Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Белки-маркеры процессов роста 7
I. Глобулины 8
2.Глобулины 12
3. Характерный для злокачественного и нормального роста 15
Глава II. Строение и свойства иммуноглобулина 26
Экспериментальная часть
Глава III. Объект и методы исследования 39
1. Объект исследования 39
2. Методы исследования 39
Глава ІV.Выявление и идентификация -маркера роста в сыворотке молока стельных коров 52
1. Получение и общая характеристика сыворотки молока 52
2. Хроматография белков сыворотки молока с целью выявления маркера роста 58
3. Потенциометрическое титрование сывороток молока 67
4. Препаративное получение белка-маркера роста из сыворотки молока стельных коров и его идентификация 70
Глава V. Физико-химические свойства У&Cr, характерного для стельности Р 79
1. Молекулярная масса 84
2. йзоэлектрическая точка 85
3. Аминокислотный состав 86
Глава УІ .Разработка метода диагностики стельности по сыворотке молока 88
Заключение 98
Выводы 102
Список использованной литературы 104
- Глобулины
- Строение и свойства иммуноглобулина
- Объект исследования
- Получение и общая характеристика сыворотки молока
- Молекулярная масса
Введение к работе
До настоящего времени в системе воспроизводства крупного рогатого скота актуальным остается вопрос разработки простых и широкодоступных для практического применения методов ранней диагностики стельности, что тлеет огромной значение для повышения продуктивности крупного рогатого скота, а это является одним из главных направлений выполнения Продовольственной программы нашей страны.
В настоящее время не вызывает сомнения то, что наличие в организме человека и животных активного очага роста, нормального или злокачественного, вызывает ответную реакцию всего организма. Такая перестройка со провощается изменениями белкового состава физиологических жицкостей, в том числе и молока. В настоящей работе впервые проведены исследования, связанные с поиском белков-маркеров стельности в молоке коров. Проведение таких исследований важно не только в плане решения прикладных вопросов, касающихся разработки методов диагностики стельности, но и их результаты могут оказаться ценными как для понимания основ биохимических процессов активного роста в организме животных, так и белковой химии в целом.
Теоретической предпосылкой проводимых исследований послужили данные В.П.Короткоручко о том, что в сыворотке крови человека и животных при процессах активного роста появляется особая популяция vcUf, которая не выявляется при равных условиях в сыворотке крови людей и животных без очагов активного роста. Автором была выдвинута концепция общности процессов нормального и злокачественного роста на уровне биосинтеза новых белковых популяций, в частности белка, представляющего собой одну из субпопуляций антител _ 4 - класса с/Ь-6", в дальнейшем получившего название белка-маркера роста. Именно выявление этого белка и было положено в основу разработки В.П.Короткоручко и И.И.Кузьменко метода диагностики стельности по белкам сыворотки крови, который в дальнейшем был усовершенствован.
При всех достоинствах этого метода известно, что постановка методики связана с взятием крови, сама процедура которой трудоемка и сопровождается стрессовой ситуацией для животного, что в свою очередь вызывает снижение продуктивности. Учитывая все это, казалась перспективной попытка обнаружить и изучить такой белок в сыворотке молока с целью использования молока как объекта для исследований. Появление такого белка в молоке можно было ожидать исходя из того, что по существующим литературным данным "ty^7 крови поступает в молоко.
Таким образом, главную задачу настоящей работы составили исследования, связанные с обнаружением и выделением Jq,(j -маркера стельности из сыворотки молока стельных коров, идентификацией природы этого белка и изучением физико-химических особенностей и иммунологических свойств, а также сравнение с белком-маркером стельноети,ранее обнаруженным в крови стельных коров и нетелей с целью разработки нового метода диагностики беременности.
Решение поставленной задачи требовало проведения экспериментальных исследований, связанных прежде всего с разработкой достаточно простого метода получения сыворотки молока, свободной от примесей казеина, выпадение которого в осадок при кислых значениях рН исключает возможность регистрировать результаты комплексо-образования, а также получения гомогенной фракции иО-Ь при ионообменной хроматографии сывороток молока. Получение такой сыворотки молока необходимо было проводить в условиях, исключающих возмож- ность денатурации белковых молекул.
В исследованиях' были использованы как самые современные, так и классические методы белковой химии и иммунохимии. В частности, были использованы различные хроматографические методы, в том числе хроматофокусирование и разделение белковых смесей при помощи системы FrbC, электрофорез на различных поддерживающих средах, иммуноэлектрофорез, изоэлектрофокуоирование, разделение белков на селективных мембранах с использованием аппаратуры "JkmlzorC* и целый ряд других методов.
Проведенные исследования позволили показать, что в сыворотке молока стельных коров, полученной по методике, исключающей присутствие в ее составе молекул казеина, появляется особая субпопуляция молекул "фСг, которая не выявляется в сыворотке молока нестельных животных. Причем, появление такого сЛаСт обусловлено не количественным, а качественным изменением белкового спектра молока при стельности. При изучении физико-химических свойств, этого белка было установлено, что он обладает несколько меньшей молекулярной массой, его изоэлектрическая точка сдвинута в щелочную область, а главное, он образовывал нерастворимые в кислой среде комплексы с белками, обладающими электрофоретической подвижностью cL -глобулинов. Изучение состава показало их полную идентичность комплексам, образующимся в тех же условиях в сыворотке крови стельных животных. Получение: кроличьей моноспецифической антисыворотки против обнаруженного valr и проведение иммунологических исследований свидетельствовало о полной иммунологической идентичности обнаруженного Jcl (j ранее выявленному в крови стельных животных ^^% характерному для стельности. Совокупность полученных результатов позволила прийти к выводу, что в крови и молоке стельных животных появляется идентичная субпопуляция молекул UaЬ-маркеров стельности.
Полученные результаты дают возможность разработки метода ранней диагностики стельности крупного рогатого скота по сыворотке молока, в основе которого лежит склонность <^^, характерного для стельности, образовывать в кислой среде при строго определенном значении рН нерастворимые белковые комплексы. Для решения поставленной задачи было использовано потенциометрическое титрование исследуемых сывороток молока раствором азотной кислоты при постоянном перемешивании и контроле рН реакционных смесей до рН, при котором теряется прозрачность кислых растворов сыворотки молока, обусловленного образованием нерастворимых белковых комплексов при рН 1,30. Лабораторная, а затем и производственная проверка в ряде хозяйств показала, что метод позволяет диагностировать стельность с 20 дня после осеменения и обладает высокой степенью точности. Перевод метода на автоматическую основу с использованием ранее созданного для диагностики злокачественных заболеваний электронно-автоматической аппаратуры "Рост" позволит исключить субъективность оценки результатов, что повысит его точность и даст возможность серийного определения стельности в производственных условиях.
Глобулины
Изменение белкового спектра физиологических жидкостей человека и животных является одним из важных и наиболее динамичных показателей состояния организма. Обнаружение специфических дис-протеинемий может служить основой для разработки методов раннего выявления очагов как нормального, так и злокачественного роста. Особенно важен в этом плане поиск новых,специфических для процессов роста белков. Выявление и изучение этих белков представляет значительный интерес не только для диагностических целей, но и для изучения биохимических основ процессов роста. В настоящее время актуальность таких исследований заключается в разработке доступных для широкого практического применения простых и надежных методов дифференциальной диагностики процессов нормального и злокачественного роста, так как разработка ранних методов диагностики злокачественных заболеваний является краеугольным камнем в борьбе с ними. Исходя из этого, приятно настойчивое стремление специалистов самых различных областей науки обнаружить белки, которые были бы характерны для нормального и злокачественного роста.
Основную цель настоящего обзора составила систематизация и анализ многочисленных литературных данных, посвященных выявлению, выделению и изучению белков, характерных для процессов роста. Оцнако, исходя из задач настоящей работы, основное внимание будет уцелено субфракции JQ.LT , появляющейся в крови организмов с очагами активного роста, которую впервые обнаружил и описал В.П.Ко-роткоручко /57,387.
Строение и свойства иммуноглобулина
Иммуноглобулин L7 относится к классу белков, выполняющих в организме функцию антител. В настоящее время-белки этого класса, кроме крови, обнаружены также в слюне, моче, молоке, спинномозговой жидкости, лимфатических узлах, селезенке и в других тканях организма.
Все иммуноглобулины построены по одному принципу и представляют собой гликопротеиды /147, отличающиеся крайне высокой степенью гетерогенности /767. В настоящее, время выделено пять основных классов иммуноглобулинов, которые обозначены как Ja,+JvL Jot /6,67,68,697. Все эти иммуноглобулины способны избирательно связывать антигены, образуя специфические комплексы. Реакции связывания антитела с антигеном настолько специфичны, что позволяют различать замену в антигене одного из 1000 аминокислотных остатков.
Несмотря на высокую степень гетерогенности все иммуноглобулины построены из четырех полипептидных цепей, две из которых представляют собой легкие цепи и две тяжелые. В молекуле белка эти цепи связаны дисульфидными связями.
Принадлежность иммуноглобулина к тому или иному классу определяется типом тяжелой цепи, состоящей из 450-560 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу 50000-70000 дальтон. В состав %G входит J Ггеш&ипьЖЛ -J frnJ цепь, $Х $- оС /альфа/ цепь,с/аЬО -d/дельта/ цепь и %ja,L - С/эпсилон7 цепь. Кроме того, в составе UcLjt и Jaftобнаружена также L /цепь/. Легкие цепи иммуноглобулинов состоят из 210 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу порядка 22000 дальтон. В составиммуноглобулинов, независимо от класса, входят легкие цепи двух типов либо 36 .
Исходя из того, что объектом проведенных исследований являлся vQ&, основное внимание в обзоре будет уцелено белкам именно этого класса.
Объект исследования
Объектом исследования служили сыворотки молока и сыворотки крови стельных и нестельных коров. Пробы молока брались от каждого животного после индивидуального выдаивания и хранились в рефрижераторе не более 24 часов при температуре 4-6С. Кровь бралась из яремной вены, сыворотку крови получали по общеизвестной методике.
Состояние половых органов и наличие стельности контролировалось ректальным исследованием. Уточнение сроков стельности проводили по записям осеменений в журнале регистрации осеменений.
Подопытными животными служили коровы черно-пестрой породы совхозов им.60 лет СССР Броварского и "Бориспольский" Борисполь-ского районов, Киевской области.
Получение и общая характеристика сыворотки молока
Для получения сыворотки молока, отвечающей требованиям эксперимента, был использован метод изменения ионной силы раствора и температурного режима осаждения основной массы казеина с последующим отделением образовавшегося осадка путем вакуумной фильтрации через мелкопористые фильтры. Однако такой метод не позволил решить поставленную задачу. В получаемой сыворотке молока присутствовала мелкодисперсная взвесь белков, состоящая в основном из казеина. Удалить эту взвесь не удалось и при использованиидля фильтрации аппаратуры фирмы "Амикон" с применением мембранных фильтров, позволяющих отделить белки и белковые комплексы, молекулярная масса которых превышает 200000 дальтон. Оказалось, что ультрафильтраты содержат казеин, что, по-видимому, объясняется высокой гетерогенностью этого белка с характерным для него большим разбросом молекулярной массы. Последнее не исключает, что помимо всего возможна поте ря белка-маркера.
Как и следовало ожидать, мы не получили желаемого результата путем осаждения казеина с помощью изменения температурного режима кислотного титрования проб молока, в частности, снижения его до 2-4С.
Такие результаты диктовали разработку нового приема получения сыворотки молока, в основе которого лежит одновременное изменение кислотности и ионной силы исследуемых сывороток молока. Основная сущность методики заключается в следующем.
Пробы цельного молока, полученные от стельных и нестельных животных,разливались в химические стаканы и помещались на магнитную мешалку. При постоянном перемешивании и контроле рН при помощи иономера ЭВ-74 со стеклянным электродом ЭЛО-43-07 пробы молока титровались I Н раствором соляной кислоты до рН 4,5. Для полного сформирования сгустка казеина протитрованное молоко отстаивалось при комнатной температуре в течение 30 минут
Молекулярная масса
Как уже указывалось в предыдущей главе, гомогенная субфракция /W/ t характерного для стельности, свободная от примесных белков этого класса, может быть получена из сыворотки молока стельных животных при разделении ионообменной хроматографией нерастворимых в кислой среде комплексов, образующихся в сыворотке молока таких животных при рН 1,30 в случае титрования азотной кислотой нативных сывороток молока и при рН 0,68 в случае титрования солянокислых растворов таких же сывороток молока после их концентрации.
Использование хроматографических методов не позволяет выделить непосредственно из сыворотки молока чистую субпопуляцию молекул U&u , характерного для стельности, не содержащую белков этого класса, присутствующих как в сыворотке молока стельных,так и нестельных животных.
Исходя из этого, для определения физико-химических параметров изучаемого белка использовалась субфракция белка, выделенная из состава агрегатов. _
Для получения vCkW , характерного для стельности, необходимого для проведения исследований, применялось хроматографическое разделение комплексов, образуемых этим белком и о-глобулином при титровании несконцентрированной сыворотки молока стельных коров азотной кислотой до рН 1,30. Ранее было показано, что процесс образования нерастворимых комплексов при рН 0,68 не сопровождается рН-инициируемыми необратимыми денатурац ионными переходами белков- партнеров по агрегатообразованию и выделяемый из их состава OuLr по строению практически не отличается от нативного белка / 657 -Однако, в случае использования для опытов сыворотки молока стельных коров, изменение условий выделения этого белка было вызвано тем, что соблюдение указанных условий требовало, как уже говорилось выше, значительной концентрации белковых растворов, что, в свою очередь, не позволяло исключить возможности деструктивных изменений белковых молекул в процессе концентрации.
