Введение к работе
Актуальность проблемы. Chlamydia trachomatis - грам-отрицательная эубактерия, облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий ряд тяжелых заболеваний у человека трахому - поражение слизистой оболочки глаз, приводящее к слепоте, паховый лимфогранулематоз, урогенитальные хламидиозы, являющиеся одними из самых распространенных инфекций, передающихся половым путем Хламидии обладают уникальным двухфазным жизненным циклом, который позволяет им отлично адаптироваться к паразитированию внутри эукариотической клетки Внутриклеточный цикл развития С trachomatis протекает внутри особой мембранной вакуоли, называемой включением Мембрана включения модифицируется уникальными хламидийными белками, наиболее интересными из которых является семейство Inc-белков (inclusion proteins, белки включения) Inc-белки обнаружены у всех видов хламидии, причем их аналоги отсутствуют у каких-либо других известных организмов Данные белки значительно отличаются между собой по первичной структуре, однако для всех Inc-белков характерно наличие двудольного гидрофобного домена, протяженностью 50-80 аминокислот, который, возможно, и определяет их локализацию в мембране включения Большинство Inc-белков являются белками ранней фазы инфекции, их гены экспрессируются в течение первых двух часов после заражения Гидрофильные домены некоторых Inc-белков располагаются на цитоплазматической поверхности мембраны включения и фосфорилируются киназами клетки-хозяина Вышеприведенные факты делают обоснованным предположение о ключевой роли Inc-белков в жизненном цикле развития хламидии и взаимодействии с эукариотической клеткой, что и привлекает к ним внимание исследователей
Тем не менее, механизмы патогенеза хламидийной инфекции, а так же механизмы взаимодействия с эукариотической клеткой остаются малопонятными Также мало исследованы механизмы, благодаря которым хламидия избегает действия защитных систем клетки, главным образом ее
эндосомно-лизосомного аппарата Известно лишь, что маркеров, характерных для поздних эндосом, в мембране включения не обнаружено Для транспортировки внутри инфицированной клетки хламидия использует ее транспортные системы при участии моторного белка динеина, однако роль мембраны включения в этих процессах остается невыясненной Таким образом, учитывая огромное клиническое значение хламидий, а также их уникальность среди всех внутриклеточных паразитов, изучение их взаимодействия с эукариотическими клетками является актуальной задачей как с научной, так и с медицинской точек зрения Более того, именно белки мембраны включения, на основании всех вышеперечисленных фактов, могут играть ключевую роль в процессах взаимодействия паразита с клеткой
Цель работы: Определение структурно-функциональной организация генов и белков мембраны включения С trachomatis
Задачи:
-
Определение структуры оперона, находящегося под контролем промотора гена тсВ С trachomatis
-
Поиск и клонирование промоторных областей генов белков мембраны включения incA, incBC, incDEFG С trachomatis в плазмидный вектор с репортерной системой на основе гена gfp
-
Компьютерное моделирование структуры промоторных областей генов шсА, incBC, incDEFG С trachomatis и определение их активности в клетках Е coli
-
Клонирование генов, кодирующих гидрофильные и гидрофобные домены белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С trachomatis, в составе плазмидных векторов для их экспрессии в клетках линии HeLa
-
Определение локализации рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С trachomatis слитых с GFP в клетках линии HeLa
-
Выявление ко-локализации гидрофобных доменов белков мембраны включения С trachomatis с мембранными эукариотическими органеллами в клетках линии HeLa
-
Получение антител к рекомбинантным полноразмерным белкам IncB, IncC
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе реализован один из походов к выявлению структурно-функциональной организации генов и белков мембраны включения семейства Inc С trachomatis, а так же их роли в жизненном цикле хламидий В результате показана принадлежность генов incB и incC С trachomatis к одному оперону, установлена локализация промоторных областей генов шсА, и оперонов incBC, incDEFG в геноме хламидий Для промоторов данных генов предсказаны точки начала транскрипции, а так же -10 и -35 консервативные области Проведено сравнение их активности в гетерологичной системе Е сок с применением репортерной системы на основе GFP
В качестве объекта для исследования структурно-функциональной характеристики белков мембраны включения нами были выбраны белки мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG, относящиеся к белкам ранней фазы инфекции, гены которых начинают экспрессироваться в течениие первых двух часов после заражения клетки Нами была определена локализация рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов данных белков, слитых с репортером GFP в культуре клеток линии HeLa В результате было показано, что локализация полноразмерных IncC, IncG полностью определяется их гидрофобными доменами
Для подтверждения роли гидрофобного домена IncC в распределении полноразмерного белка в клетке были получены рекомбинантные плазмидные векторы, в составе которых ген гидрофобного домена IncC находился в одной рамке считывания с генами гидрофильных доменов IncB, IncE, IncG После трансфекции соостветствующими плазмидами культур клеток линии HeLa два из трех химерных белков локализовались сходно с полноразмерным IncC
Также были получены поликлональные мышиные антитела для белков ранней фазы инфекции IncB и IncC, биологическая функция которых не известна Полученные антитела могут использоваться в дальнейшем как дополнительный инструмент в исследованиях функциональной роли Іпс-белков в жизненном цикле С trachomatis
Полученные данные по структурно-функциональной организации Іпс-белков могут быть в дальнейшем использованы для определения их роли в патогенезе хламидийной инфекции, а также для поиска белков-партнеров Расшифровка молекулярных механизмов взаимодействия с эукариотической клеткой может стать основой для разработки новых лекарственных препаратов для терапии хламидиозов
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава (Москва, 29 мая 2008 года), а так же в ходе следующих конференций «Genomic Perspectives to Host Pathogen Interactions» (Hinxton, UK, 7-10 сентября 2006), «Conference for young scientist, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M I Vavilov» (Kyiv, Ukraine, 20-22 сентября 2007), «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, Россия, 15-16 сентября 2008)
Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 6 публикациях (2 - в рецензируемых журналах, 4 - материалы конференций)
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 26 рисунков Состоит из следующих глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который насчитывает 150 источников
Похожие диссертации на Структурно-функциональная характеристика белков мембраны включения Chlamydia trachomatis
