Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества и их продуценты 9
1.2 Методы выявления синтеза и получения бактериоцинов 17
1.3 Влияние условий культивирования на биосинтез бактериоцинов 24
1.4 Применение бактериоцинов и их продуцентов для профилактики и терапии инфекционных заболеваний 34
1.5 Применение бактериоцинпродуцирующих микроорганизмов и бактериоцинов в пищевой промышленности 39
1.6 Генетический контроль продукции и действия бактериоцинов 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 59
2.1 Штаммы, питательные среды, оборудование 59
2.2 Методы изучения физиолого-биохимических особенностей штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ 62
2.3 Методы выявления бактериоцинпродуцирующих бактерий 64
2.4 Метод периодического культивирования бактериоцинпродуцирующих штаммов 67
2.5 Методы изучения свойств антагонистических веществ 68
Экспериментальная часть 71
ГЛАВА 3. Скрининг штаммов, физиолого-биохимическая характеристика и идентификация культур, продуцирующих антагонистические вещества 71
3.1 Проведение скрининга штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ среди ферментированных продуктов питания и объектов окружающей среды 71
3.2 Скрининг продуцентов бактериоциноподобных веществ среди клинического материала 78
3.3 Изучение биологических свойств высокоактивных штаммов-антагонистов, выделенных из воздуха 94
3.4 Анализ плазмидного профиля штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ 98
ГЛАВА 4. Изучение свойств антагонистических веществ, синтезируемых штаммами М. LUTEUS С-1, С-3, С-5, С-7 103
4.1 Оценка ингибиторных субстанций, содержащихся в нативных препатартах, по критериям принадлежности к бактериоцинам 103
4.2 Изучение влияния физико-химических факторов на активность
бактериоцинов 110
ГЛАВА 5. Изучение условий культивирования для штаммов М. LUTEUS С-1, С-3, С-5, С-7, отодуцирующих бактериоцины 112
5.1 Подбор питательных сред для роста штаммов-продуцентов и биосинтеза микрококцинов 112
5.2 Подбор режимов периодического культивирования штаммов-продуцентов М. luteus 118
Заключение 123
Выводы 128
Список литературы 129
- Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества и их продуценты
- Влияние условий культивирования на биосинтез бактериоцинов
- Методы изучения физиолого-биохимических особенностей штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ
- Проведение скрининга штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ среди ферментированных продуктов питания и объектов окружающей среды
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества - антибактериальные, в основном, комплексные, субстанции белковой природы. Бактериоцины различаются по спектру активности, способу действия, генетическому контролю, биохимическим свойствам. Многие бактериоцины действуют в отношении близкородственных продуцентам видов бактерий, однако иногда имеют довольно широкий спектр действия, что особенно характерно для бактериоцинов грамположительных бактерий (Jacob F., 1953; Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966; Taggl. ,1976; Блинкова Л.П., 1984).
Некоторые авторы относят бактериоцины к классу антибиотиков, среди которых известны полипептидные субстанции. Главные отличия между этими веществами заключаются в том, что бактериоцины синтезируются на рибосомах, а антибиотики создаются вне рибосом с участием специальных ферментов (Brock Т., 1963; Егоров Н.С., 1999; Hein Т., 2005). В связи с необходимостью поиска новых лекарственных средств, обусловленной недостатками антибиотиков (быстрое формирование лекарственно устойчивых форм, подавление факторов иммунитета, аллергизация организма и т.д.), в последнее время возродился интерес к бактериоцинам (Kalmokoff М., 1996; Reid G., 2002; Тео А., 2005).
Известно, что эффективность действия пробиотических культур помимо активизации факторов иммунитета, связана также с синтезом бактериоцинов. В составе пробиотических препаратов бактериоцины и продуцирующие их штаммы, посредством избирательного воздействия на микрофлору, нормализуют микробный ценоз при некоторых патологиях у человека и животных (Heller К., 2001; Бельмер СВ., 2002; Виноградская С. Е., 2005). В литературе имеются данные по использованию бактериоцинов и пробиотических препаратов на основе штаммов-продуцентов при лечении стафилококковых инфекций (Lachowicz Т., 1973), вагинальных инфекций
(Barberis I., 1997; Lepargneur J., 2002), в борьбе с возбудителями угревой сыпи (Barefoot S., 2005). Препарат «Томицид», антибактериальным компонентом которого является лактококцин, в настоящее время применяют при ангинах, пиодермиях, дерматозах, при нагноениях в ранах и др. (Блинкова Л.П., 1986).
Поэтому изучение возможности продуцировать бактериоцины представителями нормофлоры особенно актуально при создании пробиотиков и терапевтических препаратов. Однако вопрос наличия бактериоцинпродуцирующих микробов и частоты их встречаемости среди отдельных видов микроорганизмов, циркулирующих в макроорганизме, а также физиолого-биохимических особенностей бактерий-антагонистов, изучен недостаточно.
Следует также отметить, что для стран с развитой пищевой промышленностью наиболее актуальным является вопрос поиска безвредных и эффективных препаратов, увеличивающих сроки хранения продуктов питания. Вместо традиционных химических консервантов с этой целью начали применять бактериоцины и бактерии-продуценты (АЬее Т., 1995; Ross R., 1999; Cleveland J., 2001; Millette M., 2004).
Наиболее известным считается бактериоцин низин, продуцируемый некоторыми штаммами Lactococcus lactis (Стоянова Л.Г., 2008), и его стандартизованный препарат низаплин, производителем которого является компания «Aplin&Barrett Ltd» (Англия) (de Vuyst L., 1994). Известно, что бактерии образуют широкий спектр бактериоцинов, которые тоже имеют практический потенциал, однако, прикладные исследования бактериоцинов как консервантов касаются, в основном, низина (de Vuyst L., 1994; Cintas L., 1998; Ross R., 1999; Friedrich-Karl L., 2003; Ghrairi Т., 2004).
Поиск природных консервантов, отвечающих требованиям потребителей и производителей - актуальный вопрос и для нашей страны. К сожалению, изучение бактериоцинов в России ведется в недостаточной
степени (Червинец В.М., 2007).
В связи с тем, что генетически обусловленная возможность синтеза бактериоцинов у микробов наиболее полно экспрессируется при оптимально подобранных условиях культивирования (Leroy F., 1998; de Vuyst L., 1999; Cheigh С, 2002; Блинкова Л.П. 2003), достижение максимальной продукции антимикробного вещества требует экспериментального подбора питательных сред и режимов культивирования.
Таким образом, проблема поиска и изучения свойств новых штаммов-продуцентов бактериоцинов, перспективных для последующего создания медицинских препаратов и для использования в пищевой промышленности, а также подбор питательных сред и оптимальных условий культивирования для синтеза бактериоцинов является актуальной.
Цель работы - проведение скрининга продуцентов бактериоциноподобных веществ и бактериоцинов среди микроорганизмов, выделенных из продуктов питания, объектов окружающей среды и клинического материала.
Задачи исследования:
Отобрать штаммы-антагонисты среди культур, выделенных из пищевых продуктов, объектов окружающей среды, клинического материала, и изучить физиолого-биохимические свойства наиболее активных продуцентов.
Подобрать питательную среду и основные параметры культивирования для роста выбранных продуцентов и синтеза антибактериальных веществ.
Доказать принадлежность к бактериоцинам ингибиторных субстанций, продуцируемых высокоактивными штаммами.
Исследовать воздействие физико-химических факторов на антибактериальную активность бактериоцинов.
Научная новизна.
Получена информация о частоте встречаемости штаммов-антагонистов среди микроорганизмов, выделенных из продуктов питания, объектов окружающей среды и клинических образцов.
Впервые выделены нетоксичные бесплазмидные штаммы Micrococcus luteus С-1, С-3, С-5, С-7, продуцирующие бактериоцины (микрококцины).
Антибактериальная активность микрококцинов, синтезированных штаммами М. luteus С-1, С-3, С-5, С-7, сохраняется при кипячении 60 мин, автоклавировании при 112С - 20 мин, в условиях рН от 2,0 до 10,0 и 7,5% NaCl, при однократном замораживании и оттаивании.
Практическая значимость.
Создана лабораторная коллекция оригинальных бактериоцин-синтезирующих культур, которые могут быть использованы при разработке антибактериальных препаратов для медицины, пищевой промышленности и в научных исследованиях.
Штамм Micrococcus luteus NCTC 2665 предлагается для дальнейшего изучения в качестве индикатора при скрининге бактериоцинпродуцирующих микроорганизмов разных таксономических групп.
Основные положения, выносимые на защиту:
Среди изученных при скрининге штаммов, изолированных из воздуха, воды, продуктов питания и клинических образцов, антибактериальной активностью обладали 57,8 %.
Охарактеризованы и идентифицированы как Micrococcus luteus С-1, С-
3. С-5, С-7 высокоактивные штаммы-антагонисты, перспективные для
дальнейшего изучения с целью практического применения.
3. Подобрана питательная среда и основные режимы культивирования, обеспечивающие одновременный рост штаммов Micrococcus luteus С-1, С-3,
C-5, C-7 и синтез микрококцинов.
4. Антибактериальные вещества, синтезируемые штаммами Micrococcus luteus C-1, C-3, C-5, C-7, относятся к бактериоцинам и обладают высокой устойчивостью к действию изученных физико-химических факторов.
Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества и их продуценты
Антагонистические взаимоотношения микробов уже давно привлекают внимание ученых, и большинство исследователей связывали антагонистическое действие со способностью бактерий выделять в процессе роста различные ингибиторные субстанции. Описанные многими авторами ингибиторные вещества различались по своей термоустойчивости, по способности диффундировать в агар и проникать через стерилизующие фильтры. Большинство этих веществ было активно также против самих штаммов-продуцентов.
В 1925 г Gratia открыл новый тип антагонистических взаимоотношений. Он описал штамм E.coli V, выделяющий сильное антибиотическое вещество, которое подавляло рост некоторых штаммов Е. coli и шигелл, но не оказывало никакого влияния на продуцирующий его штамм и некоторые другие штаммы Е. coli. Это вещество, названное автором «принцип V», имело, по всей вероятности, белковую природу (Gratia А., 1932). Подобные вещества, названные колицинами, были описаны у других штаммов кишечной палочки, сальмонелл и шигелл. Вещества, аналогичные колицинам, описаны в настоящее время у многих бактерий и получили общее наименование бактериоцинов (Jacob F., 1953), а штаммы, обладающие способностью продуцировать эти вещества, называются бактериоциногенным и.
По мнению некоторых исследователей, термин «бактериоцин» можно применять к веществам с антибактериальной активностью только при наличии бактерицидности и протеинового компонента. Для малоизученных веществ, обладающих бактерицидным действием, предложено использовать термин «бактериоциноподобный» (Блинкова Л.П., 1984).
Некоторые авторы относят бактериоцины к классу антибиотиков (Tagg J., 1971; Егоров Н.С, 1999; Chikindas М, 1997). Главные отличия между этими веществами заключаются в том, что бактериоцины синтезируются на рибосомах, а антибиотики образуются без участия рибосом (Hurst А. , 1981; JackR., 1995)
Бактериоцины — это гетерогенные по свойствам антибактериальные белки, разнообразные по уровню активности, механизму действия, генетическим детерминантам, физико-химическим и биологическим свойствам, подавляющие размножение микробов того же и близких видов (Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966; Ennahar S., 1999; Ray P., 2000; Millette M., 2004).
Феномен бактериоциногении характеризуется важной особенностью: синтез бактериоцина является процессом, летальным для продуцирующей его клетки. (Jacob F., 1953; Ivanovics G., 1957; Ozeki H., 1959) В бактериальной популяции, без дополнительных искусственных воздействий, бактериоцин продуцируют только отдельные клетки, которые при этом погибают. Остальные клетки являются иммунными к действию гомологичного бактериоцина и сохраняют способность к его продукции. Однако синтез бактериоцина у многих клеток популяции можно индуцировать различными факторами (акридиноранжем, УФ-лучами и т.д.) (Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966).
Бактериоцины встречаются у бактерий самой различной морфологии (кокки, палочки, вибрионы и др.), у аэробов и анаэробов, у споровых и бесспоровых форм и в соответствии с видовым названием продуцента именуются: колицины, пиоцины, пестицины, лактококцины, стафилококцины, стрептококцины, микрококцины, туберкулоцины, мегацины, вибриоцины, ботицины, клостицины и т.д. (Holland W., 1968; Ennahar S., 1999; Егоров Н.С, 1999; Блинкова Л.П. 1984, 2003) Некоторые авторы считают, что бактерициногения - явление закономерное для большинства, если не для всех видов бактерий, а отсутствие сведений объясняется недостатком исследований.
Белковый компонент бактериоцина может быть связан с липополисахаридом клеточной оболочки, но именно белковая часть этого комплекса обладает антибактериальной активностью. (Ross R., 1999) Большинство антибактериальных веществ, относящихся к бактериоцинам, разрушаются протеолитическими ферментами, и у разных бактериоцинов чувствительность к протеазам варьирует. Устойчивые к протеазам бактериоцины чаще всего встречаются у грамположительных бактерий. Например, лактоцин LP27 разрушался трипсином, проназой, но был резистентным к фицину (Upreti G., 1975). Лактоцин В, обработанный протеазой из стрептомицета или каталазой, сохранял свою активность. Ботицин E-S5 был чувствителен к трипсину, химотрипсину, но резистентен к ДНК-азе (Блинкова Л.П., 2003).
К числу общих свойств бактериоцинов относится их чувствительность к температурным воздействиям, хотя это свойство также варьирует в довольно широких пределах. Одни из них разрушаются уже при температуре 48-50 С, другие кратковременно выдерживают температуру 60-70 С, а отдельные сохраняют активность даже при 100С. Низин устойчив к температурному воздейчствию до 120 С в течение (de Vuyst L., 1994). Энтероцин 900 сохраняет свои свойства после нагревания при температуре 121 С в течение 15 минут (Franz С, 1996).
Влияние условий культивирования на биосинтез бактериоцинов
Генетически обусловленная возможность синтеза бактериоцинов у микробов наиболее полно экспрессируется при оптимально подобранных условиях культивирования (Lejeune R., 1998; Кудлай Д.Г., 1966; Блинкова Л.П., 1984, 1986, 2003; Егоров Н.С., 1999; Cheigh С, 2002) К ним относятся: рецептура питательной среды, величина рН, температура и продолжительность культивирования, состав газовой среды, режим аэрации, свойства посевного материала (возраст и доза посевной культуры), а также наличие других факторов, влияющих на биосинтез.
Интенсивная продукция бактериоцинов либо соответствует оптимальным показателям роста штамма, либо требует выбора других условий..
Температура является весьма действенным фактором при образовании бактериоцинов, как правило, оптимальные показатели находятся в диапазоне 22-37С. Изменяя температуру инкубации штамма-продуцента, можно полностью подавить или усилить синтез бактериоцинов (Krier F., 1998; Leroy F., 1999). Молочнокислые микроорганизмы, в основном, мезофилы, поэтому оптимум их роста находится в интервале 20-40С. Так, температурный оптимум для синтеза низина находится около 30С (Matsusaki Н., 1996). Известно, что синтез карноцина KZ 213 штаммом Carnobacterhim piscicola 213 оптимален при 25-30С (Khouiti Z1, 2004): Максимальная концентрация сакацина Р была в 7. раз выше при-20Є, чемшри 30?С (MbretroT., 2000); Для Lactobacillus curvatus ETH 1174 оптимальная температура роста 34,5С не совпадает с оптимумом температуры для получения курвацина А (20-27С). Бактериоцин, входящий в томицид (коммерческий.препарат, применяемый в медицинской практике), синтезируется при 28С, тогда как штамм-продуцент Lactococcus lactis ТОМ11606 растет при 37С (БлинковаЛИ., 2003);
Изучение оптимальной температуры биосинтеза бактериоциноподобной субстанции у 6 штаммов Streptococcus salivarius показало, что каждый штамм этого вида обнаружил свое специфическое отношение к температуре (Dempster R., 1982). Так, 2 культуры? стрептококка, продуцировали ингибиторную субстанцию с более широким спектром действия при 37С. Другие 4 штамма синтезировали более активную;субстанцию при 32С.
Как показали- исследования; активность бактериоцинов во многом зависит от исходного уровня рН и его изменений вд процессе роста (TaggJ., 1976; ЬСгіег F.,.1998; Leroy F., 1999). Величина рН при биосинтезе колеблется; в основном, от 4,0 до; 7,0; Интересный эффект обнаружен при разных показателях pHj который для колицина К оказался: критическим (Goebel W., 1955). В другой работе продукцию стрептококцина в бульоне Todd-Hewitt увеличивали при подведении начальной величины;рйflo; 6,5"(Tagg Х.,1976).
Leroy F. и de Vuyst L., изучая кинетику ростаи биосинтеза сакацина К у штамма Lactobacillus sake GTC 494; выделенного при изготовлении колбасных изделий,- выявили, что кислотность среды оказывает инактивирующее: воздействие на бактериоцин (Eeroy F., 1999). Оптимум величины рН для роста клеток не совпадал с максимумом активности-сакацина К. Так, максимальное количество клеток получено при рН 5,5 и 6,5, а продукция сакацина; при рН 5,0. Авторы, указывая на корреляцию воздействия температурного фактора и рН, высказали предположение, что при температуре выше 30С в условиях кислых значений рЫ среды происходит разрушение сакацина под действием протеаз.
Сочетанное влияние температуры и величины рН показаны также при культивировании Enterococcus faecium RZS С5 - продуцента энтероцина (Leroy F., 2002). Оптимум величины рН для роста клеток находится в интервале 6,0 — 6,5. Продукция бактериоцина происходит в диапазоне рН 2,0-10,0. При рН 6,5 активный синтез энтероцина происходит в температурном интервале 20-35С, а при рН 5,5-8,0 продукция бактериоцина осуществляется при 35 С.
Изучение роста штамма Leuconostoc mesenter-aides El31 и синтеза им бактериоцина выявило, что при значении рН 5,5, меньшем, чем оптимум 6,5 отмечено увеличение синтеза бактериоцина, однако температура должна быть близкой к оптимальной (Drosinos Е., 2005).
В качестве примера комплексного воздействия основных физико-химических факторов можно привести данные, полученные в Афинском университете. Цель исследования заключалась в изучении влияния сложных питательных веществ на рост микроорганизмов-продуцентов и биосинтез бактериоцинов. Культивирование штаммов L. mesenteroides К124 и L. curvatus L442 выполняли при рН 5,5 + 0,1, температуре 25С на полноценной среде (по исходным показателям азота и углерода) (Mataragas М., 2004). Выбранные условия были направлены на увеличение биомассы, но вызвали также интенсивную продукцию бактериоцина.
Методы изучения физиолого-биохимических особенностей штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ
Процесс выделения микроорганизмов из ферментированных продуктов питания включает получение накопительной культуры, выделение чистой культуры, контроль чистоты выделенной культуры (визуальный контроль, микроскопическая картина).
Для получения накопительной культуры молочнокислых бактерий отобранные для исследования образцы колбас подвергали поверхностной стерилизации спиртом и после этого разрезали стерильным скальпелем на две половины, не рассекая оболочку противоположной стороны батона. Пробу отбирали из нескольких участков центральной части батона. Для посева брали стерильным пинцетом кусочки фарша, которые помещали в предварительно взвешенный стерильный бюкс и отвешивали на весах навеску массой 2 г (с погрешностью, не превышающей 0,1 г) (Лысак В.В., 2002). Навеску помещали в стерильную фарфоровую ступку и тщательно растирали стерильным пестиком, постепенно приливая 18 мл стерильного физиологического раствора. После отстаивания при комнатной температуре в течение 15 мин 1 мл приготовленной испытуемой взвеси стерильной пипеткой вносили в пробирку с 9 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. После тщательного перемешивания содержимого пробирки, набирали 1 мл и переносили в следующую пробирку, также содержащую 9 мл физиологического раствора. Таким способом готовили 10 последовательных разведений. После приготовления разведений из каждой пробирки делали посев на поверхность питательной среды по 0,1 мл, растирали шпателем. Чашки культивировали при 37±1С в течение 24 часов. Затем выделяли чистую культуру. Полученные штаммы проверяли на бактериоциногенность.
Выделение штаммов также проводили из воздуха и воды микробиологической лаборатории. Для получения штаммов из воздуха чашки Петри диаметром 9 см с 15 мл плотной питательной среды оставляли открытыми в помещении лаборатории на ночь. Нестерильную водопроводную воду в количестве ОД мл наносили на поверхность плотной питательной среды чашки Петри. Затем чашки Петри термостатировали при 37±1С в течение 24 часов. Выросшие микробные колонии тестировали на бактериоциногенность.
Идентификацию наиболее активных продуцентов с учетом морфологических, тинкториальных (окраска по Граму), физиолого-биохимических свойств проводили стандартными методами с использованием дифференциально-диагностических питательных сред и тест-систем. При этом применяли среды Гисса с различными углеводами (глюкоза, сахароза, манноза, лактоза, мальтоза, трегалоза, ксилоза, инозит, маннит, эскулин и др.). Для определения образования сероводорода и индола энтеробактериями использовали бумажные индикаторы («HiMedia», Индия). Кроме того проводили тесты на образование гемолиза, определение аргининдигидролазы, орнитин- и лизиндекарбоксилазы, оксидазы; выполняли реакции Фогеса-Проскауэра (VP) и с метиловым красным (MR). Используя соответствующие среды, изучали возможность гидролиза эскулина, желатины, мочевины, а также исследовали способность штаммов расти на агаре Симмонса с цитратом, на МПА с 7,5% NaCl. Рост на агаризованнои среде с неорганическим азотом проверяли с помощью сред Гильтея и Виноградского. Среды готовили на водопроводной воде по следующим рецептам: среда Гильтея (г/л) - цитрат Na - 5, KNO3 - 2, аспаргин - 1, КН2Р04 - 2, MgS04 - 2, СаСЬ - 0,2, FeCb - следы, агар - 12, рН 6,9±0,1; среда Виноградского (г/л) - (NH4)2S04 - 2, К2НР04 - 1, MgS04 - 0,5, FeS04 -0,4, NaCl - 2, агар - 15,рН 6,9±0,1.
Чувствительность к антибиотикам проверяли на среде АГВ и Мюллера-Хинтона с дисками, содержащими карбенициллин, гентамицин, тетрациклином, эритромицин, стрептомицин, неомицин, амоксициллин («НИЦФ», г. Санкт-Петербург).
Контролем служили незасеянные пробирки и чашки Петри со средами.
Для идентификации также применяли компьютерную программу-«Микроб» с автоматическим считыванием результатов при помощи планшетного фотометра-ридера Multiskan («THERMO Labsystems», Финляндия).
Наличие у штаммов-продуцентов токсичности определяли на беспородных белых мышах массой 19-21 г при введении внутрибрюшинно по 0,5 мл живой культуры с концентрацией клеток 5,5±0,5 109 млрд. клеток/мл (ГФ XI). Концентрацию клеток устанавливали по отраслевому стандартному образцу мутности (10 ед) ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Выделение плазмидной ДНК проводили по методике Anderson D. (Anderson D., 1983).
Проведение скрининга штаммов-продуцентов бактериоциноподобных веществ среди ферментированных продуктов питания и объектов окружающей среды
Согласно литературным данным, микрофлора ферментированных продуктов питания; сформированная: естественным путем, имеет ряд биологических свойств, позволяющих улучшить органолептические и пробиотические показатели1, увеличить срок хранения; готового продукта (Giraffa.G.,1994; Enan G., 1996; Budrie В., 2001; Hombaek Т., 2004). В связи с этим в производстве продуктов- питания используют стартовые культуры, обладающие набором характеристик, которые позволяют ускорить и усовершенствовать технологический процесс: Одним; из таких свойств микроорганизмов является синтез антагонистических веществ: органических, кислот, пероксида: водорода, бактериоцинов: и др., обеспечивающих предохранение продукта питания от посторонней: микрофлоры, тем самым, улучшая его: сохранность. Достижение таким способом «естественной» консервации- продуктов питания позволит сократить применение потенциально опасных химических консервантов.
В связи с актуальностью поиска новых штаммов бактерий, синтезирующих бактериоцины, для использования в пищевой промышленности, - нами: проведено выделение микроорганизмов непосредственно из: продуктов питания, скрининг продуцентов. бактериоциноподобных веществ и идентификация наиболее активных из них.
Ранее нами в соавторстве с сотрудниками: МГУПБ: были изучены штаммов микроорганизмов, которые в результате последующей идентификации причислены к родам Enterococcus, Staphylococcus, Pediococcus, Lactobacillus и депонированны во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГНЦ РФ "ГосЬШИгенетика" (Машенцева Н.Г. и др, 2006).
Источниками выделения штаммов при скрининге продуцентов антибактериальных веществ среди молочнокислых микроорганизмов являлись высококачественные колбасные изделия испанского, итальянского и венгерского производства.
Результаты исследования представлены в таблице 1, из данных которой видно, что 17 штаммов из 38 обладали антибактериальной активностью в отношении индикаторов, относящихся к санитарно-показательной микрофлоре.
Lactobacillus curvatus В-8889, один из шести штаммов этого вида, проявил сходную антагонистическую активность по отношению ко всем четырем тест-культурам: 78 % - к S. enterica Typhimurium LT2, 75 % - к Р. vulgaris АТСС 13315, 72 % - к Е. coli С бООи 65 % - к S. aureus FDA 209Р. Из шести штаммов Lactobacillus sakei только один В-8936 ипгибировал рост S. aureus на 65 %.
Пять штаммов педиококков из тринадцати, в том числе Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii не отличались значительным синтезом бактериоцинов. Однако штамм Pediococcus pentosaceus В-8894 ингибировал рост S. enterica Typhimurium LT2 на 96 %, а S. aureus - на 54 %. Штамм Pediococcus pentosaceus В-8888 в равных долях подавлял рост S. enterica Typhimurium LT2, P. vulgaris АТСС 13315 и S. aureus FDA 209P.
Стафилококки, используемые в качестве стартовых бактериальных , культур в мясной промышленности, а именно Staphylococcus xylosus и Staphylococcus carnosus, не проявили ингибирующей активности, за исключением штамма Staphylococcus xylosus В-8947: 48 % — в отношении S. enterica Typhimurium LT2 и 52 % -P. vulgaris АТСС 13315.
Три штамма Enterococcus faecalis В-8653, В-8652, В-8651 не обладали бактерицидной активностью. Полученные результаты показывают, что среди проверенных штаммов семейств Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae, Pediococcaceae, Staphylococcaceae имеются микроорганизмы как с разной интенсивностью синтеза бактериоцинов, так и с разным спектром ингибирования санитарно-показательной микрофлоры. Это подтверждает данные других авторов, о том, что способность синтезировать бактериоцины не является видовой характеристикой микроорганизмов, а, следовательно, относится к штаммоспецифическому признаку (Aumerich Т, 1996; Gutierrez J., 2005).
В связи с тем, что бактерии рода Pediococcus, продуцирующие педиоцины, представляют большой интерес для прикладной биотехнологии, дальнейшее изучение продолжили со штаммами P. pentosaceus В-8894, Р. pentosaceus В-8888, P. pentosaceus 8955, P. acidilactici В-8893 и P. acidilactici В-8902.
