Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы значительно возрос интерес к микроорганизмам, трансформирующим нитрилы карбоновых кислот, что обусловлено успешным опытом их использования в производстве акриламида, а также возможностью применения в качестве биокатализаторов для получения других полезных химических продуктов, в частности, акриловой кислоты. Акриловая кислота является сырьем для получения полимеров и сополимеров различного назначения, широко применяемых во всех сферах народного хозяйства. Объединение акриловых мономеров позволяет синтезировать заданные составы латексов и растворных сополимеров, пластических масс сополимера этилена и сшитых полимерных систем. Основной промышленный способ получения акриловой кислоты - окисление пропилена на многокомпонентных катализаторах. Данный процесс отличается высокой энергоемкостью, многостадийностью и образованием значительных количеств высокотоксичных побочных продуктов, требует существенных затрат на очистку промышленных стоков и газообразных выбросов.
Применение биотехнологии для производства акриловой кислоты обладает явными преимуществами. В данном случае процесс осуществляется в одну стадию, при невысоких температурах, нормальном давлении, нейтральном значении рН, не требует использования дорогостоящих и агрессивных реагентов. Биоконверсия нитрилов может осуществляться посредством альтернативных ферментных систем: (1) нитрилазой, гидролизующей нитрил до соответствующей карбоновой кислоты и аммония; (2) последовательно нитрилгидратазой - до амида и амидазой - до кислоты и аммония. В настоящее время нитрилтрансформирующие ферменты обнаружены у бактериальных штаммов различной таксономической принадлежности.
Известны первые опыты использования бактериальных клеток, обладающих высокой нитрилазной активностью, в биотехнологическом производстве акрилата аммония, осуществляемом на предприятии ЗАО «Москва-Штокгаузен-Пермь» (Полтавская и др., 2004). При этом следует отметить, что биокаталитический способ получения карбоновых кислот пока не может конкурировать по масштабам с химическим синтезом, как в случае с биотехнологическим производством акриламида. Известные бактериальные ферменты, трансформирующие нитрилы до карбоновых кислот, обладают низкой стабильностью или невысокой каталитической активностью. До сих пор недостаточно изучены механизмы устойчивости бактерий к нитрилам, не выявлено биологическое значение способности бактериальных клеток к
4 утилизации нитрилов. В связи с этим вопросы выделения, селекции и изучения бактериальных штаммов-биопродуцентов высокоактивных устойчивых нитрилконвертирующих ферментов остаются актуальными.
Цель настоящего исследования - выделение и характеристика бактериальных штаммов-биопродуцентов нитрилтрансформирующих ферментов и оценка возможности их использования для получения акриловой кислоты.
Основные задачи исследования
Выделить чистые культуры бактерий, активно гидролизующие нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты, и идентифицировать их с использованием методов полифазной таксономии.
Определить пути метаболизма нитрилов у изучаемых штаммов и идентифицировать гены нитрилгидролизующих ферментов.
Исследовать влияние факторов среды на активность нитрилгидролизующих ферментов и подобрать оптимальные условия культивирования биопродуцентов.
Оценить возможность использования активных биопродуцентов нитрилгидролизующих ферментов для получения акриловой кислоты.
Научная новизна. Выделены чистые культуры бактерий, обладающие высокой активностью нитрилгидролизующих ферментов, и идентифицированы на основании физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик как представители Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus erythropolis. Установлено отсутствие факторов патогенности у штамма Р. fluorescens С2, обладающего высокой нитрилазной активностью. С помощью разработанных праймеров к генам, кодирующим нитрилазные ферменты, у P. fluorescens С2 подтверждено наличие нитрилазной активности. Показано, что нитрилаза штамма P. fluorescens С2 характеризуется широким диапазоном термо-и рН-устойчивости. Данный фермент катализирует гидролиз алифатических и ароматических нитрилов. При этом для экспрессии нитрилазы не требуется добавление индуктора в ростовую среду. Обнаружено, что штамм R. erythropolis РЗ характеризуется высокой активностью нитрилгидратазно-амидазного ферментного комплекса и трансформирует акрилонитрил в акриловую кислоту без накопления промежуточного амида.
Теоретическое и практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур бактерий, конвертирующих нитрилы до соответствующих карбоновых кислот. На основе разработанных праймеров предложен эффективный способ обнаружения генов, кодирующих нитрилазные ферменты. Показана возможность использования изученных бактериальных
5 штаммов для разработки эффективных биокатализаторов биотехнологического процесса получения акриловой кислоты.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Выделены и идентифицированы штаммы бактерий, обладающие
высокой активностью нитрилгидролизующих ферментов и трансформирующие
алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие карбоновые
кислоты.
2. Нитрилаза штамма P. fluorescens С2 характеризуется широким
диапазоном температурной и рН-устойчивости и высокой стабильностью при
хранении.
3. Штаммы R. erythropolis гидролизуют нитрилы по нитрилгидратазно-
амидазному пути метаболизма. Наиболее высокая амидазная активность выявлена
у штамма R. erythropolis РЗ, трансформирующего акрилонитрил в акриловую
кислоту без накопления промежуточного амида.
4. Наиболее перспективным для получения эффективного биокатализатора
синтеза акриловой кислоты является штамм P. fluorescens С2, обладающий
нитрилазной активностью.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной конференции «Проблемы химии и экологии», Пермь, 2000; Всероссийской конференции «Экология: проблемы и пути решения», Пермь, 2001, 2002; Международном семинаре "Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса" Пермь, 2001; Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002; VI-VIII Пущинской школе-конференции «Биология - наука 21-го века», 2002-2004; II и III Международных конгрессах «Биотехнология: перспективы и пути развития», Москва, 2003, 2005. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ и получен патент на изобретение Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 27 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 239 наименований работ, в том числе 24 отечественных и 215 зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме
«Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0 406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России» и Программы ОБН РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами». Исследования поддержаны грантом РФФИ № 02-04-96411.
