Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о гидролитических ферментах 8
1.1. Основные характеристики карбогидраз 8
1.2. Физико - химические свойства инулиназы 13
Глава 2. Иммобилизация гидролитических ферментов 25
2.1. Методы иммобилизации гидролаз 25
2.2. Применение иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине и аналитической практике 31
2.3. Иммобилизация инулиназы на различных носителях 37
Глава 3. Объекты и методы исследования 43
3.1. Объект исследования 43
3.2. Методы исследования 43
3.2.1. Культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus 43
3.2.2. Определение содержания белка в препарате методом Лоури 44
3.2.3. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментных препаратах модифицированным методом Лоури 45
3.2.4. Метод определения активности инулиназы 46
3.2.5. Метод определения активности иммобилизованной инулиназы 48
3.2.6. Очистка и определение молекулярной массы инулиназы методом гель-хроматографии 49
3.2.7. Подготовка ионообменных материалов к иммобилизации 50
3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации инулиназы 51
Глава 4. Выделение, очистка, физико-химические свойства препаратов инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori 52
4.1. Исследование условий экстракции и очистки препарата инулиназы Aspergillus awamori 52
4.2. Изучение условий выделения и очистки инулиназы из Kluyveromyces marxianus 59
4.3. Некоторые физико-химические свойства инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori 64
Глава 5. Адсорбционная иммобилизация инулиназы из Kluyveromy ces marxianus на различных носителях 69
5.1. Исследование условий иммобилизации инулиназы Kluyveromyces marxianus на некоторых ионообменных смолах 69
Глава 6. Изучение кинетико-термодинамических аспектов катализа свободной и иммобилизованной инулиназой Kluyveromyces marxianus 78
6.1. Исследование кинетики реакции гидролиза инулина адсорбционно связанной инулиназой Kluyveromyces marxianus 78
6.2. Кинетико-термодинамические аспекты процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus 83
6.3. Исследование закономерностей процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus методом дифференциально-термического анализа 90
6.4. Основные закономерности процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus, иммобилизованной на ВИОН-КН 96
Заключение 101
Выводы 105
Список литературы 107
- Физико - химические свойства инулиназы
- Применение иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине и аналитической практике
- Определение содержания белка в иммобилизованных ферментных препаратах модифицированным методом Лоури
- Изучение условий выделения и очистки инулиназы из Kluyveromyces marxianus
Введение к работе
Современные тенденции развития теории биологического катализа связаны с изучением ферментативных реакций, которые при всей их сложности протекают в полном соответствии с законами химической кинетики и термодинамики. Однако уникальные свойства ферментов, способность осуществлять регуляцию всех процессов жизнедеятельности на внутримолекулярном уровне определяются исключительно сложной структурой полипептидной цепи и активного центра белковой макромолекулы.
Исследование структурно-функциональных свойств карбогидраз и кинетико-термодинамических аспектов ферментативного гидролиза полимерных субстратов являются необходимым условием изучения полиферментных систем, локализованных в различных клеточных органеллах и нужны для создания теоретической базы ферментации возобновляемого растительного сырья и получения продуктов с заданными свойствами.
Особую значимость приобретают в настоящее время работы по иммобилизации ферментов, расщепляющих полисахариды и полифруктозиды и переводящих фермент из гомогенных катализаторов в гетерогенные, имеющие ряд технологических преимуществ.
Фермент инулиназа (2,1-р-0-фруктанфруктаногидролаза, КФ 3.3.1.7), специфически гидролизует Р-1,2-связи инулина до фруктозы и фруктоолигосахаридов в более мягких условиях по сравнению с кислотным гидролизом, требующим значительной концентрации ионов водорода, высокой температуы и применения специального кислотоустойчивого оборудования. В этой связи особую значимость приобретают работы по изучению структурно-функциональных свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулинсодержащего сырья, а также ряд теоретических и практических вопросов, связанных с изучением
5 влияния природы носителя на сохранение и поддержание каталитической активности инулиназы.
Выполненная работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета, входящей в Координационный план научно-исследовательских работ РАН.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободными и иммобилизованными инулиназами из микромицета Aspergillus awamori и дрожжей Kluyveromyces marxianus.
В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:
разработка методов выделения и очистки инулиназы из Aspergillus
awamori и Kluyveromyces marxianus;
изучение физико-химических свойств инулиназы из Aspergillus awamori и Kluyveromyces marxianus;
определение кинетико-термодинамических параметров реакции гидролиза инулина свободными и иммобилизованными на различных носителях препаратами инулиназ Kluyveromyces marxianus;
исследование закономерностей процессов термической инактивации
свободной и иммобилизованной инулиназы Kluyveromyces marxianus.
Научная новизна.
впервые осуществлена иммобилизация инулиназы Kluyveromyces
marxianus на гранулярных и волокнистых ионообменниках АВ-16 ГС,
АМ-21-А,ВИОНКН-1;
установлены оптимальные условия функционирования иммобилизованной инулиназы;
обнаружено, что при адсорбционной иммобилизации инулиназы
имеет место многоточечное связывание с носителем, приводящее к
увеличению значений Кт и АН, уменьшению значений Vmax и AS;
с помощью дифференциального термического анализа и классических
методов исследован процесс термической инактивации свободной и иммобилизованной инулиназы в интервале температур 50-85 С. Рассчитаны активационные параметры термоинактивации инулиназы (kjn, Еакт, АН, AS). Выявлено, что адсорбционный способ иммобилизации инулиназы повышает устойчивость фермента к денатурирующим факторам среды (рН, температура);
предложена модель перехода глобула-клубок, включающая
промежуточные стадии процесса термического разворачивания
белковой молекулы инулиназы;
разработаны эффективные методы выделения и очистки инулиназы из
дрожжей Kluyveromyces marxianus. Выявлены оптимальные режимы
функционирования инулиназ из Kluyveromyces marxianus и
Aspergillus awamori.
Практическая значимость. Результаты диссертационной работы
расширяют представления о функционировании инулиназы в свободном и
иммобилизованном состоянии, дают информацию о влиянии иммобилизации на
процессы термической инактивации ферментов, вносят вклад в исследование
механизмов реакций гидролиза инулина. Рассчитанные кинетико-
термодинамические параметры реакции гидролиза инулина позволяют
прогнозировать поведение свободного и иммобилизованного фермента в
технологических условиях. Полученные данные могут быть использованы при
чтении студентам биологических факультетов университетов и высших учебных
заведений технологического профиля курсов «Биотехнология», «Химическая
энзимология», «Молекулярная биология», «Биофизика».
Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); на X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов»
7 (Воронеж, 2004); конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), 8th Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); IX Conference of Food Microbiology (Lubljana, Slovenia, 2004).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 3 статьи и 4 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
Разработаны эффективные методы выделения и очистки препаратов инулиназ из дрожжей Kluyveromyces marxianus и микромицета Aspergillus awamori с высокой каталитической активностью.
Созданы гетерогенные биокатализаторы на основе инулиназы из Kluyveromyces marxianus, адсорбционно иммобилизованной на АВ-16 ГС, АМ-21-А, ВИОН КН-1, выявлены оптимальные условия их функционирования.
3. Плавление вторичной структуры свободной инулиназы
Kluyveromyces marxianus не является кооперативным процессом, поскольку
наблюдаются стадии упорядоченная глобула — хаотический клубок и ред
промежуточных микросостояний.
4. Термоденатурация иммобилизованной инулиназы - кооперативный
процесс, в котором упорядоченная глобула переходит в состояние
хаотического клубка в узком интервале температур и сопровождается резким
изменением значений термодинамических параметров.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа включает 118 страниц машинописного текста; состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы (118 источников). Иллюстрационный материал включает 23 рисунка, 14 таблиц.
Физико - химические свойства инулиназы
Инулиназа входит в группу фруктаногидролаз (2,1-р-В-фруктан-фруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7), в которую объединены ферменты, расщепляющие полимеры фруктозы. Инулиназы - ферменты, гидролизующие Р-1,2-связи инулина. В большинстве случаев они способны гидролизовать также сахарозу. По типу действия различают экзо- и эндоинулиназы, которые в качестве продукта реакции образуют фруктозу в первом случае и различные фруктоолигосахариды во втором (М. Kusunoki, Y. Matsura, 1983). Инулиназа достаточно широко распространена в микромицетах и высших растениях. Она катализирует реакцию гидролиза инулина, содержащегося в клубнях и корневищах многих растений (топинамбур, подсолнечник, георгин, одуванчик и др.), до фруктозы и незначительного количества глюкозы. Рядом исследователей было сделано предположение о том, что действие на инулин осуществляется по механизму одиночной цепи, начинающейся с концевого звена молекулы инулина (Г.А. Чикин и др., 1983; Т.А. Ковалева и др., 1997). Инулин - это резервный полисахарид растений. Молекула состоит из остатков D-фруктозы и D-глюкозы и представляет собой неразветвленную цепь из 32 - 45 фруктофуранозидных фрагментов, соединенных 3-2,1-гликозидными связями, к редуцирующему концу которой присоединена D-глюкопираноза через полуацетальныи гидроксил, также как в молекуле сахарозы. Инулин представляет собой белый гигроскопический порошок, трудно растворимый в холодной воде и хорошо растворимый в горячей, не обладающий редуцирующими свойствами и не окрашиваемый йодом. Инулины, полученные из различных источников неоднородны, их средняя молекулярная масса составляет 5-6 кДа.
Инулин используют для лечения сахарного диабета, а некоторые его производные обладают противоопухолевым действием и могут служить инъекционными препаратами (D. Laloux et al., 1989; М. Satoshi et al., 2002). Данные по физико-химическим свойствам инулиназ широко представлены в литературе (М. Ettalibi, J. Baratti, 1990; R. Pessoni et al., 1996; T.A. Ковалева и др., 1996). В таблицах 1, 2 приведены основные факты о продуцентах и некоторых свойствах инулиназ.. Анализируя данные таблицы, можно отметить, что температурный оптимум реакции гидролиза инулина для ферментов, полученных из различных источников, не одинаков. Так, инулиназа из Debaryomyces confarrellix наиболее чувствительна по отношению к температуре., а из Aspergillus niger - самая резистентная. Однако для большинства инулиназ оптимальная температура каталитической реакции находится в диапазоне 45-55С, а для некоторых она соответствует 57С и даже 60С (Т. Nakamura et al., 1997). Фермент является термостабильным: даже при 70 С активность сохраняется на 22% от максимальной величины. Температура денатурации для инулиназы Aspergillus awamori составляет 76 С (М. Arand et al., 2002). Таким образом, инулиназа является достаточно термостабильным ферментом, что обеспечивается особенностями первичной структуры и пространственного строения данного фермента. По данным P.M. Мустафаева (1991), инулиназа из Aspergillus awamori BKMF - 808 имеет в зоне температур 30 - 50С относительно меньший прирост энтропии AS, что свидетельствует о достаточно высокой прочности и жесткости глобулы фермента. Резкое увеличение AS в интервале 60 - 70С свидетельствует об интенсивном переходе белковой глобулы фермента в хаотичный клубок и дает основание предположить, что в формирование ее структуры существенный вклад вносят гидрофобные взаимодействия. В стабилизации макромолекулярной структуры белков участвуют и S-S -связи. Установлено, что в молекуле инулиназы имеются два дисульфидных мостика, которые способствуют поддержанию нативной конформации белка и определяют ее устойчивость к денатурирующим агентам (Н. Akimoto et al., 2000). Методом кислотно-основного титрования установлено, что наибольший вклад в образование белковой молекулы фермента вносят кислые аминокислоты, вероятно, определяющие стабильность вторичной и третичной структуры, а также обусловливающие высокую термо- и кислотоустойчивость молекулы инулиназы. Продуцентами инулаз могут быть не только микроорганизмы. Так, препарат фермента был получен из корней цикория (Cichorium intybus). Молекулярная масса выделенного фермента составила 60 кДа, максимальная активность инулиназы наблюдалась при рН 5,0 - 5,5 и температуре 35С (L. Zhang et al., 2004). На каталитическую активность ферментов большое влияние оказывает рН среды, которое осуществляется за счет изменения ионизации отдельных компонентов ферментативной реакции. Такие изменения могут происходить в нативном ферменте, фермент-субстратном комплексе или субстрате. Показано, что рН влияет на скорость ферментативной реакции тремя способами: воздействием на величину максимальной скорости ферментативной реакции (Vmax), на образование фермент-субстратного комплекса и на устойчивость молекулы фермента. Инулиназы содержат большое количество ионизирующихся групп, поэтому они могут находиться в виде целого ряда ионных форм, однако каталитическая активность ферментов проявляется, как правило, в узком интервале рН. В связи с этим можно предполагать, что только одна из ионных форм фермента (точнее, его активного центра) каталитически активна. При этом распределение всего количества фермента между этими ионными формами зависит от рН и констант ионизации (рК) отдельных групп, расположенных непосредственно в самом активном центре или около него. Каталитическая активность инулиназы зависит от величины концентрации ионов водорода реакционной смеси. Для любого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Переход к большей или меньшей (по сравнению с оптимальной) концентрации водородных ионов сопровождается более или менее равномерным падением активности фермента. Анализ данных литературы показывает, что инулиназы из различных микроорганизмов отличаются по рН - оптимуму. Грибные и дрожжевые инулиназы проявляют максимальную активность в более кислой среде (рН 4,0 - 5,5), бактериальные же - в нейтральной (рН 5,5 - 7,5). Исключениям среди бактериальных ферментов являются ферменты из Debaryomyces phaffiicapriotti и Debaryomyces cantarellii, для которых оптимум значения рН соответствует 4 (В.Л. Куев и др., 1991). Оптимальное значение рН реакции гидролиза субстрата для инулиназ микроорганизмов находится в интервале 4,0 - 5,0, совпадающим с зоной наибольшей стабильности фруктозы, что делает перспективным их использование в промышленном получении фруктозы из инулин-содержащего сырья. По литературным данным в состав активного центра инулиназы Aspergillus awamory входят следующие ионогенные группы: карбоксильная группа аспарагиновой кислоты, имидазольная группа гистидина и SH -группа цистеина. Кроме того, методом T.Thannhauser (1984), установлено, что фермент содержит 7 поверхностных и 3 глубинных SH - группы, при блокировании которых n-меркурибензонатом (ПХМБ), наблюдается инактивация инулиназы. Это, очевидно, происходит вследствие изменения конформации белка, затрагивающей активный центр. Обобщая литературные данные, можно сделать вывод о том, что микроорганизмы продуцируют инулиназы с различными физико-химическими свойствами. Регулируя рН реакционной среды и температуру ферментативной реакции, можно добиться максимальной активности фермента.
Применение иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине и аналитической практике
Ферментативный катализ в силу своей уникальности (высокой каталитической активности и селективности в отношении превращаемых связей субстрата) обладает широкими перспективами при использовании в промышленной технологии и медицине. Амилолитические ферменты используются в хлебопечении (улучшают вкус, аромат, пористость), кондитерской, крахмалопаточной, спиртовой промышленности, при производстве крупяных изделий, моющих средств, очистке стоков, в сельском хозяйстве и медицине. При помощи грибных амилаз кукурузная и маисовая мука могут быть переработаны в глюкозную и мальтозную патоки, которые в свою очередь используются для получения чистой глюкозы.
Применение ферментов дает возможность селективно определять в крови, моче, тканях и других биологических объектах малые количества физиологически активных веществ: мочевины, мочевой кислоты, глюкозы, аминокислот, нуклеотидов, спиртов. Для аналитических целей находят применение ферменты различных классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Пределы обнаружения зависят не только от каталитической активности фермента, но и кинетических характеристик используемой индикаторной ферментативной реакции.
Развитие медицинской энзимологии способствовало более широкому применению ферментативных препаратов в качестве терапевтических средств и при проведении клинических анализов, а также для диагностики различных заболеваний. Амилолитические ферментные препараты используют как замещающие терапевтические средства для коррекции гипо-и диеферментозов желудочно-кишечного тракта. Восполнение дефицита ферментов достигается перроральным приемом комплексных ферментных препаратов, содержащих амилазы, протеазы и липазы. С помощью ферментов разрушают накопившиеся в большом количестве продукты распада белков при ожогах, гнойно-воспалительных заболеваниях легких. В последние годы ферментные препараты стали применять для рассасывания тромбов кровеносных сосудов, а также при аномальном накоплении гликогена в клетках и тканях (глюкоамилаза из Aspergillus или Endolomycopsis) (Т. Ohta et al., 1998).
В последние годы получение оптически чистых аминокислот в промышленном масштабе для корректировки рационов питания, в лечебных и профилактических целях с помощью ферментов становится все более актуальной задачей химической энзимологии. Химический синтез оптически чистых аминокислот реализован пока лишь при производстве L-диоксифенилаланина. В случае энантомеров остальных аминокислот промышленный химический синтез является не более чем теоретической возможностью. Существует два направления ферментативного получения энантомеров аминокислот. Первое из них - катализируемые рядом ферментов реакции синтеза L-аминокислот из оптически неактивных предшественников. Вторая возможность - ферментативное превращение рацемических производных аминокислот в оптически чистые L- и D-аминокислоты с помощью аминоацилазы. I. Chibata (1976) использовал для разделения ацетил-0,Ь-аминокислот на оптические антиподы растворимую аминоацилазу, получаемую из плесени Aspergillus oryzae. Применение аминоацилаз различного происхождения для разделения рацематов аминокислот на оптические антиподы является единственным методом, перспективным для промышленного применения.
Анализ данных литературы показывает, что в настоящее время получают промышленным путем ферменты, которые могут быть использованы в медицине, сельском хозяйстве, в пищевой промышленности, в производстве синтетических моющих средств. Применение ферментных препаратов обеспечивает значительное ускорение технологических процессов, улучшает качество продукции, позволяет перевести производство на непрерывный автоматический поток с образованием таких отходов, которые экологически безопасны для окружающей среды и могут быть использованы в качестве корма для скота или сырья для других отраслей промышленности. Однако при применении ферментных препаратов возникает множество проблем: труднодоступность чистых ферментов; неустойчивость при хранении; низкая стабильность при различных воздействиях, особенно тепловых; невозможность многократного применения дорогостоящего биокатализатора или реагента из-за сложности его отделения от продуктов реакции. В этой связи разработка методов получения искусственных нерастворимых производных, т.е. иммобилизованных ферментов, способствует разрешению этих задач. В ходе исследования таких ферментов оказалось, что иммобилизация приводит к повышению стабильности по отношению к денатурирующим факторам внешней среды по сравнению со свободными ферментами. Кроме того, иммобилизация на твердых носителях или перевод фермента в нерастворимую форму осуществляется с целью получения гетерогенных биокатализаторов, которые могут быть использованы в промышленности или в аналитических целях многократно.
Наряду с этим иммобилизованный фермент может быть помещен в колонку или аналогичный реактор и использован в качестве биокатализатора в непрерывном производственном процессе. При этом более дорогостоящие внутриклеточные ферменты могут оказаться доступными для промышленного применения. Иммобилизация ферментов является частью более широкой проблемы целесообразной модификации биологически активных веществ, она стала основой для создания новой весьма эффективной методики разделения и очистки белков и других биологически важных веществ - аффинной хроматографии. Иммобилизованные ферменты применяются в промышленности для разделения D- и L-аминокислот, в производстве фруктозных спиртов, для превращения крахмала в глюкозу, обработки молока, модификации антибиотиков, производства аминокислот, иммобилизации протеаз для использования в пищевой промышленности (В.К. Швядас, 1980). Иммобилизация ферментов используется для изготовления ферментных электродов и автоматических анализаторов. Ферментные электроды - это устройства, созданные на основе электрохимического датчика и иммобилизованного фермента, находящиеся в непосредственном контакте.
Определение содержания белка в иммобилизованных ферментных препаратах модифицированным методом Лоури
К исследуемому образцу 30 мг иммобилизованного фермента добавляли 1 мл дистиллированной воды и 0,9 мл раствора А, помещали в водяную баню при 50 С на 20 мин., охлаждали до комнатной температуры и добавляли 0,1 мл раствора В, оставляли при комнатной температуре на 10 мин., затем прибавляли 3 мл раствора С и перемешивали в течение 3 с. Пробирки снова ляной кислоты. Выдерживали в водяной бане (70С) 20 минут, доводили водой до метки и после измерения оптической плотности строили калибровочный график. Активность инулиназы рассчитывали по формуле где А — активность, ед/мг белка; а - количество фруктозы, мкг; b - количество фермента в реакционной смеси, мг/мл гидролиза-та; t - время гидролиза, мин.; 180 - молекулярная масса глюкозы. Реактивы. 1. Иммобилизованный фермент. 2. Ацетатный буфер рН=4,7. 3. Раствор инулина в ацетатном буфере (2.5 10"6 моль/л). 4. Раствор резорцина (100 мг/ЮОмл 96% этилового спирта). 5. 30% раствор соляной кислоты. Ход определения. Реакцию проводили, используя два ферментера, в которых инкубируемая жидкость перемешивалась с помощью магнитной мешалки. Ферментеры подсоединяли к термостату. В первый помещали 4 мл раствора инулина в ацетатном буфере и добавляли навеску препарата иммобилизованного фермента. Во второй ферментер помещали раствор инулина в той же концентрации. Реакцию проводили при температуре 70 С. Через 20 минут отбирали из первого ферментера 2 мл гидролизата и добавляли 4 мл NaOH. После этого ролизате вычисляли на основе измерения интенсивности оптической плотности при помощи спектрофотометра. Реактивы. 1. Инулин - 5-Ю"4 моль/л (в 0,1 моль/л ацетатном буфере, рН 4,7). 2. 0, 5 моль/л раствор натриевой щелочи. 3. Резорцин - 100 мг резорцина растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта. 4.
Соляная кислота - 30% раствор. 5. Фруктоза - 100 мг чистой сухой фруктозы растворяют в 100мл насыщенного водного раствора бензойной кислоты. Раствор можно длительное время хранить в холодильнике. Ход определения. 0,2 мл раствора инулина и 0,2 мл раствора фермента инкубировали в течение 20 минут при 50 С. По окончании этого времени реакцию останавливали, добавляя в реакционную смесь 1,2 мл 0,5 моль/л раствора натриевой щелочи. Затем из реакционной смеси отбирали 0,4 мл гидролизата, добавляли 0,4 мл спиртового раствора резорцина и 2 мл 30 % соляной кислоты. Далее помещали в водяную баню (70 С) на 20 минут, охлаждали и измеряли оптическую плотность против контроля при 540 нм на КФК-3. В качестве контроля на исходное содержание редуцирующих веществ использовали раствор, отобранный из пробирки, содержащей 0.2мл раствора инулина, 0,2 мл воды, 1,2 мл 0,5 моль/л раствора NaOH. Концентрацию фруктозы, образовавшейся в результате ферментативного гидролиза инулина, определяли, используя заранее полученную калибровочную кривую. Для построения калибровочной кривой использовали раствор фруктозы. Из этого раствора брали 10 мл и разбавляли в мерной колбе до 100мл. Далее в мерные колбы емкостью 25 мл вносили 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мл этого раствора и добавляли по 5мл резорцинового реактива и по 15 мл 30%-ной со- ляной кислоты. Выдерживали в водяной бане (70С) 20 минут, доводили водой до метки и после измерения оптической плотности строили калибровочный график. Активность инулиназы рассчитывали по формуле где А — активность, ед/мг белка; а - количество фруктозы, мкг; b - количество фермента в реакционной смеси, мг/мл гидролиза-та; t - время гидролиза, мин.; 180 - молекулярная масса глюкозы. 3.2.5. Метод определения активности иммобилизованной инулиназы Реактивы. 1. Иммобилизованный фермент. 2. Ацетатный буфер рН=4,7. 3. Раствор инулина в ацетатном буфере (2.5 10"6 моль/л). 4. Раствор резорцина (100 мг/ЮОмл 96% этилового спирта). 5. 30% раствор соляной кислоты. Ход определения. Реакцию проводили, используя два ферментера, в которых инкубируемая жидкость перемешивалась с помощью магнитной мешалки. Ферментеры подсоединяли к термостату. В первый помещали 4 мл раствора инулина в ацетатном буфере и добавляли навеску препарата иммобилизованного фермента. Во второй ферментер помещали раствор инулина в той же концентрации. Реакцию проводили при температуре 70 С. Через 20 минут отбирали из первого ферментера 2 мл гидролизата и добавляли 4 мл NaOH. После этого из гидролизатов образца и контроля отбирали по 1 мл, добавляли 1 мл раствора резорцина и 3 мл соляной кислоты. Помещали в термостат при температуре 70С на 20 мин, затем определяли оптическую плотность при комнатной температуре и Х= 540 нм на КФК-3. Содержание фруктозы определяли по калибровочной кривой, так же как в методе определения активности ину-линазы.
Изучение условий выделения и очистки инулиназы из Kluyveromyces marxianus
Для получения препаратов амилолитических ферментов с высокой степенью чистоты используются многообразные комбинации методов. Мы изучали влияние различных источников углерода, органических растворителей и условий хроматографирования на эффективность выделения и очистки инулиназы. В качестве продуцента инулиназы нами были выбраны дрожжи Kluy-veromyces marxianus, известные своей способностью к биосинтезу гидролитических ферментов с высокой активностью (P. Selvakumar et A. Pandey, 1999; A. Pessoa et М. Vitolo, 1999). Важное значение в биосинтезе амилолитичексих ферментов, в том числе инулиназ, имеет источник углерода (В.А. Абелян, Л.С. Манукян, 1996). В этой связи для выращивания дрожжей Kluyveromyces marxianus мы использовали питательные среды следующего состава, %: 1) пептон - 1; дрожжевой экстракт - 0,5; фруктоза - 2; 2) пептон - 1; дрожжевой экстракт - 0,5; глюкоза - 2; 3) соевое сусло. Глубинное культивирование продуцента проводили в лабораторных условиях в колбах емкостью 500 см3, содержащих 50 см3 питательной среды исследуемого состава, в течение 72 ч при температуре 25 С и рН 4,7 на лабораторной роторной качалке. Питательные среды подвергали стерилизации в течение 40 мин при 0,8 мПа, охлаждали до 30 С и производили посев водной суспензии дрожжей. По истечении времени культивирования биомассу дрожжей отделяли от культуральной жидкости путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок высушивали при 25-27 С и измельчали до порошкообразного состояния. Для разрушения клеточной стенки и перевода инулиназы в раствор дрожжи тщательно растирали с песком или измельченным стеклом. Экстракция фермента может быть проведена с использованием бидистиллированной воды, однако, учитывая тот факт, что амилазы проявляют максимум каталитической активности в определенном диапазоне значений рН, для данной цели применяли ацетатный буфер (рН 4,7). Экстрагирование инулиназы осуществляли при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре 20-22 С.
Для отделения белка от балластных веществ осуществляли центрифугирование при 3500 об/мин в течение 35 мин, образовавшийся осадок отбрасывали. Известно, что белковые молекулы в присутствии органических растворителей способны образовывать агрегаты и выпадать в осадок, так как сила электростатического притяжения обратно пропорциональна диэлектрической постоянной среды, которая в данном случае уменьшается (М. Диксон, Э.Уэбб, 1982). В этой связи на следующей стадии выделения инулиназы из Kluyveromyces marxianus осуществляли процесс осаждения с помощью органических растворителей. Поскольку при комнатной температуре большинство ферментов денатурируется органическими растворителями, культуральную жидкость охлаждали до -2 С, органические растворители - до -6 С. При выделении дрожжевых амилаз наиболее предпочтительными являются растворы изопропилового спирта. В этой связи мы осаждали фермент 80% раствором изопропилового спирта в соотношении 1:4 и осуществляли центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 мин. Количество белка измеряли с помощью метода Лоури, а каталитическую активность - резорциновым методом. Результаты экспериментов представлены в табл. 6,7,8. Обнаружено, что максимальной каталитической активностью обладает препарат инулиназы, выделенный из дрожжей Kluyveromyces marxianus, выращенных на питательной среде с фруктозой в качестве источника углерода. Из литературных данных известно, что при выращивании продуцентов инулиназы на средах с различными источниками углерода, активность полученного ферментного препарата также отличается (A. Pessoa, 1999). Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что инулиназа, выделенная из дрожжей Kluyveromyces marxianus, является индуцибельным ферментом. Следующей стадией очистки инулиназы, выделенной из Kluyveromyces marxianus, явилась гель-хроматография на сефадексе G-100. Элюцию фермента осуществляли ступенчато цитратно-фосфатным буфером (рН 4,7) со скоростью 12 мл/ч. Элюат собирали порциями по 3 мл. Количество белка во фракциях определяли с помощью метода Лоури, каталитическую активность инулиназы - спектрофотометрически. На рис. 5А представлен профиль элюции инулиназы Kluyveromyces marxianus. При этом инулиназной активностью обладает фракция с Ve = 54 мл.
Электрофорез в полиакриламидном геле выявил гомогенность полученного препарата инулиназы Kluyveromyces marxianus (рис. 5В). Для определения молекулярной массы ферментного препарата инулиназы применяли метод гель-фильтрации на сефадексе G-150 при использовании набора молекулярно-весовых стандартов. В данном случае использовали колонку, откалиброванную стандартным набором белков-маркеров: катал аза - 230 кДа; бычий сывороточный альбумин - 68 кДа; интерферон - 22 кДа; цитохром с - 13 кДа. Методом гель-фильтрации на сефадексе G-150 установлено, что кажущаяся молекулярная масса инулиназы составляет 63 кДа. Итак, в нашей лаборатории получена высокоочищенная инулиназа из дрожжей Kluyveromyces marxianus; разработанная схема очистки является эффективной и обеспечивает достаточно высокий количественный выход фермента.
