Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Активация тромбоцитов 10
1.2 Гемостатические реакции тромбоцитов 13
1.2.1 Адгезия тромбоцитов 13
1.2.2 Реакция высвобождения 15
1.2.3 Агрегация тромбоцитов 16
1.3 Концентрация и объем тромбоцитов 20
1.4 Оптические методы исследования активации тромбоцитов 22
ГЛАВА 2. Материалы и методы 26
2.1 Выделение тромбоцитов 26
2.1.1 Забор крови в пробирки 26
2.1.2 Забор крови в контейнеры 27
2.2 Определение концентрации тромбоцитов 27
2.3 Лазерный дифракционный анализ дисперсионного состава суспензии тромбоцитов 27
2.3.1 "Mastersizer Micro" - блок схема 27
2.3.2 Восстановление распределения частиц по размерам из картины светорассеяния 29
2.3.2 Объёмная концентрация рассеивающих частиц 31
2.3.3 Экспериментальные условия для вычисления углового распределения рассеянного света 31
2.3.4 Вычисление среднего объёма тромбоцитов 33
2.3.5 Вычисление концентрации тромбоцитов 34
2.3.6 Выбор презентации 34
2.3.7 Вычисление среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов 36
2.4 Исследование агрегационной активности тромбоцитов 37
2.5 Исследование адгезионной активности тромбоцитов 39
2.5.1 Подготовка образцов 39
2.5.2 Визуализация адгезированных тромбоцитов и параметры оценки адгезионной активности клеток 40
2.6 Активация тромбоцитов 41
2.6.1 Добавки АДФ 41
2.6.2 Контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров 42
2.6.3 Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и СР 42
2.6.2 Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и СР в условиях потока 42
2.7 Статистическая обработка данных 43
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 45
3.1 Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека, их агрегационной и адгезионной активностью 45
3.1.1 Добавки АДФ 45
3.1.2 Контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров 52
3.1.3 Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и СР 57
3.1Л Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и СР в условиях потока 65
3.2 Коэффициент преломления тромбоцитов как параметр активации клеток 76
3.2.1 Влияние АИК 76
Заключение 80
Выводы 81
Список литературы
- Гемостатические реакции тромбоцитов
- Определение концентрации тромбоцитов
- Визуализация адгезированных тромбоцитов и параметры оценки адгезионной активности клеток
- Контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров
Введение к работе
Актуальность темы
Гемосовместимость материалов и изделий медицинского назначения во многом определяется реакцией тромбоцитов на чужеродную поверхность, т.к. именно эти клетки играют важную роль в поддержании гемостаза и сохранении агрегатного состояния крови [10, 11, 16], Традиционно функциональное состояние тромбоцитов связывают с протекающими при изменении окружающей среды процессами адгезии, агрегации и высвобождения внутриклеточных биологически активных компонентов [8, 13]. Так, например, адгезия клеток на поверхность имплантата провоцирует реакцию высвобождения тромбоцитарных факторов во внеклеточное пространство, в том числе индукторов агрегации. Это приводит к активации не адгезированных тромбоцитов, что сопровождается интенсификацией процессов адгезии клеток, а также их агрегацией на поверхности и в объеме.
Несмотря на прогресс в изучении механизмов активации тромбоцитов, процессы, протекающие при контакте этих клеток с чужеродным материалом, остаются до конца не изучены. В значительной степени это связано с ограниченностью, трудоёмкостью и иногда недостаточной информативностью имеющихся методологических подходов к изучению свойств и реакций тромбоцитов. В связи с тем, что регистрация активации тромбоцитов в реальном масштабе времени трудно осуществима, функциональное состояние тромбоцитов обычно исследуется до и после того или иного воздействия.
Одним из наиболее информативных методов является исследование характера адгезии клеток с помощью сканирующего электронного микроскопа, что дает возможность одновременно изучать количество и морфологию адгезированных тромбоцитов [15, 16]. Однако эти два параметра не всегда дают полную информацию об изменениях
функционального состояния тромбоцитов. Так например, в потоке, при наличии напряжения сдвига, на поверхности материала не всегда удается найти адгезированные тромбоциты. При этом активированные поверхностью тромбоциты могут накапливаться в циркулирующей крови и состояние клеток, таким образом, будет отличным от исходного [34, 35, 38]. Помимо этого, активированные контактом клетки могут иметь большую адгезионную активность, что может реализоваться в образовании тромбов в застойных зонах.
Широко распространенным методом анализа свойств тромбоцитов, проявляемых в объёме жидкой фазы, является изучение их агрегационной активности [4, 23, 28, 43, 64]. В основе метода лежит регистрация увеличения светопропускания суспензии тромбоцитов под действием физических или химических индукторов. Эффект увеличения светопропускания объясняют уменьшением количества рассеивающих объектов с одновременным увеличением их размеров вследствие агрегации тромбоцитов. Однако изменение светопропускания может быть связано не только с изменением количества рассеивающих объектов, а и с изменением оптических свойств (среднего объёма и коэффициента преломления) единичных клеток.
Методика, разработанная в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава, позволила привлечь метод лазерного дифракционного анализа для измерения среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов в суспензии клеток с известной концентрацией [5, 6]. Полноценное использование оптических характеристик тромбоцитов в качестве параметров оценки их функционального состояния невозможно без понимания их взаимосвязи с такими хорошо изученными свойствами клеток, как агрегация и адгезия, что и обусловливает актуальность данной работы.
Необходимость проведения подобного исследования объясняется ещё и тем, что в дальнейшем это, позволит сопоставить степень активации
клеток с изменением их оптических характеристик, и, таким образом, появится возможность использования оптических характеристик, как дополнительных параметров активации тромбоцитов,
Целью работы является исследование взаимосвязи между адгезионными, агрегационнымп свойствами тромбоцитов и их оптическими характеристиками в условиях in vitro.
Задачи исследования
Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:
Найти оптимальные экспериментальные условия активации тромбоцитов, позволяющие регистрировать изменения их среднего объёма и/или коэффициента преломления и не приводящие к уменьшению концентрации клеток в суспензии за счёт процессов агрегатообразования на поверхности или в объёме;
Исследовать в условиях in vitro влияние поверхности синтетических полимерных материалов и индуктора агрегации тромбоцитов АДФ в малых концентрациях на оптические характеристики тромбоцитов;
Исследовать взаимосвязь между оптическими характеристиками активированных тромбоцитов, их агрегационной и адгезионной активностью;
Продемонстрировать возможность использования оптических характеристик тромбоцитов как параметров, отражающих активацию клеток.
Научная новизна 1. Определены экспериментальные условия активации тромбоцитов чужеродной поверхностью или добавками аденозиндифосфата (АДФ), позволяющие по картине светорассеяния для суспензии клеток вычислять их средний объём и коэффициент преломления.
В условиях in vitro доказано влияние поверхности полимерных материалов в условиях потока и медленного перемешивания на коэффициент преломления тромбоцитов человека.
Обнаружено, что добавки АДФ в малых концентрациях приводят не только к первичной агрегации тромбоцитов в суспензии, но и изменяют оптические характеристики клеток.
Установлена взаимосвязь между оптическими параметрами активированных чужеродной поверхностью или добавками АДФ тромбоцитов и изменением их адгезионных и агрегационных свойств.
Показана возможность использования коэффициента преломления тромбоцитов в качестве параметра, прогнозирующего изменения их адгезионных и агрегационных свойств.
Практическая значимость
Разработана методика, позволяющая регистрировать изменение оптических характеристик тромбоцитов в режиме реального времени при контакте с поверхностью материала в условиях потока. Показано, что методігка обладает достаточной чувствительностью для того, чтобы определять разницу в степени активации тромбоцитов при контакте с различными полимерами.
Исследовано влияние времени контакта с поверхностью материала на средний объём и коэффициент преломления тромбоцитов человека.
Исследована и установлена взаимосвязь между оптическими характеристиками тромбоцитов и их агрегационной и адгезионной активностью в различных модельных системах; малые добавки АДФ, контакт с поверхностью полимерного материала в условиях перемешивания и в условиях потока.
Проведена апробация возможности оценки активации тромбоцитов пациентов по степени изменения коэффициента преломления тромбоцитов до и после использования аппарата искусственного кровообращения (АИК) при операциях на открытом сердце.
Апробация работы
Основные материалы диссертационной работы были представлены на следующих семинарах и конференциях:
- межинститутские семинары Центра по исследованию биоматериалов
ФГУ НИН Трансплантологии и искусственных органов Росздрава
(2002 г., 2003 г., 2004 г.),
XLVI Научная конференция МФТИ, 2003,
XI научно-техническая конференция с участием зарубежных
специалистов «Вакуумная наука и техника» (сентябрь 2004 г., Судак,
Украина),
XXXth Annual Congress of the European Society for Artificial Organs (ESAO) (September 3-6 2003, Aachen, Germany),
XXXlth Annual Congress of the European Society for Artificial Organs (ESAO) (September 8-11 2004, Warsaw, Poland),
Публикации
Результаты проведённых исследований отражены в 8 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, трёх глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключения и выводов. Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 17 таблиц, список литературы из 84 наименовании, из них 13 российских и 71 иностранных.
Место выполнения работы
Работа выполнена в ФГУ Научно-исследовательском институте Трансплантологии и искусственных органов Росздрава (директор — академик РАМН и РАН В.И. Шумаков) в Центре по исследованию биоматериалов (руководитель - д.б.н., профессор В.И. Севастьянов).
Гемостатические реакции тромбоцитов
Адгезия является одним из проявлений биологического процесса, определяющего взаимодействие клеток с чужеродными материлами (при экстракорпоральном кровообращении, с искусственными клапанами сердца и сегментами сосудов и т.д.) [15, 34, 40, 44]. Этот процесс может сопровождаться реакцией высвобождения содержимого внутриклеточных гранул через поверхностно связанную систему открытых каналов [43]. Высвобождение АДФ из плотных гранул стимулирует вторичную агрегацию тромбоцитов и последующее формирование тромба [16, 43, 67, 68].
Специфичность тромбоцитарной адгезии связана прежде всего со способностью клеток присоединяться к поверхности в условиях движущейся системы крови и при действии достаточно высоких сил сдвига [13].
Первым стимулом к началу адгезии является физический контакт тромбоцитов с поверхностью. Важную роль играет напряжение сдвига, которое может вызывать мембранные изменения и активацию тромбоцитов [70, 74, 82]. Контакт тромбоцитов с поверхностью при очень высоких значениях скорости сдвига (до 2000 1/с) кратковременный и обратимый. Большая часть вступивших в контакт с поверхностью клеток может активироваться (изменить размер, ультраструктуру, высвободить часть содержимого гранул) и унестись потоком крови.
При низких значениях, либо в отсутствии скорости сдвига, контакт тромбоцитов с поверхностью более продолжительный, н в месте соприкосновения материала и тромбоцитарной мембраны образуются молекулярные соединения. Существенно изменяется форма кровяных пластинок - клетки становятся более сферическими, появляются отростки
(псевдоподии), некоторые из которых так же вступают в контакт с поверхностью. Затем тромбоцит может либо уйти в объем в таком состоянии, либо остаться на поверхности не изменяя формы, либо дальше активировать сократительную систему вызывающую уплощение клетки и распластывание тромбоцита [13]. Распластанный тромбоцит обычно обозначают как необратимую стадию адгезии. Кроме того, формируются связи с циркулирующими в прилежащей зоне тромбоцитами, что лежит в основе их агрегации и фиксации на поверхности слоя клеток. Этот процесс сопровождается активацией клеток в объеме и секреторными функциями тромбоцитов [8, 13].
Процесс адгезии сложно измерить, но можно оценить по количеству и виду адгез про ванных тромбоцитов и агрегатов с помощью сканирующего электронного микроскопа [20, 31, 78] либо радио изотоп ного метода [10, 48].
Такой метод оценки не всегда дает достаточную информацию о взаимодействии тромбоцитов с материалом. Во-первых, не всегда удается исследовать адгезию клеток в случае реальных систем (например медицинские изделия сложной конструкции на которых нельзя исследовать адгезию не ломая их). Во-вторых, не все активированные тромбоциты необратимо адгезнруют на поверхность. Часть из них находится в объеме. В третьих, в случае «хорошего» материала или присутствии скорости сдвига, большая часть тромбоцитов проконтактировавших с поверхностью уходит в объем, а оставшегося на поверхности количества адгезированных тромбоцитов недостаточно для достоверной оценки материала. Поэтому, тромбоциты забираются из экспериментального устройства контактировавшего с кровью и тестируются на их способность к агрегации и высвобождению содержимого гранул. Такой способ тестирования дает вторичную информацию о влиянии искусственной поверхности на функциональные свойства тромбоцитов, так как он измеряет остаточную способность тромбоцитов агрегировать и высвобождать содержимое гранул. Если рассматриваемая поверхность частично вызывает активацию тромбоцитов, тромбоциты в тестируемой системе уже потеряют часть содержимого своих гранул и будут иметь измененную способность к агрегации и реакции высвобождения. Однако взаимосвязь объемных свойств тромбоцитов (размер, агрегация, секреция) и поверхностных (адгезия) до сих пор не установлена.
Определение концентрации тромбоцитов
Измерение углового распределения рассеянного на суспензии тромбоцитов света проводили на лазерном дифракционном анализаторе "Mastersizer Micro" ("Malvern Instruments Ltd", Великобритания), позволяющем регистрировать в растворе частицы размером 0.3-300.0 цм.
В качестве источника света используется гелий-неоновый лазер с длинной волны 632.8 нм и мощностью 2 - 10 мВт. Диаметр пучка такого лазера около 1 мм, поэтому для получения параллельного пучка света диаметром 5-10 мм, позволяющего осветить необходимое количество образца, в приборе используется расширитель луча. Расширенный луч проходит сквозь образец, находящийся в ячейке между прозрачными параллельными стеклами (расстояние между стеклами 2 мм). Ячейка расположена под небольшим углом к плоскости перпендикулярной направлению луча, так что бы свет, отраженный от стекол ячейки не попадал обратно в лазер. После образца свет проходит сквозь трансформирующую линзу, которая создает изображение картины рассеяния на 32 кольцевидных фотодиодах. Трансформирующая линза преобразует рассеянный в ячейке на различные углы свет, в кольца в плоскости детекторов, причем каждое кольцо соответствует определенному углу рассеяния. Диоды имеют вид колец с общим центром на оси луча. Таким образом, сигнал на определенном детекторе соответствует интенсивности света рассеянного на определенный угол, независимо от расположения рассеивающей частицы внутри ячейки. Не рассеянный свет фокусируется в центре системы диодов, проходит сквозь специальное отверстие и попадает в центральный детектор, расположенный за плоскостью кольцевидных диодов. Такое положение центрального диода необходимо из-за того, что центральное пятно имеет большую интенсивность, и если оно будет фокусироваться на плоскость кольцевых диодов, его отблеск будет увеличивать сигнал фона.
Измерение углового распределения рассеянного света производится автоматически и контролируется с помощью связанного с прибором компьютера. Для расчёта распределения клеток в суспензии по размерам использовали прилагаемое к прибору программное обеспечение, основанное на теории Ми.
С помощью теории Ми, используя некоторые допущения, возможно вычислить картину светорассеяния, зная распределение по размерам рас сей ваго щи х частиц. К сожалению, в нашем случае необходимо решить обратную задачу, которая значительно сложнее. Для ее решения необходимо сделать следующие шаги. В зависимости от имеющихся предположений о распределении частиц, необходимо выбрать одну из трёх моделей анализа: полидисперсную, мультимодальную или мономодальную. Это означает, что истинное распределение частиц по размерам не имеет ярко выраженных экстремумов в первом случае, что таких экстремумов несколько - во втором и всего один - в третьем. Затем следует выбрать один из представленных в программе наборов значений коэффициентов преломления среды и материала частиц, и коэффициента поглощения материала частиц. Набор значений коэффициентов называется презентацией. Выбор модели и презентации осуществляется экспериментатором.
После измерения прибором картины светорассеяния, на основании ее вида, программное обеспечение делает первичное предположение о распределении частиц по размерам используя одно из множества имеющихся в программе. Это распределение называется пробным. Используя выбранные модель и презентацию вычисляется картина светорассеяния, которая наблюдалась бы на частицах имеющих пробное распределение. Вычисленное таким образом угловое распределение рассеянного света сравнивается с экспериментально полученным распределением, и на основании наблюдаемой разницы делаются изменения в пробном распределении частиц по размерам. Картина светорассеяния пересчитывается для нового пробного распределения частиц по размерам. Эта операция повторяется до тех пор, пока разница между экспериментально полученной картиной светорассеяния и вычисленной не достигнет минимума. Пробное распределение частиц по размерам после этого представляется как аппроксимация настоящего распределения по размерам.
Визуализация адгезированных тромбоцитов и параметры оценки адгезионной активности клеток
Для исследования количества и морфологии адгезированных тромбоцитов использовали сканирующий электронный микроскоп JSM Т-330 (JEOL, Япония) и установку для получения оцифрованных изображений AN-10000 (Link Analytical, Англия). Визуализацию адгезированных тромбоцитов проводили при ускоряющем напряжении 5 -10 кВ и токах пучка около 10"ПА. При меньших значениях ускоряющего напряжения резкость получаемого изображения недостаточна для анализа морфологии отдельных адгезированных клеток. При увеличении ускоряющего напряжения затрудняется возможность детектирования полностью распластанных тромбоцитов из-за значительного вклада в сигнал электронов, отраженных из объема образца.
Для количественного анализа на поверхности каждого из образцов произвольным образом выбирали 30 полей размером 28 х 28 мкм (х3500) (или 49 х 49 мкм увеличение 2000). В каждом поле считали количество адгезированных объектов А, разделяя их на 2 класса: сильно активированные формы - агрегаты и распластанные тромбоциты; слабо активированные - одиночные тромбоциты, к которым относили как активированные, так и не активированные одиночные клетки. По всем полям вычисляли общее количество объектов и долю слабо и сильно активированных форм на соответствующей общей площади 25 или 75 тыс. мкм2. В качестве параметра, характеризующего адгезионную активность тромбоцитов использовали общее количество адгезированных тромбоцитов и количество сильно активированных форм клеток,
Для исследования влияния АДФ в малых концентрациях на изменение оптических характеристик и гемо статической активности тромбоцитов, ПОТ разливалась по 600 мкл в 2 стеклянные силиконизированные кюветы, помещавшиеся в измерительные ячейки агрегометра. После начала регистрации сигнала светопропускания производили добавку 0.5 мкМ АДФ (20 мкл 155 мкМ АДФ на 600 мкл ПОТ). После 15 минут инкубации ПОТ из обоих кювет (по 500 мкл) добавляли к 9 мл физиологического раствора и производили измерение картины светорассеяния суспензии методом лазерной дифракции, описанным выше. Из оставшихся по 100 мкл в каждой кювете ПОТ по 40 мкл забирали на исследование адгезионной активности, а оставшиеся 120 мкл (по 60 в каждой кювете) забирали на измерение концентрации.
Для исследования агрегационной активности тромбоцитов после активации в ПОТ, инкубированную с АДФ в концентрации 0.5 мкМ в течение 15 минут, добавляли АДФ в концентрации 5.0 мкМ и регистрировали изменение сигнала светопропускания.
Сразу после получения ПОТ определялись оптические характеристики тромбоцитов, их адгезионная и агрегационная активность. Тромбоцитарный концентрат хранился в пластиковых тромбоцитарных контейнерах BAXTER в специальном шкафу при температуре 20С при постоянном перемешивании. Через 1 час хранения тромбоциты забирали через специальный пробозаборный клапан контейнера для исследования оптических характеристик клеток и их гемостатической активности.
Сразу после получения ПОТ определялись оптические характеристики тромбоцитов, их адгезионная и агрегационная активность. ПОТ разливалась в трубки (внутренний диаметр 5 мм, длина 30 см), изготовленные из ПВХ и СР по 5 мл с интервалом в 30 минут. Трубки находились в вертикальном положении при комнатной температуре, при этом они переворачивались каждые 10 минут. Через 2 часа хранения содержимое трубки сливалось в силиконизированный стеклянный бюкс для дальнейшего исследования оптических характеристик клеток и их гемостатической активности.
Монтировался замкнутый контур с магистралями из ПВХ или СР трубок, проходящий через измерительную ячейку лазерного анализатора размеров частиц. Производилось заполнение контура физиологическим раствором объёмом 18 мл и измерение сигнала фона. ПОТ добавлялась к физиологическому раствору в адекватном количестве (обычно около 2 мл) для получения конечной концентрации тромбоцитов в суспензии в диапазоне 10-50 тыс./мкл. Циркуляция по трубкам и через измерительную ячейку прибора Mastersizer осуществлялась при помощи перистальтического насоса (расход 10 мл/мин). При этом сдвиговая скорость составляла 30 1/с. В процессе циркуляции тромбоцитов измерялась картина рассеянного на тромбоцитах лазерного света с частотой 2 раза в минуту. Циркуляция продолжалась до 180 минут. С интервалом 30 минут пробы образца забирались из контура микропипеткой с пластиковым наконечником для исследования адгезионной (5.0 мкМ АДФ) и адгезионной активности.
Таким образом, схему исследования взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их адгезионной и агрегационной активностью в упрощённом виде можно представить следующим образом: 1. Исследование адгезионных, агрегационных свойств тромбоцитов человека, их концентрации и оптических характеристик непосредственно после выделения тромбоцитов (контроль). 2. Активация тромбоцитов: добавки 0.5 мкМ АДФ, контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров, контакт ПОТ с поверхностью ПВХ и СР трубок в условиях медленного перемешивания, контакт суспензии тромбоцитов с малой концентрацией с поверхностью ПВХ и СР трубок в условиях потока. 3. Исследование адгезионных, агрегационных свойств тромбоцитов человека, их концентрации и оптических характеристик после активации тромбоцитов способами, перечисленными в пункте 2. 4. Сопоставление гемостатической активности тромбоцитов до и после активации, сравнение оптических характеристик клеток.
Контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров
Коэффициент преломления тромбоцитов ведёт себя достаточно стабильно на протяжении первых 20 минут циркуляции для магистралей из СР и 30 минут циркуляции для магистралей из ПВХ. Затем начинается его постепенное уменьшение. Значимые различия (п = 5, р = 0.05) в значениях коэффициента преломления для магистралей разных типов наблюдаются уже к 40 минутам циркуляции. Такая тенденция в значимом различии наблюдается вплоть до 120 минут циркуляции в контуре. Видно, что скорость уменьшения коэффициента преломления больше при циркуляции в контуре с магистралями из силиконовой резины и составляет 0.010±0.002 1/час, в то время как в контуре из поливинилхлорида коэффициент преломления уменьшается со скоростью 0,006±0.002 1/час.
Средний объём тромбоцитов имеет тенденцию к уменьшению от, однако значимых различий в зависимости от материала не наблюдается.
На трёх донорах было так же исследовано изменение агрегационной и адгезионной активности тромбоцитов параллельно с определением оптических характеристик клеток при контакте с поверхностью ПВХ и СР в условиях потока. Во всех трёх случаях наблюдались сходные тенденции в изменении оптических характеристик тромбоцитов, их адгезионной и агрегационной активности. Для демонстрации обнаруженного эффекта ниже будут приведены результаты одного эксперимента.
Поскольку функциональное состояние тромбоцитов одного донора может зависеть от многих факторов, клетки могут иметь различную степень индивидуальной реакции даже на одно и то же воздействие. В качестве критериев для проведения эксперимента на тромбоцитах одного донора в разные дни, явились результаты предварительной оценки оптических характеристик тромбоцитов, их агрегационной и адгезионной активности непосредственно после процедуры выделения (таблица 11).
На рисунке 17 приведены зависимости изменения среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов донора при циркуляции в контурах с магистралями из ПВХ и СР. Коэффициент преломления клеток ведёт себя достаточно стабильно на протяжении 20 минут для СР и 40 минут для ПВХ. Затем начинается его постепенное уменьшение вплоть до 100 минут для СР и 160 минут для ПВХ. Дальнейшее уменьшение коэффициента преломления не наблюдается. Скорости уменьшения коэффициента преломления отличаются для различных материалов и составляют 0.010±0.002 1/час для силиконовой резины и 0.007±0.002 1/час для поливнннлхлорида. Средний объём тромбоцитов изменяется с первых минут циркуляции. Значимое уменьшение среднего объёма заканчивается к 90 минутам циркуляции и составляет 0.5±0.2 им3 для обоих материалов. При этом на данном доноре не было зарегистрировано влияние природы материала на характер изменения среднего объёма тромбоцитов.
Значения концентрации тромбоцитов, полученные на гематологическом анализаторе, контролировались путем непосредственного подсчёта клеток в камере Горяева. Значения приведены в таблице 12.
Достоверных различий для значений концентрации тромбоцитов до начала и через 3 часа циркуляции не выявлено. Это свидетельствует о том, что изменение функционального состояния тромбоцитов происходит в результате активации клеток, не сопровождающейся процессами спонтанной агрегации или адгезии, которые приводили бы к уменьшению концентрации объектов в объёме жидкой фазы. При этом значения для концентрации, полученные при помощи гематологического анализатора можно считать вполне удовлетворительными.
С интервалом в 30 минут (за исключением точки 150 минут) исследовалась агрегационная и адгезионная активность тромбоцитов. В таблице 13 приведены значения степени агрегации тромбоцитов при добавке 5.0 цМ АДФ.
Из таблицы видно, что степень агрегации, отражающая агрегационную активность тромбоцитов, снижается при увеличении времени циркуляции. Видно, что реальная агрегация тромбоцитов, за счёт слипания и образования агрегатов, происходит лишь на временах до 90 минут, о чём свидетельствует изменение концентрации клеток после добавок АДФ.
При анализе адгезионной активности тромбоцитов, циркулирующих в контуре из СР заметно увеличение сильно активированных форм и общего количества клеток на поверхности ПЭНП к 60 минутам циркуляции. Точки 90, 120 и 180 минут по адгезионной активности не отличаются.
При циркуляции в контуре с магистралями из ПВХ разница в адгезионной активности заметна лишь к 90 минутам циркуляции, при этом адгезионная активность продолжает расти вплоть до 180 минут циркуляции. При этом происходит увеличение количества сильно активированных форм клеток, что и обеспечивает увеличение общего количества адгезированных тромбоцитов.
Принимая во внимание предыдущие данные, логичным будет сделать заключение о том, что в результате активации и в этом случае так же наблюдается увеличение адгезионной активности тромбоцитов, наряду с уменьшением их агрегационной активности и уменьшением коэффициента преломления клеток.
Похожие диссертации на Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их агрегационной и адгезионной активностью
