Введение к работе
Актуальность проблемы. Вопросы эволюции относятся к числу общебиологических проблем, исследование которых в последнее время перенесено также на молекулярный уровень. С точки зрения сис-тецатики и эволюции особый интерес представляет детальное изучение л сопоставление структурных и физико-химических особенностей физиологически активных молекул, а такго систем, выполняющих в организме вакные и уяв частично исследованные функции. Познание того, как эти молекулярнім сястсілі возникли, в каком направлении пло их развитие, и как в ходе эволюции происходила интеграция входящих в системы элементов, представляют задачу больпой теоретической вагиости.
При рассмотрении проблеа сравнительной биохимии всо больнее внимание исследователей привлекают гомологичные беляк различиих классов и видов животного traps. Интерэо к эволяционкоЯ кстсрж этих биополимеров обусловлен тем, чсо они шполняв? пракїичзски одинаковые функции з различных організмах (Кропе,1976; Krasypa, 1985; Carlou,198G; .Viniwarter.iga?).
Ранее Е.М.Крепе (1967) сфор.г/лировад положение, отраэзвщее общие принципы организации самых различных функциональна; систем: "Если природа нашла какой-то способ для решений оадсяя, то она неукоснительно использует его на различная этапах зволецот".
ззолтсциоинна преойрагоггіп гальл'К Лункцноналмгог. б.чс {легка:: отде-лы!::х предссг.?:
фундаментальная разработка отого паяо~зшпг прикадазЕяї А.М.Уголеву (1965,1939). В нзи і\ї,'їо$ убедительно доказал, чпо
crvis.r::! с гг-рердспр-лдол-огт:іо.'? yintecp-I'fC'vici!, находщкхся па paeutnc з-кша:-:
2. эволюционного развития.
Однако, эта концепция пока не получила должного развития на молекулярном уровне, и в частности, совершенно не затронута в вопросах эволюции альбумина.
Сывороточный альбумин является одним из объектов филогенетического анализа, основанного на исследовании специализации биополимеров. Данный белок ответственен за транспорт в кровяном русле биологически активных веществ, он обеспечивает нормальную вязкость, рН, онкотическое давление и объем циркулирующей крови, поддерживает азотистый баланс организма и является его питательным резервом. Альбумин сыворотки, ввиду своей адсорбционной активности, играет важную роль в рогуляции концентрации ионов Саг+ и Mg2+ в русле крови (Чегер,І975; Луйк,Лукьянчук,1981, Roda, Cappeiiini, Aldini et al., 1982; ІрОИЦКНЙ,1985; Sodersard,Backstron,1987 ).
Вопросы эволюционного развития сывороточных альбуминов давно интересуют исследователей. Об этом свидетельствует постоянно увеличивающийся поток информации по их структуре и функциональной организации. Работами многих из них накоплен разнообразный материал, касающийся происхождения альбумина, его функциональной роли, а такве особенностей его структуры ( Sarich,l974j Broun,1977j Peters, 1977,1985; Carter,He Xiao-min, Kuneon, 1939 ). Все эти исследования вплотную подводят к необходимости охарактеризовать структурно-функциональные особенности альбуминов в сравнительном аспекте. Однако, работы по изучению структурных и функциональных особенностей альбумина не носят систематического характера, часто охватывают небольшой круг объектов исследования. Более того, неко^ торые важные аспекты проблемы, касающиеся консервативности или, наоборот, изменчивости отдельных отделов его конфорнационной
руктуры, вопросы внутримолекулярной регуляции ксмплексссбразо-ния с метаболитами, местонахождения и функциональной значимсс-внутримолекулярноЯ связанной воды ранее фундаментально не ис-едовались. В этих обстоятельствах дальнейшее накопление иате-ала по характеристике альбуминов у животных разного уровня ор-низацяя и на различных этапах возрастного развитая представля-ся весьма паяным н актуальным.
Данная работа возникла как логическое продолжение ыноголет-х исследований по сравнительно-эволюционному изучении белков, в частности альбумина, прозодкиых на кафедре биохимии Снзфзро-льского государственного унигерситета км. М.В.Фрунзе (Сорккна А., Остоловсхнй Е.М.,1978,1979; Остоловский E.U.,І9Є2,І9Є4, 8,1990; Коноггнко СВ.,1976,1960,1990; Толкачева Н.3.,1975, 65,1990). Основой для нее послужил накопленный на кафедре ільаой фактический материзх по исследовании структуры альбумина сравнительно-онтогенетическом аспекте. Есе эти исследования їлотную подводят к необходимости охарактеризовать структурные и 'нкциональные свойства альбумина сыворотки крови псэвонсчкых в юцессах онто- и филогенеза.
В связи с теы, что з процессе эвэлгции характер свертывания липег.гндноЯ цепи сохраняется значительно лучге, чек ее амиио-слотный состав, одниц из подходов при изучении альбуминов в іазнигельно-зволгцнсннсм аспекте является анализ их фунхцно-льно-антизноЯ конфэрмацлонноЯ структура. Этот подход позволяет явить такие стру:.".ур:~зо параметры, которые когут быть достойными признаками вида, реда или класса газетных. Вместе с тем, азнктельно-бнохиуическиЯ анализ предоставляет возиогнесть рас-отреть как частичные изменения, проксхсд,сдиз на урезке отдель-
ных компонентов макромолекулы Т5елка у организмов довольно далеко отстоящих друг от друга на эволюционной лестнице, так и получить целостное представление о направлении развития биополимера как целого. Кроме того, такой подход позволяет сосредоточить внимание на тех аспектах ассоциативной функции альбумина, которые имеют отношение к транспорту основных, традиционных для всех этапов развития этого белка, с момента его формирования, метаболитов, а также дает возможность рассмотреть альбумин с точки зрения его роли в регуляции концентраций этих веществ в организме животных и человека.
С указанных позиций в данной работе рассмотрены особенности химической и конформационной структуры, а также функциональной активности сывороточных альбуминов позвоночных разного эволюционного уровня - от круглоротих до млекопитающих. Кроме того, были исследованы альбумины сыворотки и ткани печени кроликов в различные периоды возрастного развития.
Целью работы является сравнительно-биохимическое изучение молекулярной организации сывороточного альбумина ряда позвоночных в онто- и филогенезе, при этом оценивалась изменчивость как отдельных структурно-функциональных центров, так и всей макромолекулы в целом. В соответствии с этим, задачами работы были:
-
Изучить некоторые физико-химические параметры сыворотки крови и гомогенатов ткани печени, как среды функционирования и места синтеза альбуминов.
-
Исследовать аминокислотной состав альбуминов с целью выявления природы изменчивости этих белков как на уровне класса, так и
в разные периоды возрастного развития.
3. Охарактеризовать и сравнить между собой вторичную и третичную .
структуру альбуиинов, включал содоретиие Х-спиралей, $-структуры її неупорядоченных фраге-'эитов, а такка непосредственно определись показатели инкровязаости d специфических областях молекулі балка.
Сопоставить размеры гидрофильных каналов с содержащимися в ник цолекулами связанной води н выяснить ее функциональную) роль. Изучить и сравнить связывагциз параметры рассматриваемых белков с флуоресцентіагш! зондами, включая и термодинамические расчеты, рассмотреть влияние ионоа магния на внутримолекуллрнуп структуру и функциональную аативкость сывороточных альбуминов. . Использовать полученные экспериментальное данные для уточнения зволяционкых взаимоотношении иогзду отдельными систематическими груплаші швотшх, имея в виду, прежде всего, онтогенетические и филогенетические аспекты в структурной организации альбуминов.
Научная новизна. На большой сгісиеримєиїалькоц материале, ох-іатавасщеа аспекта сито- (5 возрастав групп) и филогенеза (пред-ітавитоли круглоротих,риб, гемнозодіек, пресшкащдагся, птиц и ілекопнтасчнх) с поиещьз современных физико-химических к биохкмн-іеских іієтодоз установлено, что иаяроиолекула сывороточного аль-іунина ряда позвоночных представляє? собой слоазіуа готерогеикуп :истеку. Ошяі дали основание утЕерздать, что ыоясяуяа альбуиинов юстонт из гидрофобных областей и гидрофильных зон. Впервш пыяв-їєно, что гидрофобная структура зтііх биополимеров обусловлено, по срайнеЯ мере, наднчнеи областей двух разінх типов: наиболее гидрофобного ядра, универсального для класса и областей специфических, звязанных с проявлением функциональных свойств белка. Показано, что цикровязкость универсального ядра в десять к более раз преш-пает таяовув для специфических гидрофобных областей.
Связанная вода, находящаяся во внутримолекулярных каналах (микропорах), влияет не только на форму и par.меры молекул, но непосредственно и на функциональные свойства специфических гидре фобных областей.
Впервые установлено, что комплексообразование сывороточных альбуминов с гидрофобными соединениями осуществляется в соответствии со специальным механизмом регуляции, в основе которого лежит принцип обратной связи на уровне системы состоящей из функционально активной молекулы белка и гидрофобного лигаида. Количественные аспекты химического взаимодействия между ними определяются количеством центров связывания и величиной энергии связи между ними. Показано, что введение в систему еще одного компонента (ионов магния) приводит в одних случаях к увеличению, а в других - к снижению количества центров связывания при взаимодействии альбуминов с этим лигандом. Это сопровождается обязательным и обратным изменением прочности химического взаимодействия мевду ними.
Ранее считалось, что сывороточные альбумины выступают одним из звеньев регуляции концентрации ионов магния в организме животных и человека. В настоящей работе показано, что ионы магния могут также воздействовать и на альбумин. Характер этого воздействия определяется размерами внутримолекулярных гидрофильных каналов с содержащимися в них молекулами связанной воды. А именно, ' белки, содержащие в своей структуре значительное число молекул воды при ассоциации с ионами магния реагировали некоторым повышением показателя ыикровязкости специфических гидрофобных областей, тогда как альбумины с меньшим количеством воды, наоборот, при данной ассоциации снижали микровязкость этих участков.
7. Показало, что с возрастом под воздействием специфических ме-
іболитов происходят внутримолекулярные перестройки, не затраги-
іодие, однако, регулярные структуры белка. Такие перестройки
ізавапт изменение микровяэкости зон сорбции лшинофоров, наряду
уменьшением числа центров связывания и увеличение константы
іязивания, что ведет, вероятно, к снитстш функциональной акткв-
>сти сывороточного альбумина старых животных и гидрофобиэации
ілекульї белка в целом.
Впервые показано, что по ряду внутримолекулярных параметров сикроокругенне люминофоров и михровязкость зон сорбции зондов) гоцессы онтогенеза повторяют филогенетическое развитие молекулы торотсчного альбумина. По этим параметрам универсальные гидро-1бные ядра и специфические периферийные зоны практически внутри іасса неизменны, к лісп» э классе млекопитающих отмечена нексто-л их вариация. Данные показатели цогут быть использованы в прак-ческих целях в качестве молекулярных маркеров для идентификации вороточного альбумина класса гивотных.
Скорость зволоционного развития разных гидрофобных участксз ет неоднозначно. Отмечены скачки филогенетэтеского развития утркиолекулярноЯ структуры, особенно от класса пресінкасцихся я ицам и к классу млекошітакцих. По калеку мнения, в отл;:чии. ст гцесссв онтогенеза, в i'.'.xorcusze тпягя идет процесс гидрс'оС"-дга вес.;: зен, ч? ;*т.
сравнительное исследование структурно-функциональных свойств сывороточных альбуминов позвоночных разного эволюционного уровня и различных возрастных групп, что дало возможность судить о их внутримолекулярной изменчивости.
Полученные результаты раскрывают важный аспект проблемы сравнительной биохимии сывороточных альбуминов, характериеуя события происходящие в ходе развития и становления их макромолекулярных систем, связанные в основном со структурно-функциональной специализацией определенных компонентов в зависимости от уровня их организации и развития, и как следствие - их функциональной нагрузки.
Эти данные имеют и более общее значение, обусловленное вниманием современной науки х проблеие развития белковых систем вообще
Раскрыты некоторые неизвестные ранее аспекты строения и функционирования сывороточного альбумина, касающиеся местонахождения в его структуре внутримолекулярной связанной вода, а также ее роли в регуляции-коыплексообразования специфических гидрофобных полостей с лигандами. Это существенно, как для оценки структурно-функционального состояния данного белка вообще, так и с точки зрения проблем регуляции комплексообразования компонентов комплекса альбумин-лиганд.
Получены экспериментальные данные, которые позволили по новому охарактеризовать регуляцию комплексообразования альбумина -с некоторыми гидрофобными соединениями в зависимости от наличия в среде ионоз магния. А именно, показано, что этот механизм регуляции имеет в своей основе принцип обратной связи, который реализуется в зависимости от числа центров связывания на молекуле белка и от энергии взаимодействия образующегося комплекса. Эта вза-
имосвязь имеет определенное практическое значение, позволяя предусмотреть особенности комплексообразсвания, а следовательно транспорта и функциональной активности лигандов альбумина в организме с одной стороны, а также активно вмешиваться в этот процесс, изменяя концентраци» в среде ионов магния.
Раскрыты на молекулярном уровне аспекты внутримолекулярных перестроек в процессах онто- и филогенеза. Показано, что в обоих случаях, с возрастом, или с повышением уровня развития организма, идет процесс гидрофобизации макромолекулы сывороточного альбумина. Однако, эти процессы не однозначны. Нам представляется, что в случае онтогенеза процесс гидрофсЗизвции молекулы белка носит негативный характер вследствие действия специфических метаболитов, что ведет к снигвнип функциональной -активности биополимера и позитивный - в филогенезе, как результат аминокислотных замен, определяемый генетически, и ведущий к расширении функциональных свойств альбумина у высокоорганизованных тавотных.
Впервыё\на молекулярном уровне показано, что процессы снто-генеза повторяют филогенез.
Результаты работы могут быть использованы з медицинской практике, так как полученные данные при патологии (цирроз печени, злокачественные опухоли печени и др.) показали,- что молекулярная организация белка претерпевает изменения и приобретает сходство с менее организованными по уроЕ/ю развития сывороточными альбуминами (результаты подучены совместно с Н.В.ТолхачевоЯ).
При обсудцении вопроса о структурно-функциональной специализации сывороточных альбуминов ряда позвоночных в расчет должен .: быть принят вывод о разной степени консервативности "универ-сального". гидрофобного ядра и более поверхностных структур гло-
булы. Вместе с тем следует подчеркнуть, что конформационная изменчивость анализируемых белков обладает значительно большей консервативность» по сравнение с их изменчивостью функциональной. Эти данные имеют достаточно важное теоретическое значение, подтверждая теорию эволюционной консервативности белков.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
I. Функционально активная молекула сывороточного альбумина представляет собой гетерогенную систему, состоящую из гидрофобных областей и гидрофильных зон, в состав которых входит связанная структурированная вода. Связанная вода, находящаяся в структуре альбуминов влияет не только на форму и размеры внутренних областей макромолекул, но и непосредственно на функциональные свойства специфических гидрофобных областей. 2/ Внутримолекулярная гидрофобная структура альбуминов обусловлена наличием областей, по крайней мере, двух разных типов: периферийных зон и наиболее гидрофобного внутреннего ядра. Микрс вязхость универсального ядра в десять и более раз превосходит показатели микровязкости периферийных гидрофобных областей глобулы альбумина ряда позвоночных, включая и человека. Гидрофобные ядра мслекул альбумина является "универсальными" для класса и могут служить его характеристикой. Структура периферийных участков имеет специфические для классов особенности. 3. Специфические, метаболиты организма старых животных вызывают внутримолекулярные перестройки в альбумине, которые не затрагивают регулярные структуры белка. Такие преобразования вызы-. вают изменение микровязкости отдельных участков белковой глобулы, наряду с уменьшением числа центров связывания и увеличением константы связывания зондов с белком, что ведет к сниже-
нив функциональной активности альбумина.
1. По ряду внутримолекулярных параметров (микроохругение люминофоров и михровязкость зон сорбции зондов) показано, что в процессе онтогенеза повторяется филогенетическое развитие молекулы сывороточного альбумина. Данные показатели могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров для идентификации сывороточного альбумина класса животных.
5. Скорость эволюционного развития гидрофобных участков идет неоднозначно. Отмечены скачки филогенетического раззития внутримолекулярной структуры, особенно от класса пресмыкающихся к птицам и к классу млекопитающих. В эволюции внутримолекулярной структуры от класса рыб до птиц преобладание имел структурно-функциональный фактор, в белке їй млекопитающих особенно успешно шло формирование струхтурно-конформационного фактора, то есть гидрофобного ядра.
э. На основании всего комплекса полученных данных высказано предположение, что комплексообразозание сывороточных альбуминов с гидрофобными соединениями осуществляется специальными механизмами регуляции, в основе которых лежит принцип обратной связи на уровне функционально-активной молекулы белка. Предложены возможные механизмы регуляции конплексообразования альбумина с лигандами, гидрофобизации биополимера в процессах онтогенеза и. внутримолекулярной эволюции белка в ряду позвоночных."
Апробация работы. Материалы диссертации были представленії и .окладызаллсь на ІУ Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 979г.), на 1 Всесоюзне;.: биофизическом съезде (Москва,1952г.), а УШ Совещании по эволюционной-физиологии памяти акад. Л.А.Среди (Ленинград,1932г.), на П и Ш Международной конференции "Зо-
да и ионы в биологических системах" (Бухарест,1982,1984 г.г.), на Л Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Рига,1'^83г.), на У Республиканской съезде генетиков и селекционеров Украины (Умань,1986г.), на У и УІ Украинских биохимических съездах (Ивано-Франковск, 1987г., Киев,І992г.), на У Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси,1989г.), на УШ Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1990г.), на ІУ Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992г.), на заседании Крымского отделения Всесоюзного биохимического обшества (1990г.),
Апробация работы состоялась 16 октября 1990г. на заседании Секции молекулярных основ эволюции функций Института эволюционной' физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова АН СССР.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, 3 глав собственных результатов с их обсуждением, выводов и списка литературы (360 источников). Материал изложен на 237 страницах, содержит 30 рисунков и 32 таблицы.
