Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Декстраны и декстранолитические ферменты 12
1.1 Структура и свойства декстранов 12
1.2 Классификация декстранолитических ферментов 14
1.3 Источники, свойства и механизм действия декстраназ 16
1.3.1 Грибные декстраназы 16
1.3.2 Дрожжевые продуценты 27
1.3.3 Бактериальные источники 28
Глава 2 Функция декстраназ в метаболизме микроорганизмов 31
Глава 3 Методы измерения декстраназной активности 33
Глава 4 Применение декстранолитических ферментов 36
4.1 Биомедицинское направление 36
4.2 Применение декстраназ в стоматологии 37
4.3 Декстраназы в сахарной промышленности 38
Собственные исследования 41
Глава 5 Объекты и методы исследований 41
5.1 Объекты исследований 41
5.2 Материалы и реагенты 41
5.3 Микробиологические методы 42
5.3.1 Накопительные питательные среды для проведения скрининга 42
5.3.2 Твердая питательная среда 43
5.3.3 Жидкие питательные среды для наработки образцов декстраназ 44
5.3.4 Условия инокуляции и хранения продуцентов декстраназ 44
5.3.5 Почвенные образцы и их подготовка для выделения новых бактериальных изолятов 45
5.4 Методы таксономических исследований 45
5.5 Физико-химические и биохимические методы исследований 46
5.5.1 Получение ферментных препаратов 46
5.5.2 Изучение реакционной специфичности декстраназ выделенных штаммов 46
5.5.3 Определение декстраназной активности 47
5.5.3.1 Полуколичественный метод определения декстраназной активности 47
5.5.3.2 Определение активности с помощью нерастворимого окрашенного субстрата 47
5.5.4 Основные этапы выделения и очистки декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д 49
5.5.4.1 Изучение аффинной адсорбции 51
5.5.5 Определение концентрации белка 52
5.5.6 Изучение физико-химических и каталитических свойств очищенной декстраназы 52
5.5.6.1 Определение рН-оптимума очищенной декстраназы 52
5.5.6.2 Определение температурного оптимума и термостабильности очищенной декстраназы 53
5.5.6.3 Гель-электрофорез и изоэлектрическое фокусирование 53
5.5.6.4 N-терминальный аминокислотный анализ 55
5.6 Обработка экспериментальных данных 55
ГЛАВА 6 Результаты и их обсуждение 56
6.1 Скрининг микроорганизмов, секретирующих декстраназу 56
6.2 Таксономический анализ выделенных изолятов 59
6.3 Изучение реакционной специфичности декстраназ выделенных штаммов 68
6.4 Разработка процедуры определения декстраназной активности при помощи нерастворимого окрашенного субстрата 70
6.5 Очистка и характеристика декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д 75
6.5.1 Очистка декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д 76
6.5.2 Характеристика физико-химических свойств препарата очищенной декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д 85
Заключение 90
Выводы 93
Список литературы 94
- Грибные декстраназы
- Методы измерения декстраназной активности
- Основные этапы выделения и очистки декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д
- Разработка процедуры определения декстраназной активности при помощи нерастворимого окрашенного субстрата
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ферменты, деполимеризующие декстран, а также продуцирующие их микроорганизмы, уже достаточно длительное время являются объектом интенсивных исследований. Повышенный интерес к декстраназам обусловлен, прежде всего, возможностью их использования для получения продуктов частичного или полного расщепления декстранов, которые находят все большее практическое применение [Day D.F., Kim D., 1993; Kim D., Day D.F., 1994, 1995c, Kubic C. et al., 2004]. Эти ферменты представляют также интерес в теоретическом аспекте, например, при изучении структуры природных полисахаридов [Cote G.L. et al., 1999]. Еще одна причина, которая привлекает внимание к декстраназам, является возможность их использования для удаления декстрана из производственных потоков, поскольку его присутствие затрудняет промышленный процесс получения сахара и анализ продуктов. [Bruijn J.M., 2000; Chavan S.M. et al., 2001]. Важной сферой практического применения декстранолитических ферментов является профилактика и лечение кариеса зубов. Интерес к декстраназам в этом направлении не ослабевает, о чем свидетельствует возрастающее количество публикаций, а также наличие противокариесных препаратов, выпускаемых зарубежной и отечественной промышленностью [Shimada К. et al., 1984; Kim D. et al., 2001; Kim D. et al., 2003, TsuchiyaR., 2001].
Декстраны представляют собой группу высокомолекулярных бактериальных экзополисахаридов, состоящие в основном из а-1,6-связанных D-глюкопиранозных единиц. Основными продуцентами этих полисахаридов являются микроорганизмы рода Leuconostoc и Streptococcus [Sidebotham R.L., 1974; Hamada S., Slade H.D., 1980; Monchois V. et al., 1999; Monsan P. et al., 2001]. В расщеплении декстранов участвует ряд ферментов, различающихся по специфичности и механизму действия. По способу действия на субстрат эти ферменты обычно делят на эндо- и экзо-декстраназы. Однако, более детальное
8 исследование каталитического воздействия различных декстраназ позволило разделить их на декстраназу (К.Ф. 3.2.1.11), экзо-1,6-а-глюкозидазу (К.Ф. 3.2.1.70), глюкан 1,6-а-изомальтозидазу (К.Ф. 3.2.1.94), декстран-1,6-а-изомальтотриозидазу (К.Ф. 3.2.1.95) и декстран а-1,2 разветвляющий фермент (К.Ф. 3.2.1.115) [Enzyme nomenclature, 1992]. В офицальный список ферментов пока не включена циклоизомальтоолигосахарид глюканотрансфераза, обнаруженная у двух представителей рода Bacillus, которая отличается по механизму действия от всех вышеназванных [Oguma Т. et al., 1993].
Ферменты, расщепляющие декстран, обнаружены у различных групп микроорганизмов, включая бактерии, плесневые грибы, дрожжи, а также у животных [Розенфельд Е.Л., Саенко А.С., 1963; Преображенская М.Е., Розенфельд Е.Л., 1970; Preobrazhenskaya М.Е. et al., 1974; Gianfreda L. at al., 1979], человека [Саенко A.C., 1963] и высших растений [Heyn, A.N.J., 1970; 1981]. Есть данные об образовании эндодекстраназ актиномицетами [Виноградова К.А. и др., 1975]. В настоящее время многие из этих ферментов выделены в чистом виде и их свойства подробно изучены.
Грибные продуценты, как правило, синтезируют внеклеточные декстраназы эндо-типа. Среди дрожжевых культур описаны продуценты как эндо-декстраназ, так и экзо-1,6-а-глюкозидаз. Особенностью бактериальных продуцентов является способность большинства из них к биосинтезу одновременно нескольких глюкозидаз, отличающихся по локализации и субстратной специфичности, что имеет определенный биологический смысл.
Помимо применения традиционных методов отбора и селекции предпринимаются попытки получения бактериальных продуцентов декстраназ с помощью генной инженерии. В данной области значительный интерес представляют работы по клонированию генов экзо- и эндо-декстраназ, получившие распространение последние 10-14 лет [Lawman P., Bleiweis A.S., 1991; Whiting G.C. et al., 1993; Wanda S.-Y., Curtiss R., 1994; Igarashi T. et al., 1995; Oguma T. et al., 1999; Garcia B. et al., 2001; Larsson A.M. et al., 2003]. В настоящее время известно около 11 нуклеотидных последовательностей генов
9 декстраназ родов Streptococcus, Arthrobacter, Penicillium, Paenibacillus [EMBL/GenBank; SWISS-PROT]. Декстран-гидролизующие ферменты представляют собой совершенно разные в генетическом отношении структуры, о чем свидетельствует новая классификационная система ферментов, основанная на сравнении степени сходства их аминокислотной последовательности [Henrissat В., 1991; Henrissat В., Bairoch А., 1993; 1996; Henrissat В., Davies G.J., 2000].
Декстранолитические ферменты аэробных спорообразующих бактерий встречаются крайне редко и являются малоизученными, поскольку в литературе описано около пяти - шести продуцентов декстраназ.
Цель исследования
Выделение новых штаммов аэробных спорообразующих бактерий, синтезирующих декстранолитические ферменты, разработка метода очистки декстраназы наиболее активного штамма и характеристика физико-химических свойств очищенного препарата.
Задачи исследования
1. Создать коллекцию аэробных спорообразующих бактерий-
продуцентов внеклеточных ферментов, расщепляющих декстран.
Изучить таксономическое положение выделенных культур.
Адаптировать процедуру количественного определения декстраназной активности для бациллярных штаммов.
Разработать метод очистки декстраназы наиболее активного штамма и исследовать физико-химические свойства очищенного фермента.
Научная новизна
Обнаружено, что почвенные аэробные спорообразующие бактерии, секретирующие декстраназы, формируют фенотипический кластер, близкий по морфолого-биохимическому описанию к группе Bacillus circulans [Bergey D., 1986; Gordon R.E., 1973]. Установлено, что коллекционный штамм ИБ-101Д близок в филогенетическом отношении к новому, недавно описанному виду аэробных спорообразующих бактерий Paenibacillus illinoisensis. Таким образом,
10 впервые показано наличие декстраназной активности внутри родовой группы Paenibacillus.
Проведено подробное исследование физико-химических свойств высокоочищенного препарата декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д. Установлена множественность форм секретируемой декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д, одна из которых является доминирующей, а две другие - ее производными. Не выявлено гомологии между N-концевой аминокислотной последовательностью декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д и известными декстраназами, секвенированными к настоящему времени.
Научно-практическая значимость работы
Создана коллекция новых штаммов аэробных спорообразующих бактерий, способных экстрацеллюлярно секретировать ферменты, гидролизущие декстран. Предложена процедура измерения декстраназной (К.Ф. 3.2.1.11) активности, основанная на использовании в качестве субстрата сефадекса G-200, окрашенного красителем «ремазол ярко-синий» (RBB). Метод может быть рекомендован для исследований по отбору продуцентов и очистке декстранолитических ферментов. Разработана новая эффективная схема очистки декстраназы, которая состоит из этапов осаждения фермента сульфатом аммония, фракционирования растворами полиэтиленгликоля, экстракции в условиях двухфазной системы и анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. Данный метод очистки позволяет получать препараты декстраназ с высокой удельной активностью, что имеет значение в разработке технологии высокоочищенных микробных ферментных препаратов.
Апробация работы
Результаты исследований были представлены на конференции "И. П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины" (Уфа, 1999); XII Юбилейной конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 2001); Международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001); "Japan-Finland Joint Seminar on New Aspects in Microbial Biotechnology", (Japan, 2004).
Диссертация апробирована на научном семинаре отдела Биотехнологии
* Института биологии УНЦ РАН (протокол № 8 от 02.11.2004 г.).
Диссертация апробирована на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол № 15 от 02.12.2004 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе две статьи.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 20 рисунков и 6 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (2 главы), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 220 источников (18 отечественных и 202 зарубежных).
#
Грибные декстраназы
Известно, что декстрансахараза катализирует синтез глюканов, в молекуле которых содержится 50 % и более а-1,6-гликозидных связей [Monsan P. et al., 2001]. Декстраны, образуемые различными видами и штаммами микроорганизмов, не идентичны по своему строению [Jeanes W.C. et al., 1954]. Более того, существенное влияние на их структуру оказывают условия культивирования микроорганизмов, а также условия протекания ферментативной реакции синтеза полисахаридов [Sidebotham R.L., 1974; Cote G.L, Robyt J.F., 1983; Walker GJ. et al., 1990; Kim D., Robyt J.F., 1995a; Padmanabhan P.A., Kim D.-S., 2002; Kim D. et al., 2003]. Основные физико химические свойства декстрана, в т.ч. такие как растворимость и вязкость, определяются степенью его разветвленности, количеством и длиной боковых цепей, молекулярным весом [Mehvar R., 2000]. Степень разветвлений может варьировать в интервале 0,5-60 %, при этом установлено, что с их увеличением водорастворимость декстранов снижается. Глюканы, содержащие более 43 % а-1,3-гликозидных связей, принято считать нерастворимыми в воде [Mehvar R., 2000]. Наиболее изученные, используемые в промышленности штаммы бактерий L. mesenteroides NRRL В-512 или B-512F, продуцируют растворимые линейные а-1,6-глюканы, которые содержат около 5 % а-1,3-гликозидных цепей различной длины (50-100 остатков) [Sidebotham R.L., 1974; Robyt J.F., Walseth T.F., 1979; Santos M. et al., 2000; Tirtaatmadja V. et al., 2001]. Известны представители рода Leuconostoc, продуцирующие глюканы, которые состоят из водорастворимых фракций S и водонерастворимых фракций L [Bourne E.J. et al., 1972; Cote G.L, Robyt J.F., 1983]. Например, у штамма Leuconostoc mesenteroides В-1299 обнаружены внеклеточные и внутриклеточные декстрансахаразы, ответственные за синтез фракции L, содержащей, наряду с а-1,6-гликозидными связями, 27 % а-1,2- и 1 % а-1,3-гликозидных связей, и фракции S, содержащей 35 % а-1,2-разветвленных связей [Bourne E.J. et al., 1972; 1974; Kim D., Robyt J.F., 1995b; Dols M. et al., 1997]. Качественно отличается и структура декстранов, синтезируемых штаммом L. mesenteroides В-742 [Kim D., Robyt J.F., 1995а]. Установлено, что декстраны с низкой степенью ветвления хорошо гидролизуются эндо-декстраназой, тогда как высокоразветвленные декстраны, такие как В-1142, В-742, и В-1299, устойчивы к действию этого фермента [Kim D., Robyt J.F., 1995b].
Бактерии рода Streptococcus продуцируют водорастворимые а-1,6-глюканы, относимые к декстранам, а также, так называемые «мутаны», имеющие в своем составе более 50 % а-1,3-гликозидных связей с небольшим количеством боковых а-1,6- и а-1,4-гликозидных связей [Gibbons R., Houte J. 1975; Hamada S., Slade H., 1980; Davis H. et al., 1986; Cheetham N. et al., 1991; MonsanP. etal., 2001]. Другой важной физико-химической характеристикой декстранов является степень полидисперсности [Mehvar R., 2000]. Нативный декстран, выделяемый из культуральной жидкости L. mesenteroides B-512F, гетерогенен по составу и содержит как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фракции ( 105 кДа). Чем ниже общий молекулярный вес декстрана и чем больше в нем низкомолекулярных фракций, тем выше его коллоидно-осмотическое давление и меньше вязкость [Козинер В.Б., 1966]. Обычно степень полидисперсности снижают в результате частичного кислотного гидролиза и фракционирования этих полимеров. В настоящее время для исследовательских целей доступны декстраны со средним молекулярным весом до 2000 кДа и со значением полидисперсности 1,5. Растворы, содержащие низкомолекулярные (40 кДа) или высокомолекулярные (70 кДа) фракции декстрана, известные под названием «клинический декстран», используют в качестве кровезаменителей [Mehvar R., 2000].
Ферменты, способные расщеплять декстран, составляют довольно обширную группу, которая включает различные гидролазы и трансферазы. Традиционно, по механизму действия на субстрат, ферменты, гидролизующие декстраны, подразделяют на эндо- и экзо-декстраназы. Согласно номенклатуре ферментов [Enzyme nomenclature, 1992], основанной на типе катализируемой реакции и субстратной специфичности, эндо-декстраназы (К.Ф. 3.2.1.11), расщепляют внутренние 1,6-а-гликозидные связи полисахаридной молекулы. Экзо-декстраназы, включая экзо-1,6-Р глюкозидазу (К.Ф. 3.2.1.70), изомальто-декстраназу (К.Ф. 3.2.1.94) и экзо-изомальтотриогидролазу (К.Ф. 3.2.1.95), катализируют отщепление концевых моносахаридных остатков глюкозы, изомальтозы и изомальтотриозы, соответственно, с нередуцирующего конца молекулы декстрана. Другим ферментом экзо-типа, является декстран-1,2-а-глюкозидаза (К.Ф. 3.2.1.115), гидролизующая 1,2-а-гликозидные связи в точках разветвления декстранов с образованием свободной глюкозы. В официальный список ферментов еще не включена циклоизомальтоолигосахарид глюканотрансфераза (ЦИТаза), фермент, который катализирует реакцию внутримолекулярного трансгликозилирования (реакция циклизации), приводящей к образованию циклодекстранов [Oguma Т. et al, 1993]. Кроме того, был обнаружен фермент, а-глюкозидаза (К. Ф. 3.2.1.20), осуществляющий сходные с экзо-декстраназой (К.Ф. 3.2.1.70), но менее специфичные ферментативные реакции [Jensen В., Olsen J., 1996]. В 1991 г. была предложена качественно новая классификационная система гликозидгидролаз и трансгликозилаз в дополнение к существующей официальной номенклатуре этих групп ферментов [Henrissat В.А., 1991]. Одним из основных критериев при такой классификации ферментов, авторы использовали степень сходства их аминокислотных последовательностей. В настоящее время существует около 82 и 47 семейств гликозидгидролаз (GH) и гликозилтрансфераз, соответственно, которые регулярно пополняются [Henrissat В., Bairoch А., 1993, 1996; Henrissat В., Davies G.J., 2000]. Согласно данной классификации, декстран-глюкозидазы (К.Ф. 3.2.1.70) были включены в семейства GH 13 и 15 (http://afmb.cnrs mrs.fr//CAZY/ghf.html). Семейство GH 13 является полиспецифичным, поскольку в нем представлены также ферменты, катализирующие расщепление а-1,2; а-1,3; и а-1,4-гликозидных связей. Основным представителем семейства GH 15 является глюкоамилаза (К.Ф. 3.2.1.3). Изомальтодекстраназа (К.Ф. 3.2.1.94) и изомальтотриозидаза (К.Ф. 3.2.1.95), имеющие различную структуру, отнесены к семействам GH 27 и 49, соответственно. Эндо-декстраназы (К.Ф. 3.2.1.11) можно обнаружить в семействах GH 49 и 66 [Garcia В. et al., 2001].
Методы измерения декстраназной активности
Ферментативный гидролиз декстрана приводит либо к изменению физического состояния декстрана (опалесценция, вязкость), либо приводит к образованию низкомолекулярных Сахаров, имеющих редуцирующие группы. В первых работах по выделению декстраназ из различных источников активность оценивали по снижению вязкости раствора нативного декстрана [Ingelman В., 1948; Hultin Е., Nordstrom L., 1949]. Между тем, метод вискозиметрического определения активности достаточно трудоемок, длителен и может давать ошибочные результаты. Нефелометрический метод позволяет определять декстраназную активность в процентах снижения опалесценции раствора декстрана [Bailey R.W., 1959]. Эти методы применимы для определения декстраназнои активности эндо-типа, при которой декстран расщепляется до олигосахаридов. Как правило, образующиеся в процессе реакции редуцирующие сахара определяют при помощи щелочного раствора меди [Somogyi М., 1945; Ellis D.W., Miller С.Н., 1977], с динитросалициловым методом [Miller G.L. et al., 1960; Koenig D.W., Day D.F., 1989], с использованием модифицированного О-толуидиного цветного [Das D.K., Dutta S.K., 1996]. К сожалению, единой методики определения декстран-гидролизующей активности не существует, что затрудняет сравнительный анализ различных продуцентов или препаратов. В одних случаях в качестве субстрата применяют декстран Т-2000 [Fukimoto J. et al., 1971; Hiraoka N. et al., 1973], в других - декстран T-110 [Pleszczynska М. et al., 1997] или T-40 [Staat R.H., Schachtele C.F., 1976], при этом концентрация субстрата варьируется. Время реакции также неодинаково от 10 мин [Fukimoto J. et al., 1971; Hiraoka et al., 1972] до 2 часов [Chaiet L. et al., 1970]. За единицу декстраназнои активности принимают такое количество фермента, которое при действии на субстрат высвобождает 1.0 мкМ глюкозы [Das D.K., Dutta S.K., 1996], 1.0 мкМ изомальтозы [Pleszczynska М. et al., 1997], 1.0 мг моногидрата изомальтозы [Chaiet L. et al, 1970] или 1 мг изомальтотриозы [Bailey R.W., Clarke R.T.J., 1959; Bailey R.W. et al., 1961] за единицу времени в условиях опыта. Этот экспериментальный подход используют для определения декстраназнои активности как экзо-, так и эндо-типа.
В последнее время для измерения эндо-декстраназной активности нашли применение методы, использующие хромогенные и флуорогенные субстраты. Эти методы основаны на определении концентрации окрашенного комплекса, образующегося в результате ферментативного воздействия на окрашенный субстрат. Наиболее известным субстратом является растворимый голубой декстран Т-2000 [Koh T.Y., Khouw В.Т., 1970; Makinen К.К., Paunio I.K., 1971].
Более чувствительный флуорометрический способ измерения декстраназнои активности с аминодекстраном-70, окрашенным флуоресцентным красителем BODIPY, был описан Zhou С. et al. [1998].
Другие процедуры предлагают для определения декстраназнои активности нерастворимые хромо- и флуорогенные субстраты на основе поперечно-сшитого декстрана. Такие субстраты включают сефадекс G-200, связанный с красителями тринитрофенолом и флурамином [Huang J., Tang J., 1976], поперечно-сшитый декстран В-512, меченый азурином, выпускаемый фирмой MegaZyme (Ирландия), а также поперечно-сшитый декстран в присутствии красителя «black drawing ink» [Safafik I., Safankova M, 1992].
Метод, основанный на использовании шря-нитрофенил-a-D-глюкопиранозида в качестве субстрата, позволяет определять активность декстраназ как эндо-типа, так и экзо-типа. После инкубации количество высвобождаемого гс зр я-нитрофенола измеряют спектрофотометрически [binder L., Sund M.-L., 1981; Marotta M. et al., 2002].
Глюкозо - оксидазный [Walker G.J., 1972; Wynter С. et al., 1997], глюкозо -оксидазно - пероксидазный [Kaster A.G., Brown L.R. 1983; Wynter С et al., 1996] методы в основном используют для измерения экзо-декстраназной активности. Применение высокостабильного, чувствительного к пероксиду водорода флуорогенного индикатора «Amplex Red» в глюкозо-оксидазно-пероксидазном методе описано в работе Zhou С. et al. [1998]. Более чувствительная процедура измерения обеспечивает использование различных типов декстрана в качестве субстрата, и соответственно позволяет оценить и охарактеризовать декстраназы различной специфичности.
Наиболее простой и полуколичественной процедурой при проведении скрининга продуцентов или при хроматографическом фракционировании являются так называемые чашечные методы определения активности декстраназ. Испытуемые ферментные растворы вносят в лунки агара или полиакриламидного геля, содержащего сефадекс G-200 [Arnold W.N. et al., 1998], растворимый декстран [Guggenheim В., 1970; Lee J.M., Fox P.F., 1985] или голубой декстран [Johnson I.H., 1991]. Об активности судят по зонам гидролиза, после обработки спиртом [Lee J.M., Fox P.F., 1985] или процедуры окрашивания в случае декстрана, [Guggenheim В., 1970]. Количественную оценку активности проводят по соответствующему калибровочному графику. Этот метод, по мнению авторов, не достаточно точен, поэтому определение активности следует повторить другими методами [Lee J.M., Fox P.F., 1985]. В литературе описана процедура определения декстраназнои активности на основе очень тонкого слоя немодифицированного сефадекса G-200 или сефадекса, обработанного красителем «Ostazin Blue S-R» [Safarik L, 1990]. Метод, основанный на диффузии фермента в агаровую пластинку, содержащую декстран, может быть использован для обнаружения изоэнзимов после электрофоретического разделения препарата [Lee J.M., Fox P.F., 1985]. Другой способ выявления множественных форм декстраназ включает проведение электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем голубой декстран Т-2000 с последующей ренатурацией для выявления зон гидролиза [Barret J.F., Curtiss R., 1986].
Основные этапы выделения и очистки декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д
Осаждение сульфатом аммония. Для выделения декстраназы в концентрированном виде и ее первичной очистки, проводили фракционирование сульфатом аммония. Из 72-часовой культуральной жидкости удаляли биомассу на центрифуге (12,000 х g 20 мин). ). В предварительно охлажденный супернатант (5-10 С) порциями при постоянном перемешивании добавляли сухую соль 68 (в/об.) и оставляли на ночь при 4 С. Выпавший осадок отделяли центрифугированием (12,000 х g, 20 мин), перерастворяли в дистиллированной воде и использовали в дальнейших стадиях очистки.
Фракционирование полиэтиленгликолем (ПЭП. Была изучена растворимость белка, полученного на предыдущем этапе, в растворах ПЭГа различной молекулярной массы (ПЭГ 400, 4000, 6000, 8000) при значениях рН 5,0-9,0. В области значений рН 5,0-7,0 использовали буферный раствор, содержащий 50 мМ Na2HP04 - 25 мМ лимонную кислоту, а при рН 8,0-9,0 - 50 мМ трис-НСІ. Исследуемые образцы готовили следующим образом. К экстракту белка (0,3 г) в микроцентрифужных пробирках добавляли определенные количества 50 % (в/в) раствора ПЭГ в буфере с определенным значением рН. Общий вес (1,5 г ) содержимого доводили при помощи соответствующего буфера. После интенсивного перемешивания в течение 30 сек, раствор центрифугировали при 1500xg в течение 10 мин. Супернатант удаляли при помощи микропипетки и осадок растворяли в 0,5 мл буфера с учетом рН. В супернатанте и в растворенном осадке определяли декстраназную активность, а также содержание белка.
Экстракция в интерфазе. Двухфазные системы получали, добавляя различные концентрации твердого сульфата аммония (10-50 %, в/о) к супернатантам, полученным после фракционирования ПЭГом. Растворы интенсивно перемешивали в течение 1 мин и центрифугировали при 1500xg в течение 10 мин. В образовавшихся при разделении фазах (верхней, нижней и интерфазе) определяли декстраназную активность и концентрацию белка.
В финальной процедуре экстракции, к раствору белка полученному из КЖ после осаждения сульфатом аммония добавляли 50 %-ный (в/в) раствор ПЭГ 6000, до конечной концентрации 20 % (в/в). После интенсивного перемешивания в течение 1 мин и последующего центрифугирования при 3200xg в течение 15 мин, осадок удаляли. Для получения двухфазной системы, к 100 мл супернатанта добавляли 20 г сульфата аммония. После 1 мин инверсии, смесь центрифугировали в том же режиме. Сформированную интерфазу со значительной декстраназной активностью извлекали и растворяли в 10 - кратном по весу 50 мМ Tris-HCl буфере, рН 8,0. Для формирования новой двухфазной системы к разбавленному раствору интерфазы добавляли 20 % (в/о) сульфата аммония и 30 % (в/о) ПЭГ 6000. После перемешивания и центрифугирования, вновь образовавшиюся интерфазу растворяли в 50 мМ Tris-HCl буфере (рН 8,0), проводили диализ относительно того же буфера и концентрировали при помощи фильтров «Centricon YM-30» («Millipore», США). Анионообменная хроматография. Хроматографию проводили на оборудовании «Gradi Frac» («Pharmacia», Швеция) при 10 С. Концентрированный образец фермента предыдущего этапа очистки, наносили на колонку (1,0 х 20 см) ДЭАЭ-сефароза («Pharmacia», Швеция), уравновешенной 50 мМ Tris-HCl буфером рН 8,0. Колонку промывали 200 мл равновесного буфера, после чего декстраназу элюировали в линейном градиенте концентраций NaCl 0-0,36 М со скоростью 0,5 мл/мин. Фракции, со значительной декстраназной активностью, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией на фильтрах «Centricon YM-30» («Millipore», США).
Полученную в результате всех процедур очистки основную фракцию декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д использовали для изучения ее свойств.
Аффинную адсорбцию проводили в условиях двухфазной системы декстран-ПЭГ, а также на нерастворимых носителях, сефарозе с присоединенным декстраном 67 кДа и сефадексе. Водную двухфазную систему, содержащую 7 % (в/в) декстрана и 5 % (в/в) ПЭГа в 25 мМ фосфатном буфере, рН 7,0 получали путем смешения 20 %-ного (в/в) раствора декстрана 500 кДа, 40 %-ного (в/в) раствора ПЭГ 6000 в 100 мМ фосфатном буфере в центрифужных пробирках. К смеси добавляли 0,5 мл раствора фермента, и после смешения в течение 15 сек, раствор центрифугировали 10 мин при 1500xg. Объемы верхней и нижней фаз измеряли и анализировали на содержание белка и наличие декстраназной активности. Все процедуры были выполнены при температуре 10 С. Для элюирования адсорбированого белка, использовали охлажденный до 0 С раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ). К 1 мл образца белка добавляли последовательно 1 мл 10 % ТХУ и 5 мл 5 % ТХУ. После смешения, оставляли на 30 мин при температуре 0С. Отделение осадка проводили при 5000xg в течение 15 мин. Осадок отделяли при 5000xg в течение 15 мин и растворяли в дистиллированной воде, после чего определяли содержание белка и наличие декстраназной активности.
Для аффинной экстракции декстраназы синтезировали твердый субстрат, пришивая декстран 67 кДа к Сефарозе CL-4B. Присоединение декстрана 67 кДа к Сефарозе CL-4B осуществляли при помощи активирующего реактива биоксирана [Makela М. et al., 1988]. Для адсорбции декстраназы, к 1 мл культуральной жидкости добавляли 200 мг аффинного геля в 25 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0 и инкубировали при встряхивании (0 С) в течение 4 ч. После этого сефарозу отделяли центрифугированием (1500xg, 5 мин) и промывали тем же буфером для удаления не адсорбировавшихся белков. Сефарозу ресуспендировали в 5М растворе мочевины в соотношении 1:1. Супернатант после аффинной адсорбции и фракцию мочевины диализовали и анализировали на белок и декстраназную активностью. Соответствующим образом Сефадекс G-200 был использован для изучения аффинной адсорбции. К 0,89 г Сефадекса в 50 мл 50 мМ фосфатно-25 мМ цитратного буфера (рН 7,0) добавляли 4 мг фермента и инкубировали 2 ч (4 С) при постоянном перемешивании. О степени адсорбции судили по изменению декстраназной активности в супернатанте.
Разработка процедуры определения декстраназной активности при помощи нерастворимого окрашенного субстрата
В ходе различных исследований наиболее часто проводилась очистка декстраназ таких микроорганизмов, как Aspergillus, Chaetomium, Fusarium, Lipomyces, Paecilomyces, Penicillium, Artrobacter и Streptococcus (табл. 1.1). Приводимые в литературе схемы выделения этого фермента в основном включают классические методы или приемы, которые являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими.
Выделение и первичную очистку из культуральной жидкости осуществляют путем осаждения сульфатом аммония [Hiraoka N. et al., 1972; Das D.K., Dutta S.K., 1996; Wynter C, 1997] или органическими растворителями [Chaiet L. et al., 1970; Fukimoto J. et al., 1971; Shimizu E., et al., 1997]. Далее, как правило, следуют комбинации хроматографических методов (гель-хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматография на гидроксилапатите, аффинной хроматографии), позволяющих получать гомогенные препараты белка. Степень очистки декстраназ, достигаемая различными авторами, колеблется от 4 [Fukimoto J. et al., 1971] до 1857 [Pulkownik A., Walker G.J., 1977], при этом выход препарата по активности составляет 5 - 20 %. Разделить белок на изоформы позволяет применение хроматофокусирования [Pleszcynska М. et al., 1996] или изоэлектрической фокусировки [Hiraoka N. et al., 1972]. Хорошие результаты, с увеличением удельной активности в 25 раз и выходом белка по активности 47 %, были достигнуты в результате аффинной адсорбции термостабильной декстраназы штамма Termoanaerobacter sp. RT 364 на сефакриле S-300. Единственным недостатком данного способа очистки, являлось значительное количество сорбента требуемого для связывания белка [Wynter С, 1997].
Для разделения и концентрирования различных биомолекул перспективными являются методы двухфазной экстракции [Albertsson Р., 1971]. Двухфазные системы формируют смешением водных растворов двух или более гидрофильных полимеров, или полимера и солей при определенных концентрациях. Эти системы подходят для биологических образцов, так как содержат 70-90 % воды, уменьшающие возможность деградации лабильных биомолекул. Основными факторами, влияющими на эффективность распределения белка в этих системах являются заряд распределяемых молекул, ионная сила среды, молекулярный вес и концентрация полимеров. Меняя композицию фазовой системы, можно добиться более или менее полного распределения частиц/молекул в одной из фаз или на границе их раздела. Данный метод наиболее легко реализуем в масштабах ферментного производства по сравнению с другими методами фракционирования (например хроматографические методы).
Основной задачей на данном этапе работы являлась разработка нового эффективного способа выделения декстраназы штамма P. illinoisensis ИБ-101Д как для целей изучения ее физико-химических свойств, так и представляющей собой практический интерес для очистки ферментов не только в лабораторных, но и в промышленных условиях.
Разработанная нами схема выделения декстраназы, включала следующие этапы: осаждение фермента сульфатом аммония, фракционирование растворами полиэтиленгликоля и экстракция фермента в условиях двухфазной системы. Конечный препарат, с наиболее высокой удельной активностью был получен после стадии анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. Основная схема выделения очистки декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д представлена на рис. 6.17. Результаты очистки суммированы в таблице 6.4
Помимо этого, нами были испытаны различные варианты аффинной очистки декстраназ, основанные на их способности связываться с декстраном. Растворимый декстран, являясь субстратом для декстраназы, имеет свойство формировать двухфазные системы с полиэтиленгликолем, что упрощает возможность его применения в качестве аффинного сорбента. Таким образом, одним из возможных эффективных способов очистки декстраназы Р. illinoisensis ИБ-101Д являлась ее селективная адсорбция на растворимом или нерастворимом сорбенте.
В качестве твердофазных сорбентов для декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д нами были испытаны сефадекс G-200, а также декстран с ММ-67 кДа, пришитый к макропористой агарозе.
В результате исследований было обнаружено, что комплекс сефароза-декстран адсорбирует около 50 % всего фермента, однако после его промывки раствором мочевины (5 М) в элюате обнаруживалось только 5 % активности. Последний факт может быть объяснен инактивацией фермента в растворе мочевины. При использовании сефадекса G-200 наблюдалось лишь незначительная адсорбция фермента из буферного раствора.
Аффинная экстракция в двухфазной системе ПЭГ 6000 - декстран 500 кДа приводила к концентрированию белка преимущественно в нижней, содержащей декстран фазе, коэффициент распределения белка составлял 0,3, при этом в верхней фазе декстраназная активность не обнаруживалась. Элюция белка раствором ТХУ приводила к увеличению степени его очистки в 1,7 раз с выходом по активности 80 %. В тоже время, существовала возможность освобождения фермента в результате гидролиза декстрана в процессе адсорбции.
Несомненно, аффинная адсорбция, в частности, на комплексе Сефароза-декстран может быть успешно применена для очистки декстраназы при оптимальных условиях элюции фермента. Однако, сорбционная способность должна быть достаточно высокой, чтобы оптимально распределить использование дорогих материалов. Ни одна из приведенных систем аффинной сорбции не соответствовала данным требованиям эффективности и надежности для очистки в условиях промышленного производства. В силу этого стадия аффинной сорбции не была включена в схему очистки декстраназы.
Осаждение сульфатом аммония. Наиболее приемлемым способом получения стабильного, концентрированного препарата декстраназы из культуральной жидкости P. Illinoisensis ИБ-101Д являлось ее осаждение сульфатом аммония. Для выделения наиболее активной фракции изучали степень осаждения фермента в интервале концентраций сульфата аммония 20-70 % (в/об). Максимальный выход фермента (93 %) с 2-3-кратной степенью очистки был достигнут при 68 % (в/об) (табл. 6.4.). При более низком выходе фермента степень очистки не возрастала. Фермент полностью сохранял первоначальную активность в растворе сульфата аммония в течение года при 4 С. В условиях промышленного производства стадия выделения и первичной очистки может быть замещена микрофильтрацией и ультрафильтрацией.
Фракционирование ПЭГом. Ранее было обнаружено, что декстраназа Р. illinoisensis ИБ-101Д растворима в водных растворах ПЭГ. Основываясь на этом свойстве фермента, к препарату предыдущей ступени очистки добавляли ПЭГ для избирательного осаждения побочных белков. В целях оптимизации процедуры очистки фермента в условиях фракционирования растворами ПЭГ нами были выполнены предварительные исследования факторов и условий, оказывающих влияние на выход и степень очистки белка. Были расмотрены следующие параметры: рН фракционируемого раствора ПЭГ, молекулярный вес ПЭГ, концентрация ПЭГ.
В целом, изучение влияния рН растворов ПЭГ 400-8000 на фракционирование декстраназы показало отсутствие ярко выраженной дифференциации показателей очистки белка. Результаты, отраженные на рис. 6.12, являются типичными для растворов ПЭГ в области концентраций 10-30 % (в/в). Максимальные показатели очистки декстраназы наблюдались при рН 6,0 и 8,0 для ПЭГ 6000 и при рН 7,0 и 9,0 для ПЭГ 8000. В случае ПЭГ 4000 изменение рН с 5,0 до 8,0 приводило к линейному увеличению степени очистки, а при дальнейшем увеличении до рН 9,0 происходило ее резкое снижение, тогда как для ПЭГ 400 в щелочной области наблюдалось небольшое увеличение степени очистки.
Смещение рН из нейтральной области в слабощелочную существенно влияло на фракционирование декстраназы растворами ПЭГ с концентрацией 40% (рис. 6.13). Степень очистки при этом возрастала с 0,9 до 2,2, а выход фермента с 21 до 57 %. По-видимому подобные различия нельзя объяснить лишь изменением заряда белка при увеличении рН с 7,0 до 8,0.
