Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 10
1.1. Строение и основные функции роговицы 10
1.1.1 .Строение и функции эпителия роговицы 10
1.1.2.Строение и функции стромы роговицы 13
1.1.3. Строение и функции эндотелия роговицы 15
1.2. Взаимодействия между слоями роговицы 18
1.2.1. Эндотелиалыю-стромальные взаимодействия 19
1.2.2. Взаимодействия между стромой и эпителием роговицы 19
1.3. Процессы ранозаживления в роговице 27
1.3.1 Общая последовательность процессов, протекающих в ходе ранозаживления 27
1.3.2. Клеточные источники регенерации роговицы 29
1.3.3. Ранозаживление в эпителии роговицы 35
1.3.4. Процессы ранозаживления в строме роговицы 38
1.3.5. Процессы ранозаживления в эндотелии роговицы 45
1.4. Регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах 47
Глава 2 Материалы и методы 52
2.1. Приготовление экстракта ткани роговицы 52
2.2. Приготовление супернатанта экстракта ткани роговицы 52
2.3. Получение фракций экстракта ткани роговицы и супернатанта методом изоэлектрофокусирования 52
2.4. Определение концентрации белка 53
2.5. Электрофорез белков в полиакриламидиом геле 54
2.6. Обращешю-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 55
2.7. Определение вторичной структуры с помощью метода кругового дихроизма 56
2.8. Исследование частиц в водном растворе РБР методом динамического светорассеяния 56
2.9. Определение радиуса частиц, присутствующих в растворе РБР, методом атомно-силовой микроскопии 59
2.10. Определение влияния растворов, содержащих РБР, на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мышипри кратковременном органном культивировании in vitro 59
2.11. Получение кроличьей поликлоналыюй антисыворотки 60
2.12. Иммуноферментный анализ антител (ELISA) 60
2.13. Иммуногистохимическое исследование локализации белка с использованием F1TC -конъюгированных антител 62
2.14. Культивирование роговицы 63
2.15. Приготовление гистологических срезов 63
2.16. Нанесение разреза роговицы 66
2.17. Исследование клеточной пролиферации методом радиоавтографии 66
Глава 3. Результаты и их обсуждение 69
3.1. Выделение и очисткарегуляторных белков, выделенных из роговицы глаза быка...69
3.2. Биотестирование фракций РБРв процессе очистки 74
3.3. Исследование РБР- фракции методом кругового дихроизма 80
3.4. Исследование методами динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии размеров и формы частиц, присутствующих в водном растворе регуляторного белка роговицы 81
3.5. Исследование локализации регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка 89
3.6. Исследование влияния регуляторных белков, выделенных из роговицы глаза быка, на состояние роговицы тритона в условиях роллерного культивирования in vitro 93
3.7. Влияние С-РБР на состояние роговицы тритона при органном культивировании на подложке в условиях in vitro 106
3.8. Влияние С-РБР на состояние роговицы крысы при роллерном органном культивировании в условиях in vitro 113
3.9. Влияние С-РБР на состояние роговицы крысы в условиях культивирования на подложке in vitro 117
3.10. Исследование влияния С-РБР на клеточную пролиферацию эпителия роговицы тритона после нанесесения экспериментального разреза в условиях in vivo 121
Глава IV. Общее обсуждение 126
Выводы 134
Список литературы
- Строение и функции эндотелия роговицы
- Получение фракций экстракта ткани роговицы и супернатанта методом изоэлектрофокусирования
- Исследование РБР- фракции методом кругового дихроизма
- Влияние С-РБР на состояние роговицы крысы в условиях культивирования на подложке in vitro
Введение к работе
Актуальность работы. Важнейшей функцией роговицы глаза является проведение и преломление светового потока, для чего необходимо поддержание ее определенных оптических свойств - прозрачности и коэффициента преломления. В то же время роговица участвует в формировании передней стенки глаза, непосредственно контактирует с окружающей средой и испытывает влияние различных физико-химических факторов, действие которых часто является неблагоприятным и приводит к ее повреждению. В связи с этим травмы и сопутствующие им заболевания роговицы являются одними из самых распространенных патологий глаза человека.
В силу данных обстоятельств изучение процессов восстановления и репарации, лежащих в основе ранозаживления роговицы, представляет собой актуальную проблему современной биологии и офтальмологии. Одним из важнейших путей разрешения данной проблемы является поиск новых соединений, участвующих и регулирующих такие биологические процессы, как адгезия, миграция, дифференцировка и пролиферация клеток. Среди этих веществ вызывают интерес регуляторпые белки (РБ), проявляющие биологическую активность в сверхмалых дозах (СМД). Белки данной группы были обнаружены в различных тканях животных и растений (Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999; Краснов и др., 20036), в том числе в таких тканях глаза, как нейральная сетчатка и пигментный эпителий (Краснов и др., 2003а). Установлено, что РБ в СМД оказывают влияние на ход и направленность важнейших биологических процессов: РБ влияют на адгезию, дифференцировку клеток сетчатки и пигментного эпителия и увеличивают их жизнеспособность. Биологическая активность РБ тканей глаза характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности. При исследовании РБ данной группы был разработан новый экспериментальный подход, применение которого позволяет идентифицировать РБ в различных тканях.
8 Целью настоящей работы явилась идентификация в роговице глаза позвоночных
животных РБ, биологически активного в СМД, а также исследование его физико-химических свойств и биологической активности. В отдельные задачи исследования входили:
идентификация в роговице глаза быка РБ, биологически активного в СіМД;
изучение физико-химических свойств РБ роговицы;
изучение локализации РБ роговицы в тканях глаза позвоночных животных с помощью методов иммуногистохимии:
изучение влияния РБ роговицы на клеточную пролиферацию на модели механической травмы роговицы глаза тритона in vivo;
разработка новых экспериментальных моделей in vitro для изучения специфической биологической активности РБ роговицы;
изучение влияния РБ роговицы на состояние ткани роговицы глаза позвоночных животных условиях in vitro.
Новизна работы. Впервые в роговице глаза млекопитающих обнаружен новый кислый белок, проявляющий биологическую активность в дозах, соответствующих 10"10 - 10"12 мг белка/мл. Были изучены некоторые физико-химические свойства данного белка. Показано, что данный белок имеет небольшую молекулярную массу - менее 10 кДа, характеризуется высокой резистентностью к воздействию ряда физико-химических факторов (изменению в широком диапазоне значений температуры, рН, ионной силы растворов, воздействию хелатирующих ионы металлов агентов, органических растворителей, действию различных протеаз и др.). На модели экспериментально нанесенной травмы роговицы глаза тритона in vivo, было показано, что РБ, выделенный из роговицы глаза быка, в СМД стимулировал пролиферацию эпителиальных клеток. Для изучения специфической активности РБ роговицы были разработаны новые экспериментальные модели in vitro, представляющие собой роллерные и стационарные
культуры целых роговиц глаз позвоночных животных. Впервые было показано, что при
роллерном культивировании роговицы глаза амфибий происходит активация резервного клеточного отдела этой ткани, которая отражается в стимуляции эпителизации роговицы. По сравнению с контролем изучаемый РБ роговицы в СМД стимулирует данные процессы. Таким образом, впервые показано стимулирующее влияние эндогенного биорегулятора в СМД на клеточный резервный отдел ткани взрослых особей позвоночных животных.
Практическая значимость. Полученные в работе результаты, во-первых, способствуют пониманию механизмов, лежащих в основе восстановительных и репаративных процессов, идущих в травмированных или патологически измененных тканях, а потому могут быть включены в специальные курсы лекций, касающихся проблемы ранозаживления, в частности, в роговице глаза позвоночных животных и человека. В ходе исследования было впервые применено роллерное культивирование роговиц тритона и крысы; данная модель может быть использована для изучения воздействия различных физико-химических факторов на ткань роговицы.
Учитывая результаты исследования, показавшие стимулирующее действие изучаемого РБ на процесс эпителизации роговицы, а также данные, полученные при исследовании локализации данного белка в ткани, на его основе предполагается разработать новый офтальмологический препарат, который будет эффективен при лечении кератопатий различной этиологии.
Строение и функции эндотелия роговицы
Строма имеет мезенхимное происхождение и составляет наиболее значительную часть роговицы. Показана экспрессия фибробластами стромы человека CD34 - маркера гемопоэтических клеток костного мозга, что дает основание предположить происхождение клеток эмбриональной стромы именно из этого источника (Toti et al., 2002, Joseph et al., 2003). В строме роговицы мыши не все клетки экспрессируют данный маркер (Sosnova et al., 2005). Авторы данного исследования показали, что антитела к этому маркеру преимущественно окрашивают макрофаги, но не фибробласты стромы. Основная масса клеточных элементов стромы представляет собой уплощенные фибробласты (кератоциты), которые синтезируют коллаген, накапливающийся в виде пластинчатых структур - ламелл, а также секретируют компоненты межклеточного матрикса, например, протеогликаиы (Fitch et al., 1988). При ранозаживлении в строме обнаруживаются также фибробласты веретеновидной формы (см. также раздел 1.3.4). Плотность кератоцитов в центре роговицы существенно ниже, чем на периферии. Среди данной популяции клеток выделяют особую небольшую группу кератоцитов, положительных по a-SMA (а-актину гладкой мускулатуры). Кроме a-SMA, в данной популяции клеток отмечена экспрессия кристаллинов роговицы, обеспечивающих прозрачность клеток (Jester et аі., 1999а). Такие кератоциты (миофибробласты) имеют веретеновидную форму и локализованы в субэпителиальном слое стромы, в том числе, в центральной ее части (Moller-Pedersen, 1998). Количество миофибробластов значительно увеличивается при ранозаживлении травмированной роговицы, предполагается, что они участвуют в процессе стягивания краев раны (Jester et al., 1999b). Наряду с фибробластами, в строме роговицы присутствуют лейкоциты, обнаруживаемые с помощью иммунохимической реакции на CD45 и CDllb. Часть лейкоцитов постоянно присутствует в строме, они называются резидентными лейкоцитами (дендроцитами, клетками Лангерганса) и относятся к системе моноцитов/макрофагов, при воспалении к ним добавляются мигрирующие лейкоциты. В строме роговицы мыши количество резидентных макрофагов невелико (Brissette-Storkus et al., 2002), в роговице других видов, таких как кролик и человек, их больше (Vantrappen et al., 1985; Williams et al., 1986). Эти клетки практически отсутствуют в центральной части роговицы и в небольших количествах обнаруживаются на ее периферии (Gillette et al.,1982; Jager, 1992). Дендроциты имеют ряд функциональных отличий от прочих макрофагов и играют ведущую роль в инициации антигенспецифического и вторичного иммунного ответа. Макрофаги, мигрирующие в роговицу при воспалении, главным образом выполняют роль эффекторных клеток при развитии клеточного иммунного ответа, а также участвуют в процессах тканевой реорганизации (Hamrah et al., 2003).
В срединной части стромы роговицы обнаружены коллагены I, V, VI, XII, XIII и XIV типов, причем наиболее представлены I и V типы, входящие в состав ламелл, образованных кератоцитами (Fitch et al.,1988; Michelacci, 2003). У тритонов Triturus cristatus количество коллагеновых ламелл, образованных кератоцитами роговицы, более 40. Ламеллы погружены во внеклеточный матрикс. Коллагеновые волокна в них располагаются параллельно поверхности роговицы и под некоторым углом к волокнам соседней пластинки. Кроме того, в некоторых случаях, возможен «переход» волокон в соседние пластинки и связывание ламелл между собой (Margaritis et al., 1976).
Следует особо отметить аваскулярность стромы (Зиангирова, Олиневич, 2000). Отсутствие полостей в строме является непременным условием ее оптической однородности, приводящей к одинаковому преломлению светового потока в разных ее частях. В связи с аваскулярностью стромы транспорт питательных веществ в роговице осуществляется в основном через ее эндотелиальный, а также эпителиальный слои. Важную роль в осуществлении трофической функции клеток роговицы играет также аксопальный транспорт в аксонах нейронов, подходящих к роговице. По этому механизму осуществляется перемещение белков, полипептидов, фосфолипидов, медиаторов и их предшественников, а также происходит удаление из клетки метаболитов (Зиангирова, Олиневич, 2000). Боуменова и десцеметова мембраны, соответственно, отделяющие строму, от эпителия и эндотелия, характеризуются рядом отличий от срединной части стромы. Так, фибробласты, расположенные в боуменовой мембране, имеют нитевидную форму, в отличие от округлых уплощенных кератоцитов стромы (Ruggeri, Pajaro, 2002). Различия наблюдаются также в структуре межклеточного матрикса: в боуменовой мембране присутствуют коллагены VII и XVIII типов, а в десцеметовой - коллаген VIII, отсутствующие в других слоях стромы (Michelacci, 2003); дополнительной особенностью боуменовой мембраны является то, что коллагеновые волокна, входящие в ее состав, не образуют упорядоченной ламеллярной структуры. Десцеметова мембрана амфибий по сравнению с таковой у млекопитающих характеризуется меньшей толщиной (0,74 мкм у Triturus cristatus по сравнению с 3,5 мкм у кролика и 5 - 10 мкм у человека) (Margaritis et al., 1976), а боуменова мембрана вовсе отсутствует (Margaritis et al., 1976, Hayashi et al., 2002).
Получение фракций экстракта ткани роговицы и супернатанта методом изоэлектрофокусирования
К части экстракта ткани (150 мл) при перемешивании при комнатной температуре добавляли сульфат аммония до образования насыщенного раствора соли. Высаливание белков проводили в течение 72 часов при t=+4C, после чего осажденные белки отделяли центрифугированием в течение 30 мин на скорости 15000 g при t = +4С. Осадок, содержащий альбумины, глобулины и некоторые другие белки, чувствительные к действию концентрированных растворов солей, далее не исследовали. Супернатант экстракта ткани роговицы диализовали против дистиллированной воды с добавлением азида натрия для удаления низкомолекулярных примесей и сульфата аммония в течение 10 дней. В течение последних 48 часов перед снятием диализных мешков азид натрия в дистиллированную воду не добавляли. Полученный бессолевой супернатант экстаркта сохраняли при t = - 70С.
Часть экстракта роговицы глаза общим объемом 150 мл разделяли с помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте сахарозы на колонке LKB-440 с использованием амфолинов Serva (Germany) диапозона рН 3,5-10,5. Изоэлектрофокусирование проводили в течение 90 часов при t = + 4 С при напряжении 500 - 2000 В (Ямскова, Резникова, 1991). Белковые фракции собирали до объема 3-4 мл, детектировали спектрофотометрически при 280 нм, что соответствует максимуму поглощения для ароматических аминокислот, и определяли для каждой фракции значение рН. Основываясь на результатах спектрофотометрических исследований, мы собрали для дальнейшего исследования фракцию кислых белков со значением рН менее 3,5. Фракцию кислых белков упаривали до объема 5 мл в вакууме при t = 40-45 С. Супернатант экстракта роговицы подвергали разделению с помощью ИЭФ в условиях, описанных выше. Для исследования собирали фракцию кислых белков со значением рН менее 3,5, упаривали до объема 5 мл в указанных выше условиях. Определение концентрации белка
Количественное определение белка в исследуемых фракциях осуществляли с помощью колориметрического метода с использованием бицинхоната меди при 562 нм (Smith и др., 1985). Для этого готовили два раствора: Раствор А - 1 г бицинхониновой кислоты, 2 г СОз, 0,16 г тартрата натрия, 1 г NaOH, 0,95 г NaHCCh в 100 мл дистиллированной воды (рН—11,25); Раствор Б - 0,4 г CuS04 5H20 в 10 мл дистиллированной воды.
Непосредственно перед проведением опыта готовили третий раствор В, смешивая 50 мл раствора А с 1мл раствора Б. Для определения концентрации белка к 50 мкл исследуемого раствора прибавляли 1мл раствора В, инкубировали пробы 30 минут при 60 С, затем охлаждали до комнатной температуры. Поглощение измеряли при 562 нм. Для построения калибровочной кривой вначале готовили растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрациях: 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 250, 500, 750, 1000 мкг/мл. К 50 мкл раствора БСА известной концентрации добавляли 1 мл раствора В, полученные пробы инкубировали, измеряли поглощение по описанной выше методике и строили калибровочную кривую согласно результатам измерений. По построенной калибровочной кривой определяли концентрацию белков в исследуемых растворах.
Электрофорез в 15 и 20%-ном полиакриламидпом геле проводили в денатурирующих условиях по методу Лэмли (Laemmli, 1970), используя прибор для вертикального электрофореза Mini vertical gel system EC 120 (США) (толщина геля - 0,75 мм, размер 8 см х 10 см). Окрашивание гелей проводили с помошью красителя Кумасси G-250 фирмы Eastman (США) (Wilson, 1983).
В состав разделяющего 15%-ного полиакриламидпого геля входили следующие компоненты: мономерный раствор (массовые доли акриламида 30,8 %, бис-акриламида 2,7 %) - 7,5 мл, Трис - буфер (1,5М Трис-HCl, рН 8,8) - 3,8 мл, 10% -ный раствор додецилсульфата натрия - 0,15 мл, бидистиллированная вода - 3,6 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 75 мкл, ТЕМЭД (тетраметилэтилендиамин) - 5 мкл. В состав 7,5%-ного разделяющего геля толщиной 0,75 входили: дистиллированная вода - 3,6 мл, 10% додецилсульфат натрия (Serva) - 0,15 мл, персульфат аммония (Fluka) - 75 мкл, ТЕМЭД (Reanal) - 0,5 мкл, мономерный раствор акриламида (Reanal) - 7,5 мл и буфер для разделяющего геля 3,8 мл. Концентрирующий 4%-ный полиакриламидный гель содержал: мономерный раствор - 0,44 мл, раствор буфера (0,5 М Трис - НС1, рН 6,8) -0,83 мл, 10%-ный раствор додецилсульфата натрия - 33 мкл, бидистиллированпую воду-2,03 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 16,7 мкл, ТЕМЭД - 1,7 мкл. Электродный буфер содержал: 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % додецилсульфат натрия (рН 8,3).
Исследование РБР- фракции методом кругового дихроизма
Несмотря на то, что данные, полученные с помощью метода электрофореза, свидетельствуют о низкой молекулярной массе белков фракции РБР, при диализе ее компоненты не проходили через мембраны, пропускающие молекулы с молекулярной массой 5-8 кДа, поскольку биологическая активность данной фракции в СМД после диализа не изменялась. В связи с этим представлялось возможным изучить вторичную структуру белков данной фракции с помощью метода кругового дихроизма вторичной структуры, используя программу k2d для рассчета полученных результатов (Venyaminov, Yang, 1996). Было показано, что во вторичной структуре белков, входящих во фракцию С-РБР преобладают (3-структуры, составляющие около 50 %, а-спираль представлена приблизительно 20 %, статистический клубок составляет около 30% (рис. 3.4.1). Эти данные указывают на значительное сходство вторичной структурой РБР и РБ, выделенных из других тканей позвоночных животных (Ямскова и др., 2004; Рыбакова, 2005). Таким образом, сходство между белками фракции РБР и другими РБ, проявляющими биологическую активность в СМД, прослеживается в проявлении ими ряда физико-химических свойств: низкое значение молекулярной массы (менее 10 кДа), высокая резистентность к действию различных физико-химических факторов (высокие и низкие температуры, воздействие деионизованной среды и органических растворителей). Следует отметить, что согласно литературным данным, преобладание (3-структур во вторичной структуре белков указывает на их способность к образованию в водных растворах высокомолекулярных ассоциатов (Ross, Poirier, 2004). Такое свойство было отмечено у белков фракции РБР, как и у РБ, выделенных из других тканей (Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999, Ямскова и др., 2003). Изучению этого свойства белков, фракции РБР было посвящено отдельное исследование, проведенное с помощью метода динамического светорассеяния.
В водных растворах РБР присутствуют частицы размером, близким к 100 нм. Полученные данные далее были приняты в качестве основы для оценки истинного размера частиц РБР в водном растворе при величине угла рассеяния 0 и их распределения, которое проводили согласно приведенных в литературных источниках подходов (Provencher, 1985). Был построен график зависимости величины, обратной гидродинамическому радиусу, от квадрата синуса половинного угла рассеяния // = f(sin26/2) с использованием программы Origin 7.0. Графическое экстраполирование усредненных данных позволяет оценить истинную величину гидродинамического радиуса частиц при величине угла рассеяния 0 как 130,55±12,4 нм (рис. 3.4.3). Полученная величина гидродинамического радиуса частиц в водном растворе РБР значительно превышает значения данной величины, измеренные для других, более крупных, белков. Так гидродинамический радиус геликазы RecQI человека, имеющей молекулярную массу 158 кДа составляет 5,4±0,6 нм (Cui et al., 2004), для фибриногена (молекулярная масса 340 кДа) - 10,95 нм, для миозина lb (молекулярная масса 213 кДа) 27,9 нм (Armstrong et al., 2004). Для низкомолекулярных белков и пептидов описано также образование в водных растворах значительно более крупных частиц. Так, FGF-2, имеющий молекулярную массу 15 кДа образует в растворах с концентрациями растворенного вещества 0,1-1 мг/мл димеры или тримеры с гидродинамическим радиусом 90 нм, а при концентрациях FGF-2 менее 0,1 мг/мл - ассоциаты с гидродинамическим радиусом 80-100 нм (Onuma et al., 2004). . Гидродинамический радиус частиц в водном растворе фракции кислых (рН 3,5) белков супернатанта экстракта ткани роговицы глаза быка (С-РБР) после электрофореза в ПААГ (по данным динамического светорассеяния). По оси абсцисс - квадратичное значение синуса половинного угла рассеяния;
По оси ординат - значение гидродинамического радиуса, нм. Полученные при проведении данного исследования результаты можно обсудить следующими образом. Рассчитанная для частиц водного раствора РБР на основе эксприментальных данных величина Rh свидетельствует о существовании в водных растворах высокомолекулярных ассоциатов, размеры которых соответствуют так называемым наночастицам. В этом аспекте следует отметить, что исследование наноструктур является актуальным направлением современных естественных наук, количество публикаций за месяц по данной проблеме исчисляется сотнями, но при этом многие закономерности, лежащие в основе нанотехнологии, остаются до сих пор не выясненными. Тем не менее, во всех работах, касаются ли они результатов химических исследований (например, Cui et al., 2004), или полученных при проведении экспериментов в области биологии (например, Olivier, 2005), отмечается, что вещества в виде наноразмерных частиц (10-1000 нм) обладают уникальными физико-химическими характеристиками и биологическим действием (Рамис, 2005). Более того, в некоторых статьях подчеркивается сходство наноразмерных структур, образовавшихся в различных водно-белковых системах in vitro и in vivo (Рамис, 2005), а сам феномен образования таких частиц рассматривается как проявление общего свойства материи к самоорганизации в неравновесных системах (Рамис, 2006).
Для оценки формы присутствующих в водном растворе РБР частиц было проведено вычисление квадратичного инерционного радиуса Rg на основании данных, полученных при измерении интенсивности светорассеяния при различных значениях угла рассеяния. В отдельной серии экспериментов определяли значение Iрастворителя при 25, составившее 400 Гц; затем по формулам (4) и (6) (см. раздел 2.8) вычисляля квадратичное значение волнового вектора q и избыточной интенсивности 1изо. Полученные результаты приведены в таблице 3.4.2.
Влияние С-РБР на состояние роговицы крысы в условиях культивирования на подложке in vitro
Извлеченные из культуралыюй среды роговицы представляли собой сфероиды, образованные за счет сближения края роговицы. Роговицы как в экспериментальной серии, так и в контроле состояли из трех слоев. В роговицах контрольной серии можно было выделить эпителий, строму и эндотелий, однако, по краю роговицы происходила миграция эпителиальных клеток на внутреннюю поверхность роговицы и их последующее увеличение их количества (рис. 3.6.2.1). Эти клетки постепенно замещают эндотелиальный слой на периферии роговицы так, что внутренняя поверхность роговицы после 7 сут культивирования оказывалась покрытой двумя типами клеток: эндотелиальными в центральной части и эпителиальными па периферии (среднее число клеточных слоев эпителия здесь составило 2,36±0,43).
В роговице тритона опытной серии процесс замещения эндотелия эпителиальными клетками к окончанию срока культивирования был полностью завершен. В роговицах удавалось выделить три сформированных слоя - наружный (исходный) эпителиальный, строму и внутренний эпителиальный (вновь образованный). Относительная толщина слоев роговицы и количество слоев эпителиальных клеток приведены в таблице 3.6.2.1. Полученные данные показывают, что число слоев эпителиальных клеток наружного слоя в опыте и в контроле достоверно не различаются (р 0,05), но они выше, чем в интактной роговице. В то же время, относительная толщина наружного эпителиального слоя в опыте достоверно выше, чем в контроле. Эти данные, с одной стороны, указывают на увеличение количества эпителиальных клеток в роговицах тритонов с сохраненной областью лимба в условиях роллерного органного культивирования, а с другой стороны, на стимуляцию С-РБР пролиферации эпителиальных клеток. Эти данные подтверждаются результатами, полученными при культивировании роговиц тритонов без сохранения области лимба (см. раздел 3.6.2 и таблицу 3.6.2.1). Были обнаружены достоверные отличия в относительной толщине стромы роговиц опытной и контрольной серий - в опыте средняя толщина стромы была приблизительно в 1,2 раза меньше, чем в контроле. Следует отметить, что культивирование роговиц глаза тритонов без сохранения области лимба приводило к достоверному увеличению относительной толщины стромы по сравнению с интакной роговицей и роговицами, культивированными с сохранением области лимба (данные контроля, таблица 3.6.2.1). Полученные данные указывают на то, что условия роллерного культивирования роговицы тритона с сохранением области лимба способствуют поддержанию ее гистоструктуры. В опытных сериях, как при сохранении области лимба, так и без данной области относительная толщина стромы была достоверно меньше (р 0,05), чем в соответствующих контрольных сериях и достоверно не отличались от иптактной роговицы (р 0,05). Эти результаты можно объяснить тем, что в условиях роллерного культивирования при сохранении области лимба в роговице тритона поддерживается се тканевая структура, а С-РБР способствует этому.
Но наиболее значительным результатом, демонстрирующим качественные различия между роговицами опытной и контрольной серий, является появление внутреннего эпителиального слоя в роговицах, подвергавшихся воздействию С-РБР. На наш взгляд, различия в толщине стромы могут быть связаны с образованием дополнительного внутреннего эпителиального слоя, который снижает степень гидратации стромы за счет изолирования ее от культуралыюй жидкости, а также уменьшает ее относительную толщину за счет собственной протяженности.
Полученные в этой серии опытов данные свидетельствуют о том, что С-РБР стимулирует процессы миграции клеток, относящихся к области лимба, и их последующей пролиферации. Ни в одной экспериментальной серии, кроме той, где роговицы, выделенные с областью лимба, подвергались воздействию С-РБР, цельный, полностью сформированный внутренний дополнительный слой клеток эпителия не образовывался. Источником образования этого дополнительного слоя с большой степенью вероятности являются клетки лимба, испытавшие воздействие С-РБР.
Таким образом, проведенная серия экспериментов показала, что С-РБР оказывает влияние прежде всего на клетки эпителия области лимба и, возможно, краевой области роговицы.
Следует отметить, что приведенные в табл. 3.6.2.1 результаты были пролучены в экспериментах, которые проводили при 18 С, однако, известно, что у пойкилотермных организмов, к которым относятся тритоны, скорость протекания процессов жизнедеятельности зависит от температуры окружающей среды. Мы предположили, что повышение температуры культивирования роговиц тритона может дополнительно стимулировать миграцию и пролиферацию эпителиальных клеток роговицы. В связи с этим предположением была проведена серия опытов по исследованию влияния С-РБР на состояние роговицы, выделенной из глаза с сохраненной областью лимба, в условиях органного культивирования при 22 С.
Ожидалось, что при культивировании при 22 С процессы замещения эндотелия на внутренней поверхности роговицы клетками эпителия будут завершены как в опыте, так и в контроле. Это позволило бы получить результаты также по относительной толщине и количеству слоев клеток во внутреннем дополнительном слое эпителия роговицы. Полученные данные представлены в таблице 3.6.2.2.
