Введение к работе
Актуальность проблемы.
Дыхательная цепь прокариот вариабельна и отражает пути адаптации каждого
представителя к условиям окружающей среды. Среди бактерий обнаружены
представители как с протонным типом сопряжения дыхания с окислительным
фосфорилированием, так и с натриевым. У бактерий независимо от типа сопряжения
дыхательная цепь на конечном участке, как правило, разветвлена и представлена
несколькими редокс-зависимыми оксидазами. Гало- и алкалотолерантная бактерия
Bacillus pseudofirmus FTU, согласно последним филогенетическим исследованиям,
относится к кластеру 6 алкалофильных Bacillus. Ее дыхательная цепь по данным
Костырко и соавт. (Kostyrko et al., 1991) характеризуется смешанным типом
сопряжения: начальный сегмент содержит как Ка+-зависимую, так и протонную
NADH-хиноноксидоредуктазу; пункт III - хинон-цитохром-с-редуктазу протонного
типа; концевой сегмент, как было показано ранее, представлен цитохром-с-оксидазой
саа-типа. и оксидазой ЪЪ-типа. Для алкалофильных и алкалотолераптных бактерий,
принадлежащих к роду Bacillus, установлена инверсия ДрН по сравнению с
нейтрофилами, т.е. при щелочных значениях рН снаружи рН внутри остается более
кислым, чем снаружи на 0.5-2 единицы. Расчеты показывают (Skulachev, 1994;
Krulwich et al., 2001), что у таких бактерий, несмотря на более высокую Дц; по
сравнению с нейтрофилами, результирующая ДрН* имеет более низкое значение.
Очевидно, что на начальном сегменте дыхательной цепи, где у Bacillus pseudofirmus
FTU одна из NADH-оксидаз №+-зависима, проблема с низким ДрН при щелочных рН
решается за счет переключения бактерий на использование ДрИа*. Что касается
терминального участка, то одним из приспособлений у щелочелюбивых бактерий
группы Bacillus, а также у термофильных бактерий Thermus thermophilus, можно
считать наличие в их мембране цитохром-с-оксидазы саа3-типа. Для Bacillus firmus
OF4 показано, что даже частичный дефицит по этой оксидазс ввиду мутации делает
эту бактерию неспособной к щелочному образу жизни (Krulwich, 1996). Следует
отметить, что на фоне подробного исследования молекулярно-биологических
особенностей оксидаз саа3-типа вопрос об эффективности их работы в качестве
ионного насоса остается открытым. Изучение эффективности функционирования
оксидазысаа,типакакпомпыпредставляетинтереснетоугж""Л)изиодст,.у^гл,-у"-й-- -
РОС. Н\ЦУ0НАЛ1»ЦДЯ
л Ji«WUVOTEKA
ОЭ 200^(акт
точки зрения, но и в теоретическом отношении, поскольку в отличие от цитохром-с-оксидазы аа3-типа высших организмов и некоторых бактерий данный генератор энергии является не четырех, а пятикомпонентным по редокс-центрам. До настоящего времени оставалась до конца не выясненной природа второй терминальной оксидазы, а также механизм трансформации энергии этим комплексом у Bacillus pseudofirmus FTU. Ранее показано, что в мембране этой бактерии содержатся гемы А, В, С, но отсутствует гем О (Muntyan et al., 1995). Поэтому на порядок менее чувствительная к цианиду дыхательная активность мембран бактерий была отнесена к оксидазе bb-типа. Более подробные характеристики этого фермента не были исследованы не только на бактериях Bacillus pseudofirmus FTU, но сведения об оксидазах этого типа у бактерий рода Bacillus в литературе отсутствовали полностью. До сих пор считалось твердо установленной принадлежность оксидаз cbb3-muna. только подразделению протеобактерий. Поэтому углубление исследований оксидазы bb-типа Bacillus pseudofirmus FTU представлялось весьма актуальным.
Пути адаптации бактерий к условиям изменяющейся окружающей среды не ограничиваются изменениями состава дыхательных цепей. Одним из важнейших механизмов адаптации прокариот к изменяющейся щелочности и солености среды обитания является изменение липидного состава мембран (Russell, 1989). Пути регуляции энергообеспечения в условиях адаптации бактерий (стрессовые условия) мало изучены. Концепция свободного окисления В.П. Скулачева (Скулачев, 1962; Скулачев, 1969) позволяет объяснить большое число физиологических функций дыхательных цепей клетки, в том числе и в стрессовых условиях. Перспективным подходом к выяснению путей регуляции энергообеспечения у бактерий могло бы стать исследование эффекта "мягких" разобщителей на энергосопрягающую систему факультативных экстремофилов. Основной объект, гало- и алкалотолерантная бактерия Bacillus pseudofirmus FTU, и экспериментальная база настоящей работы, представляют удобную модель для проведения такого исследования, которое могло бы существенно расширить понимание механизмов адаптации бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды.
Цель работы заключалась в исследовании механизма трансформации энергии терминальными оксидазами гало- и алкалотолерантной бактерии Bacillus pseudofirmus FTU. Для проведения такого исследования были поставлены следующие задачи:
1) реконструировать выделенную и очищенную оксидазу саа3типа из Bacillus pseudofirmus FTU в азолектиновые липосомы; 2) определить на полученных протеолипосомах природу сопрягающего иона и эффективность трансформации энергии для оксидазы саа3-типа; 3) исследовать влияние жирных кислот на энергосопрягающую систему целых клеток и протеолипосом с оксидазой саа3-типа; 4) проверить гипотезу М.С.Мунтян о наличии оксидаз сЪЪ-типа. у бактерий рода Bacillus, дать прогноз типа энергетического сопряжения этой оксидазой и изучить условия индукции этой оксидазы.
Новизна работы. Разработана методика реконструкции терминальной оксидазы саа3-типа Bacillus pseudofirmus FTU в липосомы с получением протеолипосом, пригодных для измерения транспорта Н+. Впервые определена эффективность трансформации энергии оксидазой саа-типа. (Н+/е") при транслокации протона через мембрану и зависимость этого показателя от рНн1р.
Показано разобщающее действие жирных кислот на энергосопрягающую систему бактерии Bacillus pseudofirmus FTU. Доказано, что жирные кислоты могут служить "мягкими" разобщителями мембранного потенциала на протеолипосомах со встроенной цитохромоксидазой.
Впервые для бактерий рода Bacillus на примере Bacillus pseudofirmus FTU и Bacillus halodurans 2513 DSM показано наличие в геноме оперона ccoNOQP, кодирующего оксидазу сЪЪ-типа.
Практическое значение. Проведенные исследования позволили выявить новые фундаментальные закономерности в организации функционирования терминального участка дыхательной цепи бактерий рода Bacillus: 1) наличие неизвестного ранее для бактерий из подразделения Firmicuta оперона оксидазы сЪЪ3 -типа; 2) эффективность работы протонных насосов пятикомпонентных по редокс-центрам (оксидазы саа3-типа) сравнима с четырехкомпонентными (оксидазы аа3-типа). Установленная нуклеотидная последовательность генов субъединиц оксидазы cbb-muna. в бактерии Bacillus pseudofirmus FTU позволяет, во-первых, определить группу родственных ферментов (подсемейство FixN), во-вторых, выявить филогенетически близкие организмы. Кроме этого, информация о структуре генов оксидазы сЬЬ3-типа бактерий рода Bacillus может быть использована для идентификации полипептидов, входящих в состав комплекса, по N-концевым
аминокислотным последовательностям. Исследование влияния жирных кислот на энергетику бактерий расширяет понимание путей адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям в экстремальных условиях обитания.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2000, 2001, 2003), на международной конференции «Митохондрии, .клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), на VIII Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2001), на 11" Европейской биоэнергетической конференции (Брайтон, Великобритания, 2000), па III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы и изложена на f23 страницах машинописного текста, включая Є таблиц, fS рисунков, 4t фотографии. Список цитируемой литературы включает /^^наименований.
