Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика стрептомицетов 10
Глава 2. Внеклеточные ферменты микроорганизмов 17
Глава 3. Использование ферментов микробного происхождения в
промышленности и медицине 19
Глава 4. Оксидазы L-аминокислот: их свойства и перспективы практического применения 24
4.1. L-глутаматоксидаза: ее свойства и перспективы практического применения 26
Экспериментальная часть 34
Глава 5. Материалы и методы исследования 34
5.1. Объекты исследования 34
5.2. Отбор штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы 35
5.3. Культивирование штаммов-продуцентов 35
5.4. Изучение морфологических, хемотаксономических и культуральных признаков выделенных штаммов-продуцентов 37
5.5. Мутагенез природного штамма-продуцента 39
5.6. Изучение влияния ионов кальция на секрецию внеклеточной L-глутаматоксидазы 40
5.7. Определение активности глутаматоксидазы 40
5.8. Определение биомассы стрептомицета 41
5.9. Изучение биохимических свойств глутаматоксидазы 42
Результаты и их обсуждение 46
Глава 6. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов-продуцентов 46
6.1. Морфолого-культуральные свойства выделенных штаммов 46
6.2. Физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов 57
Глава 7. Повышение биосинтетической активности природного штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-ll 59
7.1. Оптимизация состава среды и условий культивирования природного штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-11 59
7.2. Влияние ионов кальция на секрецию внеклеточной L-глутамат-оксидазы Streptomyces sp. Z-ll 71
7.3. Индуцированный мутагенез природного штамма-продуцента 73
7.3.1. Естественная изменчивость Streptomyces sp. Z-11 73
7.3.2. Индуцированная мутагеном изменчивость природного штамма Streptomyces sp. Z-ll 76
Глава 8. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства мутантного штамма Streptomyces sp. Z-11-6 80
8.1. Морфолого-культуральные свойства Streptomyces sp. Z-11-6 80
8.2. Физиолого-биохимические свойства Streptomyces sp. Z-11 -6 85
Глава 9. Выделение и очистка внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-ll—6 88
Глава 10. Свойства внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-11-6... 90
10.1. Стехиометрия реакции 90
10.2. Определение простетической группы глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z—11—6 91
10.3. Определение молекулярной массы глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z—11—6 92
10.4. Субстратная специфичность внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp.Z-W-6 94
10.5. Биохимические свойства внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6 96
Глава 11. Перспективы практического применения внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6 102
Заключение 106
Выводы 108
Список литературы 109
- Отбор штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы
- Изучение влияния ионов кальция на секрецию внеклеточной L-глутаматоксидазы
- Морфолого-культуральные свойства выделенных штаммов
- Оптимизация состава среды и условий культивирования природного штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-11
Введение к работе
Создание высокочувствительных тест-систем для медицинской диагностики, контроля технологических процессов и охраны окружающей среды является одним из актуальных направлений биотехнологии. В последние годы особый интерес для промышленности и медицинской практики представляют оксидазы L-аминокислот, особенно — L-глутаматоксидаза. L-глутаматоксидаза (КФ 1.4.3.11) — фермент, который специфично катализирует реакцию окислительного дезаминирования L-глутамата в присутствии воды и кислорода с образованием а-кетоглутарата, аммиака и перекиси водорода. Образующаяся в процессе реакции перекись водорода может быть легко обнаружена с помощью хромогенной пероксидазной реакции, что делает возможным как использование фермента в качестве аналитического реагента, так и создание на его основе биосенсоров и ферментных анализаторов для определения L-глутамата, L-глутамина, креатинина и аммиака (Kusakabe et al., 1986,1989; Murachi a. Tabata, 1987,1990; Wollenberg et al., 1988,1989a, b; Passarge et al., 1989; Pfeiffer et al., 1990; Yao et al., 1990; Vahjen et al., 1991; Dremel et al., 1991; Hale et al., 1991; Chen a. Su, 1991; Suleiman et al., 1992; Botre et al., 1992, 1993; Blankenstein et al., 1993; Rui et al., 1993,1995; Ie et al., 1994; Li et al., 1994; White et al., 1994; Stalikas et al., 1994; Ryan et al., 1997; Valero a. Garcia-Carmona, 1998). Это открывает широкие возможности в аналитической химии для качественной и количественной оценки ферментативных процессов.
Известно, что для усиления вкусовых качеств продуктов питания и сохранения их при консервировании или замораживании в качестве пищевой добавки применяют глутамат. Поэтому глутаматоксидазу можно с успехом применять в пищевой промышленности для оценки качества пищевых продуктов и осуществления контроля над производством соусов и бульонных концентратов (Kusakabe a. Midorikawa, 1986; Kusakabe et al., 1989; Male et al., 1993; Moges a. Johansson, 1994).
Особенно важно применение глутаматоксидазы в фундаментальной и клинической медицине, например для ранней диагностики заболеваний сердца. Установлено, что при ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда из поврежденных клеток миокарда или из клеток, испытывающих недостаток кислорода, в кровоток попадают аланин-трансаминаза (глутамат-пируват-трансаминаза, КФ 2.6.1.2) и аспартат-трансаминаза (глутамат-оксалоацетат-трансаминаза, КФ 2.6.1.1, Меньшиков, 1987). Определение в крови активности этих трансаминаз может дать ценную информацию о степени тяжести и о стадии повреждения сердечной мышцы (Kamei et al., 1986; Kusakabe a. Midorikawa, 1986; Schubert et al., 1987; Murachi a. Tabata, 1988; Kusakabe et al, 1989; Guntherberg et al., 1989; Cooper et al., 1991; Thomas, 1995; Moser et al., 1995, 1997). Определение в крови активности аланин-трансаминазы имеет большую диагностическую ценность при заболевании печени и позволяет осуществлять раннюю диагностику острого гепатита. Обнаружено, что это заболевание сопровождается резким повышением в крови уровня аланин-трансаминазы, при этом процесс начинается еще в продромальный период (период предвестников), когда первые клинические признаки данного заболевания только начинают выявляться (Меньшиков, 1987). Определение в крови активности аспартат-трансаминазы может служить источником важной информации при целом ряде мышечных и инфекционных заболеваний, а также при заболеваниях нервной системы. Установлено, что повышенное содержание аспартат-трансаминазы (при нормальном уровне аланин-трансаминазы) наблюдается у людей, страдающих инфекционным монокулезом, мышечной дистрофией, дермато-миозитом, инсулярной гипогликемией (Cooper et al., 1991; Villarta et al., 1991).
Известно, что основными продуцентами глутаматоксидазы являются микроорганизмы, относящиеся к группе актиномицетов, а именно — к стрептоми-цетам (Kamei et al, 1983, 1985; Kusakabe et al., 1983 a, b; Ishikawa et al., 1986; Passarge et al, 1986; Bohmer et al., 1989; Xu a. Li, 1993; Li a. Zhong, 1996; Li et al., 1996, 1997; Додзин и др., 1998; Виноградова, 1999а).
Производство этого фермента с использованием стрептомицетов в качестве продуцентов, способствовало началу широкого применения глутаматоксидазы на практике в ряде стран. Однако в России этот фермент до сих пор не производится. Поэтому поиск продуцентов L-глутаматоксидазы и разработка эффективных способов ее получения являются актуальными. Особенно перспективны в качестве продуцентов глутаматоксидазы микроорганизмы, способные к секреции этого фермента в среду, что облегчает операции по экстракции и очистке фермента, делая процесс производства экономически выгодным.
Цель настоящей работы заключалась в поиске и выделении из разных мест обитания активных продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы, относящихся к группе стрептомицетов, получении и очистке фермента, а также изучении его свойств для оценки целесообразности применения этого фермента на практике.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Найти и выделить активные штаммы-продуценты внеклеточной L-глутама-токсидазы и изучить их морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства в целях идентификации.
Изучить условия образования глутаматоксидазы выделенными штаммами.
Оптимизировать состав среды и условия культивирования штамма-продуцента с целью повышения биосинтетической активности культуры.
Увеличить выход фермента, применив мутационно-селекционный подход.
Разработать схему выделения и очистки L-глутаматоксидазы.
Изучить свойства очищенного фермента.
Рассмотреть перспективы использования данного фермента на практике.
Отбор штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы
Поиск продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы проводили среди актиномицетов, которые выделяли из почв агроценозов и лесных биогеоценозов разных географических зон России, ближнего и дальнего зарубежья.
Для выделения из почвы микроорганизмов, относящихся к роду Streptomyces, проводили предварительное обогащение почвенных образцов мелом. Для этого, воздушно-сухие образцы почвы (1 г) смешивали с ОД г СаСОз и инкубировали при 28С в течение 7-9 дней во влажном состоянии (60% от полной влагоемкости). Обработку почвы перед проведением микробиологического посева осуществляли методом растирания (Звягинцев, 1987). Для увеличения количества выделяемых из почвы стрептомицетов перед посевом почву обрабатывали раствором фенола: 0,1 мл почвенной суспензии добавляли к 10 мл 1,4 % раствора фенола и инкубировали при 28С в течение 10 мин. (Зенова, 1992). Использовали традиционный метод высева из разведений (10"3 -10"4) почвенных суспензий (Егоров, 1983) на крахмало-казеиновый агар (Зенова, 1992) с 0,1 % L-глутамата. Повторность — 10-ти кратная. Для ограничения роста грибов в питательную среду добавляли антибиотики: нистатин (10-50 мкг/мл) и циклогексимид (актидион, 50-100 мкг/мл). Засеянные чашки Петри инкубировали при 28С в течение 14 дней. Все выросшие на этой среде колонии микроорганизмов проверяли на наличие глутаматоксидазной активности.
Для наглядного выявления штаммов-продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы нами была предложена модификация состава минимального верхнего агара F (Миллер, 1986) добавлением в него (на 100 мл): 250 ед. пероксидазы из хрена, 0,1 ммоль 4-аминоантипирина, 1,75 ммоль фенола и 1 ммоль L-глутамата в 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 7,0. Выросшие на пластинке агара в чашках Петри колонии стерильно заливали модифицированным минимальным верхним агаром F и инкубировали сутки при 28С. Глутаматоксидазную активность выделенных штаммов определяли визуально по наличию вокруг колонии характерного красного окрашивания, образующегося в результате хромогенной пероксидазной реакции. Для поддержания штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы использовали овсяный агар (Гаузе и др., 1983) с 0,1% глутамата.
Для выращивания выделенных штаммов изначально использовали среду следующего состава (%): крахмал - 2, дрожжевой экстракт - 0,1, КМОз - 0,1, СаСОз - 0,5, КС1 - 0,05 , MgCl2 - 0,05, К2НР04 - 0,05, солевой раствор А - 0,1 мл, рН среды 7,0-7,2. Солевой раствор А содержал (%): FeSCU- 0,1, МпСЬ- 0,1, ZnSO4-0,l.
При оптимизации состава среды и условий культивирования штаммов-продуцентов применяли метод математического планирования эксперимента в сочетании с традиционным эмпирическим подходом. Оптимизацию состава среды проводили в три этапа: 1) качественный отбор необходимых для данной культуры источников азота, углерода, витаминов и микроэлементов; 2) количественная оценка влияния отобранных компонентов на синтез внеклеточной глутаматоксидазы и построение адекватной математической модели изучаемого процесса; 3) определение собственно оптимального состава среды методом крутого восхождения (Максимов и Федоров, 1969; Максимов, 1980).
В дальнейшем для выращивания культур стали применять оптимизированную среду, содержащую (%): глюкозу - 3, кукурузный экстракт - 0,9, (NH4)2S04 - 0,6, СаСОз - 2, КС1 и MgCl2 - по 0,1, солевой раствор А - 0,1 мл, рН среды 7,0-7,2. Выращивание культур проводили в условиях глубинного культивирования при 28С в 750-мл качалочных колбах на орбитальной качалке (190 об/мин). По окончании выращивания мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через плотную ткань, после чего в фильтрате проводили измерение глутаматоксидазной активности (см. главу 5.7).
Способность исследуемых штаммов использовать различные источники углерода проверяли на среде Готтлиба и Придгема (ISP 9) следующего состава (%): (NH4)2S04 - 0,26, КН2Р04 - 0,24, К2НР04 - 0,56, MgS04-7 Н20 - 0,1, агар - 2, солевой раствор А - 0,1 мл, рН среды 7,0. Солевой раствор А содержал (%): FeS04-0,1, МпС12- 0,1, ZnS04 - 0,1. В качестве источника углерода использовали глюкозу, фруктозу, арабинозу, сахарозу, ксилозу, маннит, рамнозу, раффинозу, целлюлозу, галактозу, инозит, мальтозу, глицерин и крахмал в концентрации 1%. Выращивание проводили при 28С в течение 21 дня. Результаты оценивали на 7,14 и 21-е сутки роста при сравнении с отрицательным контролем (среда без источника углерода) и положительным контролем (среда с D-глюкозой). Повторность в опытах — трехкратная.
Способность выделенных штаммов использовать различные источники азота проверяли на среде, содержащей (%): глюкозу - 1, MgS(V7 Н2О - 0,05, NaCl -0,05, FeS04-7 Н20 - 0,001, К2НР04 - 0,1, агар - 1,5, рН среды 7,0. В качестве источника азота использовали следующие соединения в концентрации 0,1%: L-аргинин, L-цистеин, L-гистидин, L-гидроксипролин, L-метионин, L-фенилаланин, L-серин, L-треонин, L- валин, В,Ь-амино-п-масляную кислоту, L-аспарагин, L-аланин, L-глутамин, L,D-nryTaMaT, L-пролин, нитрат калия, нитрат натрия, сульфат аммония и нитрат аммония. Результаты оценивали на 14-е сутки при сравнении с отрицательным контролем (среда без источника азота) и положительными контролями (среда с L-аспарагином или L-пролином). Повторность в опытах — трехкратная.
Изучение влияния ионов кальция на секрецию внеклеточной L-глутаматоксидазы
При изучении влияния ионов кальция на секрецию внеклеточной глутамат-оксидазы посевной материал выращивали в течение ночи при 28С. Полученным инокулятом (5% по объему) засевали среду, разлитую по 100 мл в 750-мл качалочные колбы. Непосредственно перед посевом в каждую колбу стерильно добавляли СаСЬ до конечной концентрации 0,1-0,5%. В качестве контроля использовали среду без хлорида кальция. Культивирование проводили при 28С на орбитальной качалке (190 об/мин). Через каждые четыре часа отбирали пробы для измерения ферментативной активности и биомассы.
Определение глутаматоксидазной активности проводили на основе хромо-генной пероксидазной реакции. Реакционная смесь содержала (в 1 мл): 2,5 ед. пероксидазы из хрена, 1,0 мкмоль 4-аминоантипирина, 17,5 мкмоля фенола, 10 мкмолей L-глутамата в 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 7,0. Реакционную смесь инкубировали при 37С в течение двух минут и реакцию инициировали, добавляя исследуемый образец (фильтрат или раствор фермента). Активность фермента измеряли по изменению оптической плотности раствора при длине волны 500 нм.
Измерение проводили на спектрофотометре Хитачи 200-20 (Япония). Активность глутаматоксидазы рассчитывали по формуле: A-Vo6 Аго = , где Єм Т VE
Аго - глутаматоксидазная активность исследуемых образцов (ед/мл); А - изменение величины оптической плотности раствора в кювете за одну минуту (Т) при 37С; V06 - общий объем раствора в кювете (мл); VE - объем вносимого образца (мл); єм -коэффициент молярной экстинкции (мМ"1 см"1) образующегося в процессе реакции хромогенного соединения хинонимина, численно равный 6. За единицу активности фермента (ед.) принимали такое его количество, которое катализирует образование одного мкмоль перекиси водорода за минуту при 37С.
Содержание белка в ферментных препаратах определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976). Для построения калибровочной кривой использовали доведенный до постоянного веса бычий сывороточный альбумин (Sigma, США).
Биомассу стрептомицета определяли по весу сухого мицелия, отмытого от солей вначале 1 н НС1, а затем — дистиллированной водой. Фильтры с промытым мицелием доводили до постоянного веса при 80С и хранили в эксикаторе с силикагелем до взвешивания. Вес сухого мицелия рассчитывали по разнице веса фильтра с мицелием и сухого фильтра. Конечный результат пересчитывали на вес сухого мицелия в мг/мл среды.
Нами был разработан метод выделения и очистки внеклеточной глутаматоксидазы (см. главу 9). Дальнейшая работа была проведена с очищенным по предложенному методу ферментом.
Диапазон рабочей температуры глутаматоксидазы. Реакционную смесь, содержащую в качестве субстрата L-глутамат (10 мкмоль/мл), инкубировали при температурах от 20 до 90С в течение 20 мин. Глутаматоксидазную активность измеряли описанным выше методом (см. главу 5.7), используя в качестве инициатора реакции исследуемый фермент.
Оптимум рН глутаматоксидазы. Определение активности фермента при различных значениях рН проводили, используя в качестве субстрата L-глутамат в 0,2 М ацетатном буфере (рН 3,5-6,0); 0,2 М К-фосфатном буфере (рН 6,0-8,5) и 0,2 М глицин-NaOH буфере (рН 8,5-11,5). рН стабильность глутаматоксидазы. Исследуемый фермент инкубировали в буферных растворах с рН от 3,5 до 11,5 в 0,2 М ацетатном буфере (рН 3,5-6,0); 0,2 М К-фосфатном буфере (рН 6,0-8,5) и 0,2 М глицин-NaOH буфере (рН 8,5-11,5) при 37С в течение часа. По окончании инкубирования проводили измерение активности изучаемой глутаматоксидазы (см. главу 5.7).
Температурная стабильность и влияние рН на термостабильность глутаматоксидазы. Исследуемый фермент инкубировали в буферных растворах с рН 4,5, 6,5 и 9,5 при фиксированной температуре от 30 до 90 С в течение часа. Через каждые 15 мин. отбирали пробы и измеряли глутаматоксидазную активность описанным выше методом (см. главу 5.7).
Влияние ионов металлов, ингибиторов и хелатирующих агентов на активность глутаматоксидазы. В реакционную смесь, содержащую изучаемый фермент, добавляли различные химические вещества в концентрации 1 мМ и после инкубирования в течение пяти минут, реакцию начинали добавлением в качестве субстрата глутамата (10 мкмоль/мл). В качестве контроля использовали реакционную смесь без добавления химических веществ. Активность фермента в контроле принимали за 100%.
Субстратная специфичность глутаматоксидазы. Реакционную смесь, содержащую в качестве субстрата различные аминокислоты, а именно: L-аспартат, L-глутамин, L-аспа-рагин, L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин, L-серин, L-треонин, L-фенил-аланин, L-тирозин, L-пролин, L-орнитин, L-гистидин, L-аргинин, L-цистеин, L-лизин, L-глицин и L, D-глутамат в концентрации 10 мкмоль/мл, инкубировали при 37С в течение двух минут, после чего реакцию инициировали добавлением исследуемого фермента. Активность фермента по отношению к L-глутамату принимали за 100 %.
Морфолого-культуральные свойства выделенных штаммов
Из почв агроценозов и лесных биогеоценозов разных географических зон России, ближнего и дальнего зарубежья было выделено 1284 штамма актино-мицетов. Из них скринингом получена коллекция культур, включающая 7 штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы, что составило 0,5% от числа выделенных и проверенных культур. Такая же относительно невысокая встречаемость продуцентов глутаматоксидазы в природных источниках отмечалась и в одной из первых работ, посвященных описанию этого фермента (два выявленных продуцента среди 500 проверенных культур стрептомицетов, Kamei et all., 1983). Следует отметить, что все штаммы-продуценты внеклеточной глутаматоксидазы были выделены из почв агроценозов (рисовое поле в Японии и пахотные земли в Московской и Липецкой областях).
В целях идентификации было проведено сравнительное изучение морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств двух наиболее активных продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы: штамма Z-11 (исходная активность фермента — 0,01 ед/мл среды) и штамма Z-83 (исходная активность фермента—0,005 ед/мл среды).
Установлено, что выделенные штаммы Грам-положительны, не кислотоустойчивы. В составе пептидогликана клеточной стенки была обнаружена L-ДАПк.
При изучении моносахаридного состава клеточных стенок установлено отсутствие в них основных диагностических Сахаров (ксилозы, арабинозы, рамнозы, галактозы, маннозы). Присутствие L-ДАПк и отсутствие основных диагностических Сахаров в клеточной стенке выделенных штаммов (клеточная стенка 1 типа, Lechevalier et al., 1971) дало основание отнести их к группе стрептомицетов.
Вегетативные гифы обоих штаммов образуют хорошо развитый разветвленный мицелий, не распадающийся на фрагменты. Гифы воздушного мицелия — 0,8-1,1 (штамм Z-11) и 0,5-0,7 мкм (штамм Z-83) в диаметре — в зрелом состоянии несут цепочки спор. У штамма Z-11 цепочки спор спиральные, в виде хорошо развитых, правильных, растянутых спиралей от трех до семи оборотов (рис. 1). Споры — 0,6-0,7 х 0,9-1,1 мкм — циллиндрические с гладкой поверхностью, неподвижны (рис. 2). У штамма Z-83 вдоль стерильных гиф воздушного мицелия расположены прямые цепочки спор (рис. 3). Споры циллиндрические — 0,4-0,5 х 0,6-0,7 мкм — с гладкой поверхностью, неподвижны (рис. 4). Склероцио-, спорангио-, пикнидио- и синнемаподобные структуры не обнаружены. По морфологии мицелия и строению репродуктивных структур выделенные актиномицеты были отнесены к роду Streptomyces.
На поверхности плотной среды в чашках Петри Streptomyces sp. Z-11 и Streptomyces sp. Z-83 образуют плотные, врастающие в агар, концентрические колонии со светлым фестончатым краем, d-2-З мм (штамм Z-83) и d -3-5 мм (штамм Z-11). Поверхность колонии покрыта серым бархатистым воздушным мицелием, который обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами.
Установлено, что оптимальной температурой для роста как Streptomyces sp. Z-11, так и Streptomyces sp. Z-83 является 26-28C, а температурный диапазон, в котором их рост возможен, находится между 18 и 37С. Оптимальный рН — 7,0-7,4, хотя рост обеих культур наблюдали при рН от 5,5 до 8,5.
Streptomyces sp. Z-11 и Streptomyces sp. Z-83 — это аэробные стрептомицеты с хемоорганотрофным типом питания. Хороший рост обеих культур был обнаружен на средах, содержащих в качестве источника углерода и энергии глюкозу, арабинозу, сахарозу, ксилозу, маннит, фруктозу, галактозу, мальтозу, крахмал и глицерин. Рамноза не поддерживала рост штамма Z-83, а раффиноза и инозит — обеих культур.
Ни один из штаммов не использовал в качестве источника углерода и энергии органические спирты. Слабый рост наблюдали на среде с пируватом и цитратом. Формиат, лактат, ацетат, малат, сукцинат, оксалоацетат и фумарат не поддерживали рост обеих культур.
Лучшим источником азота для биосинтетических целей изучаемых культур оказался аммоний. На среде, содержащей в качестве основного источника азота нитраты (натрия или калия) или мочевину, скорость роста обоих штаммов была существенно ниже, чем на среде с сульфатом аммония. Нитрат аммония не поддерживал рост как штамма Z-11, так и штамма Z-83. Streptomyces sp. Z-11 и Streptomyces sp. Z-83 хорошо росли на среде с пролином, треонином, серином, гистидином, глутаматом, глутамином и валином, используя эти аминокислоты в качестве основного источника азота На средах с цистеином, фенилаланином и аспарагином рост культур не обнаружен. Метионин слабо поддерживал рост штамма Z-83, но хорошо использовался штаммом Z-11. Ни одна из изучаемых культур не росла на среде без экзогенного источника азота и углерода.
Была изучена устойчивость выделенных штаммов к антибиотикам. Обнаружено, что хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, стрептомицин, линкомицин, тетрациклин в концентрации 100 мкг/мл полностью подавляют рост обеих культур. Присутствие пенициллина и нистатина в среде несколько замедляло рост обоих штаммов, но не подавляло его. В присутствии ингибиторов слабый рост как Streptomyces sp. Z-83, так и Streptomyces sp. Z-l 1 был обнаружен на средах с 0,1% фенола и 0,01% азида натрия. Более высокие концентрации азида натрия (0,02%) полностью подавляли рост обоих штаммов.
Оптимизация состава среды и условий культивирования природного штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-11
Рост Streptomyces sp. Z-11-6 был обнаружен при рН от 5,0 до 8,0 с оптимумом — 7,0-7,2 и в интервале температур — от 20 до 32С с оптимальной температурой для роста — 28С.
Хороший рост Streptomyces sp. Z-11-6 наблюдали на среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии глюкозу, арабинозу, сахарозу, ксилозу, маннит, фруктозу, галактозу, мальтозу, рамнозу, крахмал и глицерин. Изучаемый штамм относительно хорошо потреблял раффинозу, не использовал инозит. Органические спирты в качестве источника углерода данный штамм не использовал. Слабый рост Streptomyces sp. Z-11-6 наблюдали на среде с пируватом и цитратом. Формиат, лактат, ацетат, малат, сукцинат, оксалоацетат, фумарат не поддерживали рост культуры.
Установлено, что лучшим источником азота для биосинтетических целей Streptomyces sp. Z-11-6 является аммоний. Нитрат аммония не поддерживал рост культуры. На среде, содержащей в качестве источника азота нитраты (калия или натрия) или мочевину, скорость роста Streptomyces sp. Z-11-6 была значительно ниже, чем на среде с сульфатом аммония. Из аминокислот в качестве единственного источника азота штамм хорошо использовал пролин, треонин, серии, гистидин, глутамин, валин и глутамат. В отличие от природного штамма Streptomyces sp. Z-11-6 был способен к росту на среде с 0,5% глутамата. Цистеин, фенилаланин и аспарагин не поддерживали рост культуры. Слабое развитие Streptomyces sp. Z-11-6 наблюдали на среде с метионином. На среде без экзогенного источника азота и углерода рост культуры не обнаружен.
Хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, стрептомицин, линкомицин, тетрациклин, пенициллин и нистатин в концентрации 100 мкг/мл полностью подавляли развитие мутантного штамма.
В присутствии ингибиторов слабый рост Streptomyces sp. Z-11-6 был обнаружен на среде с 0,1% фенола, 0,0001% кристаллического фиолетового и 0,01% азида натрия. Более высокая концентрация азида натрия (0,02%) полностью подавляла рост культуры.
От известных продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6 отличается способностью к стабильному образованию высокоактивного фермента при выращивании его в течение суток на дешевой полусинтетической среде с глюкозой и кукурузным экстрактом. Известные же штаммы-продуценты синтезируют фермент при выращивании их в течение 7-10 суток на средах сложного состава, содержащих пептон, дрожжевой экстракт и крахмал.
Как и в случае с природным штаммом, добавление к среде культивирования Streptomyces sp. Z-l 1-6 хлорида кальция, с одной стороны, несколько подавляло рост микроорганизма, при этом степень подавления зависела от концентрации СаСЬ, а с другой стороны — стимулировало биосинтез глутаматоксидазы и значительно сокращало (до 28 ч) время максимального накопления фермента.
Таким образом, по своим физиолого-биохимическим свойствам мутантный штамм, Streptomyces sp. Z-l 1-6, близок к природному. Основными его отличиями являются: способность расти при высоких концентрациях глутамата в среде, чувствительность к пенициллину и нистатину, образование в небольшом количестве пигментов меланоидного типа и высокая биосинтетическая активность. Штамм Streptomyces sp. Z-l 1-6 был депонирован в коллекции культур кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова (КМ МГУ) под номером 434.
Были рассмотрены возможные варианты длительного хранения штамма-продуцента. Установлено, что данный штамм можно сохранять в жизнеспособном состоянии длительное время в лиофилизированном виде, на скошенном агаре под вазелиновым маслом или без него при 4С. Во всех случаях у выросших культур после хранения сохранялась прежняя способность к синтезу внеклеточной L-глутаматоксидазы (табл. 19).
Похожие диссертации на Внеклеточная L-глутаматоксидаза : Поиск продуцентов, получение, очистка и свойства фермента
