Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В настоящее время существует потребность в фундаментальных исследованиях, раскрывающих молекулярные механизмы основных процессов жизнедеятельности, ключевыми из которых являются межмолекулярные взаимодействия. Они представлены на всех уровнях структурной и регуляторной иерархии в организме, определяющей специфику, направленность анаболизма и катаболизма, информационное взаимодействие молекул, клеток, органов и систем, устойчивость и динамичность биохимических и физиологических процессов (Лим В.И. и соавт. Кинетические, энергетические и стереохимические факторы, определяющие молекулярное узнавание белков и нуклеиновых кислот. Молекулярная биология. 2006, Т. 40, № 4. С. 572 - 579; Яковлев А.А. Кросс-линкеры и их использование для исследования межмолекулярных взаимодействий Нейрохимия. 2009, Т. 26, № 2. - С. 149 - 155; Василевская В.В. и соавт. Компьютерное моделирование макромолекулярных систем с амфифильными мономерными звеньями. Биометрические модели. Высокомолекулярные соединения. 2011, Т.53, № 9. С. 1603 - 1626; Иванов А.С. Исследование межмолекулярных взаимодействий с помощью оптических биосенсоров, работающих на эффекте поверхностного плазменного резонанса. Современные технологии в медицине. 2012, № 4, С. 142 - 153; Мао L. et al. Multiple intermolecular interaction modes of positively charged residues with adenine in ATP-binding proteins. J Am Chem Soc. 2003, Vol. 26, № 125(47). P.14216 - 14217; Kamei N. et al. Importance of intermolecular interaction on the improvement of intestinal therapeutic peptide/protein absorption using cell-penetrating peptides. J Control Release. 2009,Vol. 19, № 136(3). P. 179 - 186).
Благодаря успехам протеомики, внедрению высокотехнологичных методов раскрыты определенные закономерности структурной организации белков, получены достаточные доказательства того, что ключевыми звеньями в реализации функций организма являются белок-белковые взаимодействия, нарушение которых может привести к развитию патологических состояний (Шатаева Л.К. и соавт. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы) Спб.: «Наука», 2003. 222 с; Березов Т.Т. и соавт. Альцгеймеровские амилоидные бляшки в механизмах нарушения синаптической пластичности нейронов. Вестник РАМН. 2005, № 10. С. 3 - 7; Пятницкий М.А. и соавт. Предсказание взаимосвязанных белков методами сравнительной геномики in silico. Биомедицинская химия. 2009, Т. 55, № 3. С. 230 - 246.; Терентьев А.А. и соавт. Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белок-белковые взаимодействия. Успехи биологической химии. 2009, Т.49, С. 429 -480; Иванов А.С. и соавт. Технологии белковой интерактомики. Биоорганическая химия. 2011, Т.37, № 1. С. 8-31; 326. Shaitan K.V. In: stochastic dynamics of reacting biomolecules. World scientific. 2003, P. 283 - 308;
Zaretsky J.Z. et al. Protein multifimctionality: principles and mechanisms. Translat. Oncogenomics. 2008, № З, P.99 - 136).
В литературе представлены разрозненные, несистематизированные сведения о предрасположенности к определенным соматическим и инфекционным заболеваниям лиц с различной АВО-групповой принадлежностью крови (Гребенщиков Л.В. Значение групповой принадлежности крови в диагностике наиболее распространенных ЛОР-заболеваний: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2001, 23 с; Афонин А.А. Генетика групп крови. М., 2006, 52 с; Гильямиярова Ф.Н. и соавт. Группы крови: биологическая вариабельность клеточного состава и метаболизма в норме и патологии. М.: «Известия», 2007, 490 с; Кучерюк П.Н. Эритроцитарные антигены системы АВО и сердечно-сосудистый риск. Пермский медицинский журнал. 2009, Т. 26, № 4. С. 90 - 94; Fry А.Е. et al. Common variation in the ABO glycosyltransferase is associated with susceptibility to severe Plasmodium falciparum malaria. Human Molecular Genetics. 2008, Vol. 17, № 4; Reid M.E. From DNA to blood groups. Immunohematology. 2008, № 24(4). P. 166-169).Молекулярная сущность этих явлений недостаточно аргументирована, в связи с этим создание теоретической базы данных о функциональной специфике антигенов системы АВО будет основой для выяснения причин индивидуальной реакции на экзогенные и эндогенные факторы обладателей различных групп крови, что имеет важное значение для развития превентивной медицины.
Немногочисленны сведения о структурной организации и функциях антигенов АВО системы. Известно, что детерминантной группой антигенов являются N-ацетилгалактозамин у антигена А и галактоза у антигена В (Yamamoto F. АВО blood group system-ABH oligosaccharide antigens, anti-A and anti-B, A and В glycosyltransferases, and ABO genes. Immunohematology. 2004, № 20. P. 3-22; Blumenfeld O.O. The ABO gene-more variation! Blood. 2003, № 102. P. 2715; Seltsam A. et al. The nature of diversity and diversification at the ABO locus. Blood. 2003, Vol. 102, № 8. P. 3035-3042). Генный локус системы H, предшественника антигенов АВО, расположен на 19 хромосоме в позиции 19ql3.3 и кодирует синтез каталитического белка а1,2-фукозилтрансферазы, переносящей остатки фукозы на терминальную галактозу (Оловникова Н.И. и соавт. Антигены эритроцитов человека. Гематология и трансфузиология. 2001, № 5. С. 37-45; Schenkel-Brunner Н., 2000; Cooling L.W. et al. Determinants of ABH expression on human blood platelets. Blood. 2005, № 105. P. 3356-3364). Гены белков, отвечающих за образование АВО системы антигенов, располагаются на 9 хромосоме в позиции 9q34.1 - 9q34.2 (Yamamoto F. et al. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature. 1990, Vol. 345. P. 229-233). Кодируемые ими белки обладают гликозилтрансферазной активностью, обеспечивая доставку УДФ-]Ч-ацетилгалактозамина, формируя гликопротеин А, или галактозы к терминальной фукозе, формируя гликопротеин В (Льюис СМ. и соавт. Практическая и лабораторная гематология. М.: «ГЭОТАР - Медиа», 2009. 672 с; Yamamoto М. et al.
Molecular genetic basis of porcine histo-blood group АО system. Blood. 2001, № 97. P. 3308-3310; Blumenfeld O.O. et al. Allelic genes of blood group antigens: a source of human mutations and cSNPs documented in the blood group antigen gene mutation database. Hum. Mutat. 2004, № 23. P. 8; Anstee D.J. Red cell genotyping and the future of pretransfusion testing . Blood. 2009, № 114. P. 248-256; Sindhuwinata N. et al. Binding of an acceptor substrate analog enhances the enzymatic activity of human blood group В galactosyltransferase. Glycobiology. 2010, № 20. P. 718-723). Тем самым формируются фенотипы А и В (Hosoi Е. Biological and clinical aspects of ABO blood group system.The Journal of medical investigation. 2008, Vol. 55. P. 174-182). Отсутствуют данные о поведении антигенов ABO системы как биомолекул, интеграция этих структур в каскад метаболических и физиологических процессов в организме.
Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы:
«Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнеобеспечения организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).
Цель исследования: выяснить молекулярную основу белок-белкового взаимодействия на модели гликопротеинов А и В и их лигандов, особенности ответа системы на воздействие биологически активных веществ.
Задачи исследования:
-
Охарактеризовать показатели белкового обмена практически здоровых лиц 0(1) - AB(IV) групп крови, выявить ассоциированность направленности метаболизма с определенной группой крови.
-
Исследовать группоспецифические особенности поведения белков сыворотки крови в электрическом поле, используя капиллярный электрофорез, оценить влияние силистронга на физико-химические характеристики белков.
-
Изучить действие силистронга на антиген-антительную модельную систему в условиях in vitro, используя в качестве объектов гликопротеины А и В и моноклональные антитела, охарактеризовать скорость наступления и степень агглютинации.
-
Оценить эффект силистронга на естественные анти-А и анти-В антитела по характеру межмолекулярного узнавания между модифицированными антителами и стандартными эритроцитами, содержащими антигены АВО системы.
-
Дать качественную и количественную оценку белок-лигандных комплексов с помощью методов конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитофлуориметрии, выявив влияние силистронга на межмолекулярные процессы.
Методология и методы исследования
Работа включала несколько этапов:
1. Определение показателей белкового обмена у 1300 лиц практически здоровых лиц в возрасте 19,6±1,5 лет, проживающих на территории Самарской области с 0(1) -AB(IV) группами крови.
2. Оценка влияния силистронга на физико-химические свойства белков
сыворотки крови здоровых лиц со А(П) (п=100) и В(Ш) (п=100) группами крови
методом капиллярного электрофореза.
3. Изучение реакции системы антиген-антитело в различных условиях
эксперимента, используя в качестве объектов гликопротеины А (п=60) и
В(п=60), моноклональные антитела (п=60), естественные антитела (п=60).
4. Визуализация антиген-антительных комплексов методом проточной
цитофлуориметрии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
(п=200).
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов исследования и статистической обработки материалов с помощью пакета компьютерных программ SPSS 12.0, «ANOVA».
Результаты исследований были представлены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица (Челябинск, 2009); XIII Международной научной конференции «Здоровье семьи в 21 веке» (Хургада, 2009); научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009); II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011, 2012); Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011, 2012); научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2012); XVI международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012); совместном заседании Самарского отделения Всероссийского биохимического общества, кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой и кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Самара, 2013).
Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, состояло в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщения данных литературы по профилю диссертационного исследования, формулировке цели и задач; проведении определения показателей белкового обмена, групповой принадлежности крови у 1300 клинически здоровых лиц, экспериментов in vitro по оценке влияния препарата силистронг на физико-химические свойства белков, серии модельных экспериментов по изучению белок-белкового взаимодействия in vitro, визуализации антиген-антительных комплексов методами проточной цитофлуориметрии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Автором лично получены все первичные данные, самостоятельно произведена статистическая обработка материала, сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и выводы и практические рекомендации, написан текст диссертации.
Положения, выносимые на защиту
-
Направленность белкового обмена, ассоциированная с АВО-групповой принадлежностью крови. Для носителей антигена А - низкое содержание альбумина при высоком уровне у-глобулинов, Ig G, свидетельствующем о напряжении специфического иммунитета. Для носителей антигена В - высокое содержание альбумина при низком уровне Ig G, Ig М и конечных продуктов азотистого обмена.
-
Для изучения белок-белкового взаимодействия разработана новая модельная система, представленная антигенами А, В и анти-А-, анти-В-антителами. В различных условиях экспериментов in vitro методом молекулярного зондирования препаратом силистронг выявлены характерные особенности гликопротеина А и гликопротеина В.
-
Различия в конформационно-реакционных свойствах гликопротеина А и гликопротеина В, проявившихся в результате действия силистронга. Визуализация комплексов антиген-антитело методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Научная новизна
Получены новые данные, которые служат основанием для индивидуализации параметров азотистого обмена, спектра белков плазмы крови по групповой принадлежности. Разница выявленных показателей, их ассоциированность с группой крови, позволила дифференцировать протеом, характерный для лиц типа А и В, содержащих соответственно гликопротеин А А(П) группы крови и В - В(Ш) группы крови на эритроцитарной мембране.
Характерно, что в группе обследованных типа А самое низкое содержание альбумина, что свидетельствует о слабом уровне неспецифической защиты. Выявленный низкий уровень Ig А служит показателем незащищенности слизистых, доступности для организма различных бактериальных агентов. Подтверждением множественных контактов организма с патогенами является самое значительное содержание Ig G.
В противоположность этому тип В, т.е. носители В(Ш) группы крови, характеризуются самым низким уровнем Ig М, Ig G, что свидетельствует об
отсутствии иммунологической памяти о контакте с патогенами. Чистоту эндэкологии в группе лиц В типа характеризует низкое содержание С-реактивного белка.
В качестве модели для изучения белок-белкового взаимодействия, оценки динамики этого процесса в интактных условиях и под влиянием биологически активных веществ нами впервые использована антиген-антительная система группы крови АВО, а флаволигнансодержащий препарат силистронг в качестве фактора биозондирования. Установлено, что преимущественной мишенью для силистронга является гликопротеин А. Препарат замедляет узнавание и взаимодействие антигена с антителом, удлиняет время наступления агглютинации. Для гликопротеина В этот эффект не характерен. Моноклональные анти-А и анти-В антитела модифицируются силистронгом, что увеличивает время белок-белкового взаимодействия с соответствующими антигенами. Установлены группоспецифические отличия реакции системы А(П) группы крови на воздействие силистронга: удлинение времени наступления агглютинации с гликопротеином А(П) группы крови и снижение степени агглютинации естественных анти-В антител, инертность системы В (III) группы крови - гликопротеина В и анти-А антител.
Получены новые данные, свидетельствующие о том, что белки плазмы крови у лиц 0(1) - AB(IV) групп крови отличаются по физико-химическим свойствам, о чем свидетельствуют результаты проведения капиллярного электрофореза. Выявлены отличия белкового спектра у обладателей А(П) группы крови: установлено наиболее высокое содержание фракции у-глобулинов, а у лиц с В(III) группой крови более низкий уровень al-, (3-глобулинов, у-глобулинов, что подтверждено нами результатами исследований биохимических показателей. Силистронг также по-разному меняет электрофоретическую подвижность белков плазмы крови лиц 0(1) - AB(IV) групп крови, выявлено изменение распределения белков плазмы крови по фракциям: перераспределение фракции (3-, у-глобулинов, «слияние» фракций (31- и (32-глобулинов. Установлены группоспецифические особенности влияния силистронга на белки плазмы крови - у людей А типа происходит перераспределение фракции al- и а2-глобулинов.
Нами впервые использовано два высокотехнологичных метода исследования - проточная цитофлуориметрия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия для качественной и количественной оценки антиген-антительных комплексов. Наибольшее влияние силистронг оказал на взаимодействие гликопротеина А с моноклональными анти-А антителами, мечеными флуоресцеинизотиоционатом, тогда как количество антиген-антительных комплексов, образованных гликопротеином В и моноклональными анти-В антителами, мечеными флуоресцеинизотиоционатом, осталось неизменным.
Блок полученных результатов является новым фактическим материалом, характеризующим особенности белок-белкового взаимодействия у лиц А и В типов, раскрывающим молекулярные механизмы, лежащие в основе
способности лиц типа А активно взаимодействовать с ксенобиотиками и патогенами.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты, полученные в работе, имеют теоретическое и практическое значение. Выявленные группоспецифические особенности состава белков плазмы крови, продуктов катаболизма азотсодержащих соединений, специфика изменений белковых фракций сыворотки под влиянием силистронга, особенности межмолекулярного взаимодействия гликопротеина А, В с анти-В и анти-А антителами, модифицированных силистронгом, что является фактическим материалом для обоснования генетически детерминированной ассоциированности группоспецифических антигенов с характером белкового спектра крови, метаболомными признаками, формирующими биологический тип А и В в соответствии с презентированным антигеном А и В.
Данные о характере белок-белковых взаимодействий антигенов и антител лиц А типа с флаволигнансодержащим препаратом силистронг в различных вариантах модельных экспериментов существенно отличаются от реакции системы, определяющей принадлежность к В типу, что раскрывает молекулярные предпосылки взаимодействия с различными патогенами, экотоксикантами, приводящими к высокой заболеваемости лиц А(П) группы крови по сравнению с носителями В(III) группы крови. Эти данные позволяют проводить скрининг населения по групповой принадлежности, акцентируя внимание на лицах А(П) группы крови, формировать группы повышенного риска для проведения превентивных, персонализированных мер профилактики.
Такой подход предполагает целесообразность составления индивидуального группоспецифического «паспорта здоровья» лиц А и В типа для повышения информативности диагностических процедур на доклинической стадии развития патологии и при мониторинге эффективности лечения.
Разработанная нами модель с визуализируемой качественной и количественной оценкой динамики межбелкового взаимодействия является продуктивным объектом для изучения межмолекулярного взаимодействия, тестирования индивидуального ответа на действие биологически активных веществ, лекарственных препаратов, различных ксенобиотиков -экотоксикантов.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационного исследования используются в работе клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ СО «Самарская городская поликлиника № 3»; в учебном процессе кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский
государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Получены патенты:
Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №
2010611397 от 2010 г.
Патент на изобретение № 2484480 «Способ оценки действия
биологически активных веществ на антиген-антительное взаимодействие» от 10
июня 2013 г.
Конкурсная поддержка исследования
Данная работа выполнена при поддержке гранта «У.М.Н.И.К.», проект №
8/14261 «Разработка группоспецифического метаболического,
иммунологического паспорта в прогнозировании и диагностике заболеваний»; губернского гранта в области науки и техники за II полугодие 2012 г. «Способ визуализации антиген-антительного взаимодействия методом конфокальной микроскопии»; гранта РФФИ, проект 13-04-9712 «Модель визуализации белок-белкового взаимодействия».
Публикации
Соискатель имеет 20 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 20 научных работ общим объёмом 44 печатных листа, в том числе 5 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателю выдан 1 патент, 1 свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ. 12 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 165 страницах машинописного текста, иллюстрированы 33 таблицами и 40 рисунками, состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 368 источников, из них 169 - отечественных и 199 -зарубежных.
