Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди патогенных для человека вибрионов (кроме Vibrio cholerae) наиболее распространенными и значимыми в этиологии острых кишечных инфекций являются галофильные бактерии вида V. parahaemolyticus, обитатели эстуарных и прибрежных морских вод. Начиная с 1996 г. в мире наблюдается стремительный рост заболеваемости, сопровождающийся глобальным распространением клонов, за которыми в литературе закрепилось название «пандемичных», несмотря на то, что этот, уже вошедший во всеобщее употребление термин, неприменим к V. parahaemolyticus с точки зрения эпидемиологии [Nair G. B. et al., 2007]. Также встречаются такие обозначения, как «post-1995» и «new-O3:K6». К ним относят представителей серогрупп О3:К6, О4:К68, О1:К25, О1:KUT и О6:K18, как правило, содержащих в геноме семь островов патогенности (VPaI-1 – VPaI-7) [Hurley C.C. et al., 2008]. Штаммы, выделенные до 1996 г., не содержат всех VPaI и не обладают таким патогенетическим потенциалом, как «пандемичные». Считают, что последние произошли от авирулентных штаммов серогруппы О3:К6 путем постепенного приобретения VPaI [Han H. et al., 2008]. Заболевания чаще всего регистрируют в приморских населенных пунктах и связаны с употреблением в пищу морепродуктов. В связи с их развитым импортом в России и странах СНГ существует риск возникновения заболеваний, вызываемых V. parahaemolyticus, что требует серьезного внимания и постоянного мониторинга за данными возбудителями.
В 1997 г. в Приморском крае России была зарегистрирована крупная вспышка (63 больных) пищевой токсикоинфекции (ПТИ), вызванная штаммами серогруппы О3:К6 [Смоликова Л.М. c соавт., 2001]. Время ее возникновения и географическое положение региона наводят на мысль о том, что ее этиологическими агентами явились «пандемичные» клоны, распространившиеся и на территорию Российской Федерации, однако это предположение нуждалось в подтверждении. Согласно данным официального сайта Управления Роспотребнадзора по Приморскому краю (), в последующие годы на Дальнем Востоке отмечались вспышки заболеваний, вызванных галофильными вибрионами («галофилез»): в 2001 – 31 больной, в 2002 г. – 24, в 2007 г. – 22, в 2009 г. – 10, в 2012 г. – 30. Кроме того, периодически регистрировали спорадические случаи [Хоменко Т.В., Мурначев Г.П., 2004]. Ранее, в 1970е годы, в Новороссийске возникали многочисленные заболевания, вызванные V. parahaemolyticus, причем в 87% случаев состояние больных было настолько тяжелым, что требовалась экстренная госпитализация. С 1973 по 1976 гг. было выделено 80 клинических штаммов, подавляющее большинство которых отнесено к серогруппам О4:К12 и О4:К8 [Либинзон А.Е. с соавт., 1981], рассматриваемых рядом исследователей как сероварианты О3:К6 [Nair G. B. et al., 2007]. Локальные вспышки и спорадические заболевания имели место и на других территориях России (Ейск, Туапсе, Кабардинка), а также Украины (Мариуполь, Бердянск, Керчь, Ялта, Одесса, Николаев) и Туркменистана (Красноводск) [Карбышев Г.Л., 1988].
Патогенность парагемолитических вибрионов связывают главным образом с продукцией прямого термостабильного (TDH – thermostable direct hemolysin) и родственного ему (TRH – TDH-related hemolysin) гемолизинов [Nitshibuchi M., Kaper J.B., 1995; Park K.-S. et al., 2000]. Ген tdh в геноме представлен двумя почти (на 97%) идентичными копиями, tdh1 и tdh2, расположенными на малой хромосоме в разных участках VPaI-7, в состав которого входит также кластер генов системы секреции третьего типа (T3SS2), ответственной за энтеротоксичность [Hiyoshi H. et al., 2010]. Ген trh также существует в двух вариантах, имеющих 84% идентичности [Kishishita M. et al., 1992], но в геноме представлен одной копией в составе малой хромосомы и тесно связан с кластерами генов уреазы (ure) [Nakaguchi Y. et al., 2003] и T3SS2, отличающейся от T3SS2 структурно, но не функционально [Okada N. et al., 2009]. Обычно вирулентные клинические штаммы содержат либо tdh, либо trh, но встречаются несущие оба этих гена [Iida T. et al., 1998], а штаммы из окружающей среды за редким исключением лишены того и другого [Nair G. B. et al., 2007].
Способность к экспрессии генов tdh определяют по лизису эритроцитов человека или кролика на специальной среде Вагатсума, который называют феноменом Канагава (KP). TRH, имеющий другой спектр гемолитической активности, в этом тесте не выявляется [Nishibuchi M. et al., 1989]. Часть штаммов, содержащих tdh, либо и tdh, и trh, оцениваются как KP-негативные или KP-промежуточные, то есть экспрессирующие tdh слабо и непостоянно. Согласно предположению Okuda J., Nishibuchi M. (1998), такие штаммы могут содержать только одну копию гена tdh – tdh1, обладающего более слабым промотором по сравнению с tdh2. Однако поскольку активность промотора зависит от замены всего одной пары нуклеотидов в сайте -35, авторы считают tdh+КP- штаммы потенциально опасными, т.к. точковая мутация в промоторе может привести к возникновению КP+ клонов. Что касается tdh+trh+ штаммов, то они, как правило, продуцируют TRH, тогда как экспрессия tdh у них репрессирована, и лишь в редких случаях наблюдается одновременная продукция обоих гемолизинов [Xu M. et al., 1994]. Является ли это следствием низкой активности промотора tdh, до конца не установлено. В литературе также отсутствуют данные о копийности гена tdh у таких штаммов.
Парагемолитические вибрионы интенсивно изучаются зарубежными авторами, однако сообщения о генетической характеристике штаммов, циркулирующих в России и странах СНГ, в литературе практически отсутствуют; до начала наших исследований они были охарактеризованы только по фенотипу [Либинзон А.Е. с соавт., 1981; Карбышев Г.Л., 1988; Смоликова Л.М. c соавт., 2001]. В свете последних данных о формировании «пандемичных» клонов генотипическая характеристика могла бы способствовать объяснению причин возникновения столь тяжелых заболеваний, а также дифференциации множественных спорадических случаев от локальных вспышек. Генотипирование штаммов, выделенных от больных и из объектов окружающей среды, необходимо для выявления источника инфекции, раскрытия генеза вспышек и определения необходимого объема санитарно-эпидемиологических мероприятий. Поэтому оценка потенциальной опасности V.parahaemolyticus на современном уровне приобретает особую актуальность.
Цель работы. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов V. parahaemolyticus с различными фенотипическими свойствами, выделенных на территории России и сопредельных государств.
Основные задачи исследования:
-
ПЦР-генотипирование музейных и свежевыделенных штаммов V. parahaemolyticus по расширенному набору детерминант факторов патогенности. Конструирование новых праймеров.
-
Сравнительный анализ генотипических признаков штаммов, вызвавших вспышки, спорадические случаи заболеваний, и выделенных из объектов окружающей среды (вода, гидробионты) на различных территориях.
-
Риботипирование штаммов V. parahaemolyticus, выделенных в двух географически отдаленных регионах России (Приморский край и Новороссийск).
-
Выявление генов tdh и trh у других представителей рода Vibrio.
-
Блот-гибридизация рестриктов ДНК V. parahaemolyticus с зондами tdh и trh. Определение копийности этих генов в геномах разных штаммов.
-
Секвенирование генов tdh1 и tdh2 Kанагава-позитивных, Kанагава-негативных и Канагава-промежуточных штаммов, биоинформационный анализ их промоторных областей и продуктов трансляции.
Научная новизна и теоретическая значимость. На основе комплексного анализа генотипов получены приоритетные данные о генетическом разнообразии штаммов парагемолитических вибрионов, циркулирующих на территориях России, Украины и Туркменистана. Впервые создана база данных «Парагемолитические вибрионы России и сопредельных государств: ПЦР-генотипы», зарегистрированная в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам под № 2013620293 от 14.02.2013 г. Впервые идентифицированы представители так называемой «пандемичной» группы, вызвавшие заболевания в России, установлено отсутствие родственных связей между возбудителями заболеваний и штаммами, выделенными из водоемов и гидробионтов в разных регионах. Показано, что образование серовариантов О3:К6 может происходить не только после приобретения всех островов патогенности (как описано в литературе), а параллельно с ним или даже предшествовать ему. С помощью секвенирования участков ДНК выяснены причины KP-негативного и KP-промежуточного фенотипа tdh-позитивных штаммов и впервые установлено, что эффективность экспрессии гена зависит не от одной, как полагали ранее, а от двух точковых мутаций в его промоторной области. Оценена степень вероятности реверсии таких штаммов в KP-позитивные варианты.
Практическая значимость работы. Сформирована коллекция штаммов V. parahaemolyticus, охарактеризованных по генотипическим признакам, для проведения дальнейших научных исследований. Полученные данные использованы для паспортизации штаммов, хранящихся в Музее живых культур Ростовского противочумного института (акт внедрения от 14.02.2013 г.). Сконструирован новый набор праймеров для детекции ряда генов. Одобрены Ученым советом и утверждены директором Ростовского противочумного института методические рекомендации «Комплексная оценка вирулентности парагемолитических вибрионов» (протокол № 11 от 02.11.10) и «Генотипическая характеристика парагемолитических вибрионов по расширенному набору детерминант факторов патогенности (протокол № 9 от 30.10.12). Контрольные штаммы для постановки ПЦР и изучения экспрессии генов факторов патогенности депонированы в ГКПБ «Микроб» под номерами КМ204 и КМ208. В базе GenBank депонированы 22 нуклеотидные последовательности генов tdh, tdh1 и tdh2 тринадцати штаммов (включая промоторную область) и аминокислотные последовательности их продуктов под номерами JQ029155 – JQ029159, JQ074089 – JQ74092, JQ0967016 – JQ967028; AFD18727.1 – AFD18730.1, AFD54192.1 – AFD 54195.1, AFA85583.1 – AFA85595.1.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Штаммы V. parahaemolyticus, выделенные на различных территориях Российской Федерации, в Украине и Туркменистане от больных и из объектов окружающей среды, различаются по генотипам. Компьютерный анализ результатов ПЦР-генотипирования позволил выявить среди них 4 отчетливых группы и определить степень изменчивости в пределах каждой из них.
-
Клинические штаммы V. parahaemolyticus О3:К6, выделенные на Дальнем Востоке после 1996 г., являются производными одного клона и по совокупности признаков могут быть отнесены к представителям «пандемичной» группы. Установлена клональная гетерогенность клинических штаммов, выделенных до 1996 г. в Новороссийске; ни один из этих штаммов не содержал всех семи островов патогенности, но их полный набор был представлен в популяции.
-
Результаты блот-гибридизации рестриктов ДНК с зондом tdh не подтвердили высказанного в литературе предположения о присутствии в геноме tdh+ Канагава-негативных штаммов V. parahaemolyticus единственной копии гена tdh1. С помощью секвенирования генов и биоинформационного анализа впервые установлено, что утрата Канагава-позитивного фенотипа зависит не от одной (как считали ранее), а от двух нуклеотидных замен в промоторной области гена tdh2. Штаммы, содержащие одну из них, потенциально более опасны, чем содержащие обе замены, так как последним для восстановления Kанагава-позитивного фенотипа необходимы сразу две мутации.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (2007-2012), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора (г. Пермь, 2012), представлены в материалах 13-й, 17-й и 18-й Российских гастроэнтерологических недель (Москва, 2007, 2011, 2012).
Исследования выполнены в рамках плановых научных тем «Фено- и генотипическая характеристика парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности», № госрегистрации 0120.0 800416, и «Формирование коллекции патогенных для человека вибрионов», № госрегистрации 0120.1 002623.
Публикация результатов исследований. Материалы исследований отражены в 18 опубликованных работах, из них 6 – в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов, иллюстрирована 12 таблицами и 18 рисунками. Библиография содержит ссылки на 181 публикацию (в т.ч. 17 работ отечественных и 164 – зарубежных авторов).
