто варьирующие при различных патологических состояниях. Но в дальнейшем было показано, что различия наблюдаются не только в их количестве, морфологии, возрасте, плотности, объеме, но и в функциональной активности, содержании белков, гликогена, ферментов и
рецепторов, что позволило говорить о гетерогенности пула тромбоцитов (Karpatkin S., Khan Q., Freedman M., 1978).
Связь этих особенностей друг с другом не однозначна и остается до конца невыясненной. При отсутствии патологии, все эти свойства клеток у одного лица сохраняются в течение длительного времени и имеют незначительные индивидуальные колебания (Thompson С, Jakubowski J., 1988).
Основная часть циркулирующих интактных тромбоцитов в норме имеет характерную дисковидную форму со средним диаметром 3,1 ±0.3 мкм, толщиной 1,0±0,2 мкм и средним объемом до 10 фл. (White J., 1987). Двухслойная фосфолипидная мембрана тромбоцитов, с большим количеством включенных в нее интегральных гликопротеинов и белков, служит барьером, который опосредует взаимодействие клеток с изменяющейся внешней средой и запуск начальных этапов активации. Соединение лигандов с рецепторами запускает определенную последовательность изменений, которая, через систему реакций в цитоплазме, передается к эффекторным структурам, реализующим функциональные реакции клетки (Clemetson К., 1995).
Масспектрометрический анализ показал, что в тромбоцитах содержится более 700 белков, из которых на сегодняшний день идентифицированы только около 200 (Coppinger J., Cagney G., Toomey S. et al., 2004). Большинство из них хранится в ос-гранулах, плотных тельцах и лизосомах. Они поступают туда как в ходе мегакариоцитопоэза, так и путем включения из плазмы. Тромбоциты, являясь секреторными клетками, после стимуляции высвобождают большое число хранящихся активных субстанций, выполняя таким путем транспортную функцию и регулируя многие процессы в организме, в том числе и мегакариоцитопоэз.
Поверхность интактных дискоцитов гладкая, с многочисленными небольшими (0,2 - 0,3 мкм) углублениями, которые служат местами соединения плазматической мембраны и каналов открытой канальцевой системы. Благодаря этому происходит обмен веществ между внутриклеточной
и окружающей средой, а также выполняется захват вирусов, бактерий и инородных частиц (Zucker-Franklin D., 1981; Escolar G., White J., 1991; White J., 2006). При активации происходит быстрое, занимающее менее секунды, изменение формы пластинок из дисковиднои, которая характерна для их циркуляции в кровотоке здорового организма, в сферическую. На разных этапах этого процесса могут появляться переходные формы. Первоначально возникают дисковидные с измененной поверхностью - от гладкой до складчатой, с единичными или множественными псевдоподиями различной длины. В дальнейшем тромбоциты меняют свою форму из дисковиднои на сферическую. На них могут появляться различные выросты, начиная с бугорков и заканчивая псевдоподиями. По их количеству и структуре предлагалось судить о степени активации (Corash L., 1990). Долгое время переход из дисковиднои в сферическую форму рассматривался в качестве одной из причин гетерогенности тромбоцитарного пула. Именно на основе такого взгляда были созданы классификации тромбоцитов по форме, размеру и плотности, которые долгое время применялись для определения риска тромботических осложнений у больных (Дроздова В.А., 1955; Безносиков Б.О., Измайлова Е.Ф., 1961; Тоцкая А.А., 1967; Кассирский И.А., Алексеев Г.А., 1970). Кроме покоящихся дисковидных и активированных сферических, были обнаружены и другие по форме тромбоциты, которые R. Allen относил к атипичным или артефактным (Allen R., Zacharski L., Widirtski S. et al., 1979). Но в дальнейшем появились неопровержимые данные, что такие формы появляются в результате их рождения при мегакариоцитопоэзе (Kosaki G., 2005).
Различия в размере, плотности и реактивности кровяных пластинкок закладываются при тромбоцитопоэзе (Thompson С, Eaton К., Princiotta S. et al., 1982; Martin J., Shaw Т., Heggie J. et al., 1983). Предположение о том, что «гиганты костного мозга порождают карликов крови» высказано более 100 лет назад. Но только в последние два десятилетия получено подтверждение об изначальной продукции ими разных по форме тромбоцитов (Gladwin A., Martin
J., 1990; Hartwig J., Italiano J., 2003). В процессе созревания мегакариоцит проходит три стадии: мегакариобласт, промегакариоцит и мегакариоцит. Количественно соотношение этих групп выражается как 1,0:1,2:4,1. Общее транзитное время созревания в условиях культуры составляет 60 часов, соответственно для мегакариобластов - 11, промегакариоцитов - 15 и мегакариоцитов - 34 час. В норме мегакариоциты редко покидают костный мозг и там продуцируют кровяные пластинки, которые затем попадают в кровоток. Но единичные мегакариоциты могут выходить в кровоток и затем, попадая в капилляры альвеол легких, производить там тромбоциты. В условиях патологии (острые инфекции, гепатит, кровопотеря, онкологические заболевания, при операциях аортокоронарного шунтирования) в десятки раз возрастает количество циркулирующих мегакариоцитов в крови. Они могут быть причиной развития нарушений мозгового кровообращения и легочных тромбоэмболии (Bowles В., Lee J., Dang С, 2001;Van Dijk D., Jansen E., Hijman R., 2002; Mark D, Newman M., 2002).
Возможны следующие пути появления тромбоцитов из мегакариоцитов: 1) образования демаркационных мембран в цитоплазме мегакариоцитов с быстрым одномоментным выбросом тромбоцитов, носящим взрывной характер; 2) образование эндоплазматических пузырей, содержащих пластинки с последующим их отделением от материнской клетки; 3) инвагинация мембраны с дальнейшим отделением тромбоцитов в виде бус; 4) появление на поверхности волосков и дальнейшее образование из цитоплазмы псевдоподий, проникновение которых в синусы костного мозга сопровождается отшнуровкой тромбоцитов. Мегакариоцитопоэз из циркулирующих клеток в основном происходит по четвертому типу. В результате него рождаются незрелые формы тромбоцитов, которые были названы протромбоцитами. В дальнейшем уже в кровотоке они разделяются на тромбоциты дисковидной формы. Ультраструктура поверхности мембран клеток мегакариоцитарного ряда определяет, на какой стадии созревания находятся клетки. Более ранним
стадиям созревания соответствует гладкая, лишенная выростов цитоплазматическая мембрана. Далее происходит появление волосков и различного размера удлиненных выростов, что вероятнее всего связано с начальной стадией образования протромбоцитов. По мере созревания мембрана становится неровной и приобретает складчатую конфигурацию. На ней появляются пузырьки и часто видны соединенные с материнской клеткой тромбоциты (Вашкинель В., Петров М., 1982).
Важную роль в продукции тромбоцитов играет полиплоидизация ядра мегакариоцитов (Ravid К., Lu J., Zimmet J. et al., 2002). Плоидность мегакариоцитов из костного мозга обычно варьирует от 4N до 64N. До 50% мегакариоцитов здорового человека имеют плоидность 16N. Остальные клетки приблизительно в равном соотношении имеют плоидность ниже или выше. Уже на ранних стадиях созревания, при плоидности 4N, находящиеся на которой мегакариоциты морфологически трудно отличить от других клеток мононуклеарного ряда, в них появляются специфичные для тромбоцитов белки. Не смотря на то, что уровень этих белков значительно ниже, чем в зрелых мегакариоцитах, их присутствие свидетельствует о способности этих молодых клеток передавать основные, специфичные свойства, тромбоцитам. Однако нет однозначных данных о конкретных условиях и стимулах, которые приводят к запуску поэза мегакариоцитами с низкой плоидностью. Максимальная плоидность ядра соответствует 128N, после чего эндомитоз прекращается и происходит апоптоз клеток. Повышение плоидности приводит к накоплению в цитоплазме более высокого количества биологически активных веществ, которые могут передаваться рожденным ими тромбоцитам. Такие мегакариоциты дают начало крупным, большим сферическим, или часто называемым «ретикулярными» тромбоцитам. Состав окружающей среды является определяющим фактором созревания и полиплоидизации мегакариоцитов и именно от него зависит, какой из путей поэза будет иметь место (Slayton W., Wainman D., Li X. et al., 2005). Влиять на мегакариоцитопоэз
могут транскрипционные факторы, поэтины и цитокины, а также молекулы адгезии и катехоламины.
В настоящее время выделяют три формы тромбоцитов, появление которых в кровотоке зависит от стояния мегакариоцитов и в первую очередь от их плоидности. Это дисковидные тромбоциты (Д), характерные для кровотока здоровых лиц и рожденные зрелыми мегакариоцитами с плоидностью 16N и 32N. Удлиненные биполярные протромбоциты (ПТ), которые быстро поступают в кровь при необходимости восстановления пула тромбоцитов при тромбоцитопении, рождаясь из мегакариоцитов, находящихся на ранних стадиях созревания и имеющих низкую плоидность (4N, 8N и 16N). Большие сферические («ретикулярные») тромбоциты (Сг) размером 4-5 мкм, имеющие слоистый вид или множественные бабулярные образования на мембране и высокое содержание мРНК, появляющиеся из мегакариоцитов с плоидностью выше 64N при патологических состояниях, не связанных с генетическими нарушениями. Кроме этих трех, зависящих от мегакариоцитопоэза кровяных пластинок, выделяют четвертую субпопуляцию - сферические тромбоциты размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий (Сі). За исключением редких патологий, их появление в крови не связано с мегакариоцитопоэзом, а происходит в результате активации кровяных пластинок и изменения их формы из дисковидной в сферическую.
Большинство исследований функциональных свойств тромбоцитов проводится на Д тромбоцитах и их производных - Сі формах. Что касается ПТ и Сг форм, они остаются мало изученными, данные о них носят в основном описательный характер, а сведения о функциональных свойствах и роли в различных процессах единичны и носят противоречивый характер.
Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследования было выяснение взаимосвязи между морфологической гетерогенностью тромбоцитов, их функциональными свойствами и участием различных субпопуляций в гемостазе и тромбозе.
К задачам исследования были отнесены:
выявление и характеристика различных субпопуляций тромбоцитов, циркулирующих в крови человека и животных в норме;
отработка экспериментальных моделей, в которых в крови увеличивается количество протромбоцитов и появляются большие сферические («ретикулярные») тромбоциты;
подбор условий и изучение механизмов появления разных субпопуляций тромбоцитов в крови;
изучение функциональной активности отдельных субпопуляций кровяных пластинок - в особенности протромбоцитов и больших сферических тромбоцитов;
поиск факторов, влияющих на появление протромбоцитов и больших тромбоцитов in vitro;
исследование морфофункциональных особенностей тромбоцитов у больных при различных патологиях и вклад в развитие тромбозов и геморрагии;
изучение влияния различных фармакологических препаратов на содержание в крови разных субпопуляций тромбоцитов.
Иными словами, основным направлением работы был поиск ответа на вопрос: существует ли взаимосвязь между морфологией тромбоцитов, приобретенной ими в ходе мегакариоцитопоэза, и функциональной активностью пластинок, а также, какие факторы внешней среды могли бы оказаться решающими в появлении различных субпопуляций?
Научная новизна. Практически все основные результаты работы получены впервые. Для исследования особенностей морфологии и функций тромбоцитов была использована модель метаболического стресса у крыс. Это позволило выявить условия повышения количества протромбоцитов в крови и провести исследование редко встречающихся в норме форм тромбоцитов. До
нашей работы такую модель для исследования морфофункциональной гетерогенности тромбоцитов никто не применял.
Разработанный нами метод смыва неактивных тромбоцитов с адгезивных поверхностей дал возможность выделить высоко-гомогенную фракцию протромбоцитов, что помогло получить доказательства их функциональной инертности.
Впервые получены экспериментальные данные о форме и структуре протромбоцитов, не способных к агрегатообразованию. Количественное определение таких клеток у больных повышает возможности более адекватной оценки риска возникновения у них геморрагических осложнений.
Впервые обнаружено, что длительно поддерживающееся высокое содержание катехоламинов в крови приводит к продукции протромбоцитов. Наиболее значительное количество функционально инертных протромбоцитов обнаружено у больных феохромоцитомой и пациентов с инфекционными заболеваниями на стадии гипокоагуляции.
Показано, что циркулирующие мегакариоциты из донорской крови, способны к тромбоцитопоэзу в условиях хранения тромбомассы in vitro. Появление молодых тромбоцитов влияет на сохранение функциональной активности хранящейся тромбомассы и способствует продлению срока пригодности ее для переливания.
Экспериментально подтверждено, что протромбоциты секвестируются в селезенку и возвращаются в кровоток под действием катехоламинов.
Установлено, что присутствие в крови больших сферических тромбоцитов повышает агрегационную способность всего пула. Существует тесная взаимосвязь между количеством этих клеток в пуле и спонтанной агрегацией. Выявлено отсутствие типичной для тромбоцитов грануляции и сильно развитая сеть канальцев, заполненных аморфным материалом.
Для более адекватной оценки появления в крови больших тромбоцитов нами впервые применен разработанный в лаборатории оригинальный метод
определения среднего объема тромбоцитов по тромбоцитокриту. Метод оказался нетрудоемким и высокоэффективным, отличается более высокой точностью и воспроизводимостью по сравнению с использованием гематологических анализаторов.
Большие «ретикулярные» тромбоциты отсутствуют в крови здоровых добровольцев. У всех больных с верифицированным атеросклерозом, независимо от места его локализации, в крови выявлены большие тромбоциты.
Риск тромботических осложнений тесно связан с увеличением количества больших тромбоцитов, обладающих повышенной активностью. Отмечено, что при развитии ДВС-синдрома присутствие в крови (до 10 %) больших сферических форм соответствует фазе тромбозов, а увеличение количества биполярных протромбоцитов (до 50 %) - фазе геморрагии.
Научно-практическая значимость работы. Полученные
экспериментальные данные позволяют расширить сложившиеся представления о циркулирующих в крови тромбоцитах в норме и при патологических состояниях.
За период выполнения исследования разработаны методы выделения и количественной оценки протромбоцитов и больших «ретикулярных» тромбоцитов. Получены данные о количестве протромбоцитов в норме у человека и животных и о его повышении при различных сердечно-сосудистых патологиях. Показано, что количество биполярных протромбоцитов резко возрастает в условиях гиперкатехоламинемии. Обнаружено, что при феохромоцитоме на их долю приходится от 17% до 49% от общего числа тромбоцитов, и это может служить диагностическим критерием. Нами получено авторское свидетельство «Метод диагностики феохромоцитомы». Этот метод используется в клинической практике.
Отмечено, что увеличение количества протромбоцитов в крови соответствует фазе геморрагии. В отличие от этого, риск тромботических осложнений возрастает с появлением в крови больших «ретикулярных»
тромбоцитов. Они обладают повышенной активностью, способны спонтанно агрегировать. Ингибиторы циклооксигеназы не оказывают влияния ни на количество, ни на функциональные свойства этих клеток. Результаты этой работы могут оказаться полезными для разработки новых методов диагностики тромботических осложнений и в поиске способов их лечения.
Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на отечественных и международных конгрессах и симпозиумах: Пленум правления ВНОГ (Рига, СССР, 1986); Всесоюзная Конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987); 1 st Congress International Sosiety for Pathophysiology (Москва, 1991); Всесоюзная Конференция по Тромбозу и Гемостазу (Полтава, 1992); Всесоюзный Съезд Гематологов (Львов, 1993); 7th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 1995); Всероссийская конференция: Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения (Москва, 1997); 11th International Symposium on Atherosclerosis (Париж, Франция, 1997); 31st Annual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (Киль, Германия, 1997); Украинская Научная Конференция Микроциркуляция и ее возрастные изменения (Киев, Украина, 1999); 17th Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Вашингтон. США, 1999); 11th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 1999); 18th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Чикаго, США, 2000); 18th Congress of the International. Society on Thrombosis and Haemostasis (Париж, Франция, 2001); 12th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 2001); The 5th UK Meeting on platelets and the 9th Erfurt Conference on Platelets (Ноттингем, Англия, 2002); 3rd Украинская Научная Конференция Микроциркуляция и ее возрастные изменения (Киев, Украина, 2002); 42nd American Society for Cell Biology Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2002); Первая Всероссийская научная Конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2003); Всероссийская конференция "Тромбозы,
геморрагии, ДВС-синдром, современные достижения" (Москва, 2003); 13th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 2003); 19th International Congress of the Thrombosis and Haemostasis (Бирмингем, Англия, 2003); 14th Международный симпозиум Дунайской лиги по борьбе с тромбозами, нарушениями гемостаза и патологии сосудистой стенки (С-Петербург, 2004); 10th Erfurt Conference on Platelets (Эрфурт, Германия, 2004); Российский национальный конгресс кардиологов (Томск, 2004); 2nd Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2005); Симпозиум "Человек и лекарство" (Москва, 2005); 1 съезд физиологов СНГ (Сочи, 2005); 15th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 2005); Всероссийская конференция "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром, современные достижения", (Ярославль, 2005); 14th International Symposium on Atherosclerosis (Рим, Италия, 2006); World Congress of Cardiology (Барселона, Испания, 2006); 3nd Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно сосудистой хирургии» (Москва, 2007); 16th Всероссийская конференция «Нейроиммунология» И Научно-практическая конференция неврологов (С.Петербург, 2007); Всероссийская конференция «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия (С.-Петербург, 2007); 21st Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Женева, Швейцария, 2007).
