Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Классификация микробных ПАВ и их основные продуценты 9
1.2. Выделение биоПАВ из культуральной жидкости и его очистка 19
1.3. Физико-химические свойства биоПАВ 22
1.4. Продуценты и условия образования липопептидных ПАВ 25
1.5. Биологическая активность липопептидных биоПАВ 30
2. Объекты и методы исследований 38
2.1. Объекты исследований 38
2.2. Условия культивирования 39
2.3. Измерение поверхностного натяжения 40
2.4. Изучение динамики процессов роста и секреции биоПАВ 43
2.5. Критерии оценки эффективности биоПАВ 43
2.6. Выделение биоПАВ 47
2.7. Определение химического состава биоПАВ 47
2.7.1. Элементный анализ 47
2.7.2. Тонкослойная хроматография 48
2.7.3. Инфракрасный спектр 48
2.7.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография 48
2.7.5. Аминокислотный анализ 49
2.7.6. Масс-спектрометрия 49
2.8. Определение биологической активности биоПАВ 50
2.8.1. Антагонистическая активность к фитопатогенным грибам 50
2.8.2. Гемолитическая активность биоПАВ 51
2.9. Статистический анализ результатов эксперимента 51
Результаты и обсуждение 52
3. Скрининг продуцентов биоПАВ среди культур бацилл 52
4. Образование биоПАВ в процессе периодического культивирования продуцентов 55
4.1. Влияние некоторых источников углерода на образование биоПАВ 55
4.2. Динамика роста и секреции биоПАВ в жидкой культуре 57
5. Физико-химическая характеристика биоПАВ, продуцируемых бациллами 62
5.1. Критическая концентрация мицеллообразования и предельная адсорбция биоПАВ 62
5.2. Термическая стабильность биоПАВ 70
5.3. Влияние времени на сохранение поверхностно активных свойств биоПАВ 71
5.3.1. Влияние продолжительности хранения культуральной жидкости на поверхностную активность биоПАВ 71
5.3.1. Стабильность биоПАВ в смеси с пластовой водой 76
6. Определение химической природы и структуры биоПАВ штамма В. subtilis ИБ-17 79
6.1. Элементный состав биоПАВ 79
6.2. Тонкослойная хроматография 80
6.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография 82
6.5. Аминокислотный состав биоПАВ 83
6.6. Масс-спектрометрический анализ биоПАВ 84
7. Биологическая активность В. subtilis ИБ-17 88
8. Заключение 94
9. Выводы 100
Литература 101
- Классификация микробных ПАВ и их основные продуценты
- Биологическая активность липопептидных биоПАВ
- Динамика роста и секреции биоПАВ в жидкой культуре
- Биологическая активность В. subtilis ИБ-17
Введение к работе
Актуальность темы. Создание эффективных микробных поверхностно-активных веществ (биоПАВ, биосурфактантов), обладающих рядом преимуществ по сравнению с химическими детергентами (биодеградабильность, промышленное получение на дешевых субстратах, эффективное действие при экстремальных температурах, концентрациях минеральных солей, рН), является актуальной задачей современной микробиологии и открывает перспективу их применения для решения различных промышленных задач.
Эти вещества могут синтезироваться некоторыми бактериями, дрожжами, микроводорослями, мицелиальными грибами [Desai J.D., 1987] и представлены гликолипидами, липопептидами и липопротеинами, липополисахаридами, жирными кислотами и полисахарид-белковыми комплексами. На сегодняшний день описано не более 100 микробных продуцентов ПАВ. Из большого количества известных биосурфактантов микробного происхождения в промышленном масштабе производится лишь эмульсан, продуцируемый Acinetobacter calcoaceticus R.AG-1.
Бактерии, принадлежащие к роду Bacillus Cohn, могут быть перспективными продуцентами биоПАВ, поскольку уже известны некоторые штаммы, например, В subtihs и В hchemformis, В pumilus, продуцирующие поверхностно-активные липопептиды. Однако в целом способность к образованию биоПАВ представителями данного рода изучена недостаточно.
Применение биоПАВ представляется перспективным в медицине и фармакологии, в частности, для приготовления лекарственных форм, таких как жировые эмульсии для парэнтеральнго введения, фторуглеродистых заменителей крови, лечебных аэрозолей и др. Возможно использование биоПАВ для нормализации процессов пищеварения и всасывания при синдроме малабсорбции и других нарушениях, обусловленных дефицитом в кишечнике поверхностно-активных желчных кислот Липопротеиновые и липопептидные биоПАВ рассматриваются как перспективное средство компенсации дефицита легочных сурфактантов у больных [Ганиткевич Я.В., 1988].
В добывающей промышленности, возможно применение микробных ПАВ для увеличения степени извлечения нефти на истощенных месторождениях [Караскевич Е.Н., 1977; Donaldson Е.С. et al., 1984; Gutnic D.L., 1984; Sarkar A.K.et al., 1989; Гринберг T.A. и др., 1990; Беляев; C.C. и др., 1998; Нази-на Т.Н. и др., 1998], для уменьшения вязкости нефти и облегчения ее транспортировки по нефтепроводам, для очистки танкеров и других емкостей от остатков нефти, для стабилизации и дестабилизации эмульсий, для улучшения горючих свойств высокоасфальтовых нефтей [Елисеев С.А. и др., 1991; Кислухи-на О.В. и др., 1993].
Цель исследований. Цель настоящей работы - поиск эффективных продуцентов биоПАВ среди бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, выделение, очистка и характеристика синтезируемых поверхностно-активных веществ. Для этого предстояло решить следующие задачи^
РОС НлцИ0^^ 'НЬЛИОГЕКА
-
Оценить способность бактерий рода Bacillus продуцировать вещества, обладающие поверхностно-активными свойствами, и подобрать активные штаммы для получения биоПАВ.
-
Исследовать закономерности образования биоПАВ в процессе периодического культивирования продуцентов. Изучить влияние некоторых источников углеродного питания на динамику процессов роста и секреции биосурфактантов.
-
Определить физико-химические свойства биоПАВ, продуцируемых бациллами.
4 Установить химическую природу биоПАВ, выделяемого наиболее активным штаммом продуцентом, и оценить его биологическую активность.
Научная новизна. Оценена способность представителей рода Bacillus к образованию поверхностно-активных соединений. Установлено, что наибольшим потенциалом обладают представители вида В subtihs Выявлено, что интенсивное образование поверхностно активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий и завершается к моменту перехода в стационарную фазу Выявлен и запатентован новый штамм В subtihs ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ Установлена химическая идентичность биоПАВ, продуцируемого штаммом В sublilis ИБ-17, ли-попептиду сурфактин. Обнаруженный новый природный штамм почвенных бактерий В subtihs ИБ-17, превосходит по уровню накопления сурфактина известные, даже генетически модифицированные штаммы-продуценты
Практическая значимость работы. Исследования могут быть использованы для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью. Способность биоПАВ липопетидной природы ингибировать рост и развитие мицелиальных грибов, в том числе и дерматофитов, может быть использована при разработке новых фарм- и ветпрепаратов. Штамм В subtihs ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ, может найти практическое применение в нефтедобывающей промышленности для увеличения извлечения нефти из нефтеносных пластов, очистки загрязненной углеводородами почвы, для стабилизации и дестабилизации эмульсий.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
среди представителей рода Bacillus Coh п наибольшим потенциалом образования биоПАВ обладают изоляты вида В subtihs;
новый природный штамм В subtihs ИБ-18, продуцирующий поверхностно-активные вещества, отличающиеся высокой термической стабильностью и биостойкостью;
новый природный штамм В subtilis ИБ-17 - продуцент поверхностно-активных веществ сурфактинов.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Международная конференция "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий [Саранск, 2001]; 6 и 7 Пущинская школа-конференция "Биология наука XXI века" [Пущино, 2002, 2003]; Межрегиональ-
ная конференция молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" [Пермь, 2002]; 1 Всероссийская Интернет - конференции "Интеграция науки и образования в области био- и органической химии и механики многофазовых систем" [Уфа, 2003]; World Conference on Magic Bullets Celebrating Paul Ehrlich's 150th Birthday [Nurnberg, 2004].
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 Патент РФ и 1 заявка на выдачу Патента РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, главы результаты и обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 10 таблиц. Список цитируемой литературы включает 168 наименований.
Классификация микробных ПАВ и их основные продуценты
В настоящее время, в соответствии с химической природой, микробные биоПАВ подразделяют, используя следующую классификацию:
1)гликолипиды;
2) липопептиды (липопротеиды);
3) полисахариды;
4) жирные кислоты и их производные;
5) фосфолипиды. Рассмотрим каждую из этих групп.
1. Гликолипиды. Это наиболее часто встречающиеся биосурфактанты. Структура почти всех микробных гликолипидов установлена. Это углеводы в комбинации с длинноцепочными алифатическими кислотами или гидрокси алифатическими кислотами.
Примерами гликолипидных сурфактантов, могут служить: Трегалозолипиды - гликолипиды, содержащие дисахарид трегалозу. Наиболее изучены Трегалозодимиколаты Rhodococcus erythropolis (рис. 1.1). Липо-фильные фрагменты данных гликолипидов представлены смесью коринемико-ловых кислот.
Другими продуцентами трегалозодимиколатов являются Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium и Nocardia [Desai J.D., 1997], образующие ПАВ при росте на углеводород содержащих средах [Zajic J.E., 1984].
Для микробиологического производства гликолипидных биоПАВ, в качестве продуцентов используют Mycobacterium phlei или Nocardia rhodochrous. Эти биоПАВ представляют собой гликолипиды, углеводная часть которых представлена дисахаридами, главным образом трегалозой, мальтозой, изомаль-тозой и др. Культивирование производят в минеральной среде, содержащей углеводороды при интенсивной аэрации и перемешивании. Nocardia erythropolis растут на среде с минеральными солями и 4% гексадекана при температуре 25С [Ганиткевич Я.В., 1988].
Рамнолипиды - представляют собой гликолипиды, содержащие 1 или 2 молекулы рамнозы, связанные с 1 или 2 молекулами Р-гидроксидекановой кислоты (рис. 1.2).
Многие виды Pseudomonas известны как продуценты рамнолипидов. При росте на среде Чапека с гексадеканом бактерии P. aeruginosa П20 образуют ли-пофильные эмульгаторы [Коронелли Т.В. и др., 1983; Карпенко Е.В. и др., 1996]. Однако и при использовании в качестве источника углерода и энергии глицерина, глюкозы, сахарозы, сортового сиропа, растительного масла и этанола также отмечается образование рамнолипида [Турковская О.В. и др., 2001]. Известен штамм, P. aeruginosa Б8, продуцирующий внеклеточные биоПАВ на минимальной солевой среде с глицерином. Продукция внеклеточного биоПАВ ассоциирована с ростом клеток и резко увеличивается в экспоненциальной фазе [Дмитриева Т.В. и др., 1996]. В зависимости от условий культивирования образуется четыре различных рамнолипида.
В условиях лимита по азоту на средах с п-алканами псевдомонады синтезируют большие количества биоПАВ. Например, при инкубации покоящихся клеток в течении 168 часов при 37С в фосфатном буфере (рН 5-7,2) образовывалось до 3,5 г рамнолипида на 1 г сухого веса биомассы.
Софорозолипиды - гликолипиды, состоящие из дисахарида софорозы аце-тилированной по 6 и б7 и липидной части, представленной гидрокси алифатическими кислотами (рис. 1.3).
Софорозолипиды снижают поверхностное и межфазное натяжение, но не являются эффективными эмульгаторами. Софорозолипиды обычно синтезируются дрожжами рода Torulopsis, растущими на алканах в качестве источников углерода [Desai J.D., 1987]. В ряде случаев софорозолипиды образуются на средах с моно- ди- и трисахаридами. Длина цепи и структура липофильной части изменяется в зависимости от состава питательной среды. Однако, используемый субстрат не влияет на гидрофобную или гидрофильную часть софорозолипида, при использовании в процессе биосинтеза покоящихся клеток [Gutnick D.L. etal., 1987].
2. Липопротеины и липопептиды. Большое количество микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, синтезирует высокомолекулярные сурфактанты, включающие белки, полисахариды, липопро теины, липополисахариды. Так, при росте культуры P. aeroginosa S-B1 на нерастворимых субстратах - гексадекане и цетиловом спирте, вместе с рамноли-пидами в среде был обнаружен поверхностно-активный протеин-подобный активатор роста. Белок имел массу 14300 Da и состоял из 143 аминокислот. Характерной его особенностью явилась циклическая структура и высокое содержание серина и треонина при отсутствии аргинина и гистидина [Gutnick D.L. et al., 1987]. Штамм P. putida PCL1445 производит поверхностно-активные вещества в конце экспоненциальной фазы роста. Структурный анализ этих веществ, названных путисовинами, показал, что это циклические липопептиды, с гекса-новой липидной цепью, связанной с N-концом 12-аминокислотной пептидной цепи, у которой с С-конца карбоксильная кислотная группа формирует эфир с гидроксильной группой Ser9 [Kuiper I. et al., 2004]. Циклические липопептиды с антибиотическими и биосурфактантными свойствами производятся многими почвенными бактериями, включая P. fluorescens [Nielsen Т.Н. et al., 2002]. Эти циклические липопептиды, названные тензинами, состоят из 3-гидроксидекановых остатков в комбинации с 11-ю аминокислотными остатками. Тензины уменьшают поверхностное натяжение воды с 73 до 30 мН/м и достигают точки ККМ при 25 мг/мл [Nielsen Т.Н. et al., 2000; Sorensen D. et al., 2001; De Souza J.T. et al., 2003]. Различные штаммы P. fluorescens синтезируют наибольшее количество циклического липопептида тензина на единицу биомассы когда растут на средах, содержащих глюкозу, магнитол или глутамат в качестве источника углерода. Когда в качестве ростовых субстратов используется фруктоза, сахароза или аспарагин количество тензина на единицу биомассы значительно меньше. Производство тензина почти одинаково на средах, с различным начальным уровнем углерода, тогда как снижение начального уровня азота снижает синтез липопептида [Nielsen Т.Н. et al., 2000].
У цианобактерий Phormidium Л, был обнаружен внеклеточный биоэмульгатор, названный эмульсианом. Эмульсиан - это сложный комплекс, состоящий из протеинов, эфиров жирных кислот и углеводородов. Он способен эмульгировать углеводороды в воде в присутствии ионов Mg [Gutnick D.L. et al., 1987].
Известен биоэмульгатор, образуемый дрожжами Candida lypolytica при росте на алканах. Этот материал, названный впоследствии липозаном, накапли вается в среде в количестве до 2 г/л. Липозан представляет собой углеводород, связанный с 2-7% протеина. Липозан способен эмульгировать широкий ряд гидрофобных материалов, включая масла, алканы и ароматику [Gutnick D.L. et al., 1987].
Липопептиды - это относительно низкомолекулярные соединения. Штаммы Bacillus известны как продуценты биоактивных циклических липо-пептидных биосурфактантов, которые могут быть подразделены на две группы. Вещества, относящиеся к первой группе, имеют такую общую особенность, как N-конец пептидной цепи, связанный с помощью амидной связи с р-гидрокси или с Р-аминожирной кислотой, а карбоксильная группа с С-конца формирует лактон с Р-гидрокси группой, такой как у сурфактина и лихенизинов, или формирует лактам, с Р-аминогруппой, такой как у шуринов и бацилломицинов. В этом случае жирная кислота включается в циклическую систему. Вторая группа состоит из плипастатинов, колистинов и октапептинов, в которых как N-конец циклического пептида связан через амидную связь с жирной кислотой, лежащей снаружи циклической системы [Не Н. et al., 2001].
Из штамма В. circulars был выделен ряд новых циклических липопепти-дов, названных циркулоцинами. Эти соединения, принадлежащие ко второй группе, содержат либо депсипентапептид, либо депсигексапептид, центр которого связан с жирной кислотой, оканчивающейся гуанидино функциональной группой [Не Н. et al, 2001].
Многие антибиотики, синтезируемые бактериями рода Bacillus, относятся к липопептидам. По своей природе они амфифильны и обладают поверхностно-активными свойствами. Достаточно сильные поверхностно-активные свойства проявляют декапептидные антибиотики (грамицидины) и липопептидные (по-лимиксины) у В. brevis и В. polymyxa соответственно [Desai J.D., 1987, Desai A.I. etal., 1994].
Полимиксины - это циклические липопептиды, содержащие такие компоненты как а, у-диаминобутиловая кислота, L-треонин и жирные кислоты. Они различаются присутствием или отсутствием добавочных аминокислот, а также природой жирных кислот [Елоховская В.А. и др., 1993; Orwa J.A. et al., 2001].
Биологическая активность липопептидных биоПАВ
Большинство липопептидов, продуцируемых представителями рода Bacillus, проявляют резко выраженные антибиотические свойства. Так, бацил-ломицины проявляют сильную антигрибную активность в отношении фитопа-тогенных грибов Alternaria solani, Aspergillus flavus, Botryosphaeria ribis, Colleotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Helminthosporium maydis, Pho-mopsis gossypii, Sclerotium rolfsii и других [Moyne A.L. et al., 2001]. Основываясь на широко распространенной способности представителей В. subtilis продуцировать липопетидные антибиотики, культуры ряда штаммов этих бактерий предложены в качестве агентов биологического контроля болезней растений. Основными антигрибными экзометаболитами являются липопептиды итурин, фенгицин, плипастатин и сурфактин. Некоторые штаммы способны синтезировать эти вещества одновременно. Так В. subtilis S499 одновременно выделяет в среду около 110 мг/л сурфактина и 39 мг/л итурина A [Sandrin С. et al., 1990]. Итурин - циклический гептапептид с Р-аминокарбоновой кислотой, сильное антигрибное соединение В. subtilis [Feignier C.et al, 1996]. Кроме того, установлено, что, в частности, итурин А ингибирует образование афлотоксинов A. flavus и A. parastiticus [Moyne A.L. et al., 2001].
Относительно немного известно о точных механизмах действия В. subtilis, используемых в качестве агентов биологического контроля болезней растений. Исследуя воздействие дикого штамма В. subtilis 6051 на P. syringae -возбудителя корневой гнили растений рода Arabidopsis, Bais Н.Р. с соавторами (2004) отметили образование трехмерной биопленки интродуцированных бацилл на корнях растения. Такое образование пленки сопровождалось секрецией сурфактина и предотвращало заражение растения патогеном. Мутантный штамм В. subtilis Ml, лишенный способности синтезировать сурфактин, оказался не способным формировать биопленку и, соответственно, предохранять растения от инфекции.
Биологическая активность индивидуальных липопептидов резко возрастает при совместном действии соединений, отличающихся по химической структуре. Так, сурфактин и итурин А, действуя совместно, увеличивают как биологическую активность друг друга, так и степень адсорбции на поверхности раствора, плотность пленки, плотность и стабильность пены [Maget-Dana R. et al., 1992; Razafmdralambo H., 1996].
Антигрибная активность липопептидов, вероятно, обусловлена более выраженным взаимодействием с эргостерином, который в больших количествах содержится в липидной фракции грибных мембран, чем с холестерином, присутствующим в других организмах. Тем не менее, антибиотическая активность многих липопептидов проявляется также в отношении различных дрожжей [Besson F. et al., 1984; Latoud С. et al., 1987, 1988], и некоторых бактерий Micrococcus luteus [Besson F. et al., 1978; Peypoyx F. et al., 1979].
Так, итурины и бацилломицины, в отличие от сурфактинов, ингибируют рост и развитие большинства дрожжей [Besson F. et al., 1984; Latoud С. et al. 1987, Besson F., Michel G., 1989; Latoud С et al., 1990; Thimon L. et al., 1994]. Изучая действие итурина А на покоящиеся клетки Saccharomyces cerevisiae, Latoud С. с соавторами (1987) отметили существенные изменения проницаемости мембран. Цитоплазматическая мембрана при действии итурина становилась проницаемой для таких компонентов цитоплазмы как нуклеотиды, белки, полисахариды и липиды. Содержание липидов в клетках сильно нарушалось - уровень содержания фосфолипидов, в особенности фосфатидилхолина, снижался, при одновременном повышении уровня жирных кислот. Чувствительность дрожжевых клеток определяется природой стиролов цитоплазматической мембраны. Мутантный штамм S. cerevisiae, содержавший в мембране холестерол вместо эргостерола, обладал большей аффинностью к шурину и наибольшей чувствительностью к действию этого антибиотика [Latoud С. et al., 1990]. Напротив, присутствие стигмастерола увеличивало резистентность дрожжевых клеток.
Электронно-микроскопические исследования действия итурина на дрожжевые клетки показало, что итурин разрушает цитоплазматическую мембрану с образованием небольших везикул и агрегацией внутримембранных частиц. Более того, итурин, проникая в цитоплазму, взаимодействует с ядерной мембраной и мембраной клеточных органелл [Thimon L., 1985].
Микосубтилин, другой антибиотик итуриновой группы, ингибируя рост S. cerevisiae, неспецифически снижает включение радиоактивных предшественников в белки, РНК и полисахариды [Besson F., Michel G., 1989]. Эти же авторы отмечают способность микосубтилина лизировать сферопласты дрожжевых клеток. Летальная доза итурина А для клеток S. cerevisiae составляет 10 мкг/мл, а микосубтилина - 60 мкг/мл [Besson F. et al., 1984].
Липопептид сурфактин, продуцируемый некоторыми штаммами В. subtilis, также является антибиотиком. Установлено, что сурфактин при концентрации 14 мг/мл, вызывает разрушение более 90% протопластов, приготовленных из В. megaterium, вызывает выделение внутриклеточного содержимого из неповрежденных клеток без снижения их плотности и неконкурентно инги-бирует алкан-фосфатазу [Tsukagoshi N. et al., 1970; Bortolano M. et al., 1997].
Сурфактин оказывает воздействие на гидрофобность поверхности бактериальных клеток, в частности, В. subtilis. Причем, если обрабатывать раствором сурфактина гидрофильный штамм, с увеличением концентрации сурфактина поверхность бактерий становится гидрофобной. А если обрабатывать гидрофобный штамм, с увеличением концентрации сурфактина его поверхность становится более гидрофильной. Подобные результаты могут быть объяснены ориентацией пептидного цикла и углеводородной цепи относительно гидрофильного или гидрофобного характера бактериальной поверхности. В случае гидрофобной бактериальной поверхности пептидный цикл как гидрофильная часть адсорбируется на поверхности, а углеводородные цепи остаются в окру жающей среде. Следовательно, бактериальная поверхность становится более гидрофобной. Для гидрофобной поверхности картина становится обратной, то есть пептидные циклы выставляются в окружающую среду, а углеводородные цепи адсорбируются на поверхности бактерии. В результате поверхность становится более гидрофильной [Ahimou F. et al., 2000].
Не так давно была обнаружена антимикоплазматическая и антивирусная активность сурфактина [Vollenbroich D. et al., 1998]. Сурфактин инактивирует инкапсулированные вирусы, такие как вирусы герпеса и ретровирусы гораздо эффективнее, чем вирусы без оболочек. Так, активность сурфактина в отношении вируса герпеса и ретровирусов проявляется при концентрациях 25 цМ. Концентрации выше 80 цМ сурфактина приводят к инактивации вирусов герпеса простого тип 1 и 2 (HSV-1, HSV-2) за 15 мин, а вируса иммунодефицита обезьяны (SIV) и везикулярного вируса стоматита (VSV), в течении 60 мин. Данная активность вызвана физико-химическими взаимодействиями мембран-активного сурфактанта с липидами вирусных мембран. Разрушение липидной мембраны вирусов при действии сурфактина зарегистрировано с помощью электронной микроскопии [Vollenbroich D. et al., 1997].
Инактивация инкапсулированных вирусов стоматита (VSV), вируса леса Семлики (SFV) и калициовируса кошек тип 1 (SHV-1) сурфактинами зависит от их гидрофобности, а именно, от длины углеводородной цепи гидроксикарбоно-вой кислоты в молекуле липопептида, величины заряда пептидного участка, а также от вида вируса [Kracht М. et al., 2001]. Как показали авторы, сурфактины с 13-ю углеродными атомами в жирнокислотном остатке обладают гораздо меньшей антивирусной активностью, чем Си или Cis изоформы. Монометиловый эфир сурфактина С15, имеющего меньший заряд пептидной группы, способен инактивировать вирус SFV, устойчивый к действию смеси природных сур-фактинов.
Способность сурфактина разрушать клетки микоплазм была установлена в культурах различных линий клеток животных и человека, контаминирован-ных микоплазмами [Vollenbroich D. et al., 1997]. Однократная обработка сур-фактином в концентрациях от 30 до 64 дМ при одном пассаже приводила к освобождению культуры от жизнеспособных клеток Mycoplasma hyorhinis. Освобождение культуры клеток человека Т-лимфоидной линии от М. orale достига лось при двукратной обработке. Низкая цитотоксичность сурфактина по отношению к клеткам млекопитающих позволяет специфически инактивировать микоплазмы без существенного ущерба для метаболизма и пролиферации животных клеток.
Динамика роста и секреции биоПАВ в жидкой культуре
Синтез биосурфактантов, а в особенности липопептида сурфактин, который осуществляют бактерии рода Bacillus, изучался многими авторами. В основном, наибольшее количество сурфактина в среде наблюдается после 24 часов культивирования, затем концентрация остается постоянной [Akihiro О. et al., 1992], поскольку это соединение синтезируется индуцированными активно растущими клетками с постэкспоненциальным синтезом [Vater J., 1986]. Про веденные работы показывают, что бациллы способны расти и продуцировать биоПАВ на известных и простых средах, но достаточно дорогого состава. Следует отметить, что нам не удалось обнаружить использования другими авторами при культивировании бацилл, для получения биосурфактантантов, в качестве источника углерода и энергии - крахмал.
С целью изучения и сравнения способности трех продуцентов биоПАВ -В. subtilis ИБ-17, В .subtilis ИБ-18 и В. subtilis ИБ-19 к синтезу целевого продукта на среде содержащей крахмал и происходящими при этом изменениями некоторых физиологических показателей культуры (рН культуральной жидкости, оптической плотности и содержания биомассы), нами были поставлены опыты по периодическому культивированию микроорганизмов.
Динамика изменения поверхностного натяжения культуральной жидкости при культивировании отобранных штаммов бацилл, изучалась в жидкой среде Ккр. Время культивирования составляло 140 ч при 37С.
Продукцию биоПАВ при культивирования штамма В. subtilis ИБ-17 мы обнаруживали в среде уже через 10 ч от начала инкубации. Через 24 ч активность биоПАВ достигла своего максимума, поверхностное натяжение культуральной жидкости стабилизировалось, и уже практически не изменялась до 96 ч культивирования.
Резкое увеличение оптической плотности в культуральной жидкости было обнаружено также через 10 ч после начала культивирования В. subtilis ИБ-17. Через 24 ч оптическая плотность культуры возрастала более чем в 5 раз и достигала своего максимального значения, однако, затем наблюдалось ее постепенное снижение. На 72 ч культивирования оптическая плотность снизилась почти в 2 раза и оставалась практически на том же уровне до конца опыта. Изменение общей биомассы происходило параллельно с изменением оптической плотности (рис. 4.1).
Динамика изменения уровня рН среды в ходе культивирования штамма В. subtilis ИБ-17 имела характер, свойственный для периодического культивирования бацилл, а именно, через 30 ч от начала культивирования произошло снижение рН до 6,0, а затем постепенно стало возрастать, и достигло значения 6,44 на 96 ч инкубации (рис. 4.1).
Образование биоПАВ при культивировании штаммов В. subtilis ИБ-18 (рис. 4.2) и В. subtilis ИБ-19 (рис. 4.3) обнаруживалась в среде через 10 ч от начала их культивирования, также как и для штамма В. subtilis ИБ-17. Динамика изменения поверхностного натяжения культуральной жидкости в ходе культивирования штаммов имела сходный характер, как это описано выше.
Характер изменения оптической плотности и рН культуральной жидкости при культивировании штаммов В. subtilis ИБ-18 и В. subtilis ИБ-19 была подобна той, которую наблюдали при росте штамма В. subtilis ИБ-17. Через 24 ч от начала культивирования оптическая плотность КЖ В. subtilis ИБ-18 возрастала более чем в 2 раза (в случае В. subtilis ИБ-19 через 30 ч, примерно в 4 раза), а затем наблюдалось ее снижение. К 72 ч культивирования у штамма В. subtilis ИБ-19 оптическая плотность упала почти 6 раз и оставалась практически на том же уровне до конца процесса. У штамма В. subtilis ИБ-18 на 72 часа оптическая плотность снизилась только в 1,1 раза (по отношению к 24 ч культивирования). После 96 ч культивирования оптическая плотность упала еще в 1,3 раза (по отношению к 72 ч) или в 1,5 (по отношению к 30 ч) и затем оставалась практически на том же уровне до конца культивирования.
Изменение биомассы этих штаммов соответствовало изменению оптической плотности (рис. 4.2 и 4.3). Только у штаммов В. subtilis ИБ-17 и В. subtilis ИБ-19 максимальный уровень биомассы достигал своего значения к 30 ч, а у В. 5иШиИБ-18-к48ч.
Таким образом, продукция биоПАВ исследуемыми штаммами в ходе их периодического культивирования, отмечается примерно через 10 ч от начала их выращивания, что соответствует логарифмической фазе роста. С переходом в стационарную фазу (через 24 ч) концентрация биоПАВ достигает своего максимума, поскольку поверхностное натяжение культуральной жидкости стабилизировалось, и уже практически не изменялась до конца культивирования.
Следовательно, интенсивное образование поверхностно активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий и завершается к переходу в стационарную фазу. При прекращении вегетативного роста клеток и переходу их к формированию спор дальнейших изменений в величине поверхностного натяжения не происходит. Ц Очевидно, что образуемые исследуемыми штаммами бактерий биоПАВ, не являются продуктами лизиса клеток. Синтез поверхностно-активных веществ культурами бацилл связан с интенсивностью катаболических процессов, а это позволяет, при разработке соответствующих технологий, использовать процессы непрерывного культивирования продуцентов.
Биологическая активность В. subtilis ИБ-17
Известно [Quentin MJ. et al., 1982; Latoud С. et ah, 1986; Feignier C. et al, 1996], что сурфактины обладают множественной биологической активностью. Поэтому, в дополнение к физико-химическим свойствам, характеризующим биоПАВ В. subtilis ИБ-17 как сурфактин, нами были проведены некоторые тесты в отношении его биологической активности. Согласно данным, приведенным в обзоре литературы, сурфактины относятся к мембрано-тропным веществам и, вследствие этого, они способны вызывать гемолиз эритроцитов, а также проявлять антивирусную, антимикробную и антигрибную активности.
Тесты на гемолиз эритроцитов проводили как в агаре с донорской кровью человека методом лунок, так и в растворе отмытых эритроцитов мышиной крови.
В опытах с кровяным агаром использовали концентрации веществ 1000, 400 и 40 мкг/мл препаратов сурфактина В. subtilis ИБ-17.
На рисунке 7.2 представлена типичная картина гемолиза эритроцитов человека при определении методом лунок. При концентрации сурфактина 400 мкг/мл гемолитическая активность была выявлена в исходном препарате, а также у фракций 3; 4; 5; 6, разделенных методом препаративной ВЭЖХ, и во фракции, снятой с колонки 100%-ным метанолом. Судя по характеру ореолов гемолиза, имеет место так называемый а-гемолиз, когда непосредственно вокруг лунок образуется небольшой ореол из целых или частично лизиро-ванных эритроцитов, а к нему примыкает зона полного гемолиза, распространяющаяся далее в среду [Лабинская А.С, 1978]. Численные данные гемолитической активности представлены в таблице 10.
С целью определения кинетики гемолиза эритроцитов были проведены опыты в растворе отмытых эритроцитов мышиной крови. Было обнаружено, что кинетика гемолиза эритроцитов в растворе зависит от концентрации сурфактина (рис. 7.1). На этом рисунке показаны три кривые. Контроль - это исходный раствор эритроцитов с учетом разбавления. Опыт А - это кривая гемолиза двух мл эритроцитов в смеси с 0,1мл культуральной жидкости штам ма РІБ 17. Опыт Б - это кривая гемолиза двух мл эритроцитов в смеси с 0,2 мл культуральной жидкости штамма ИБ 17.
Из литературных источников известно, что сурфактины обладают избирательной антигрибной активностью, в частности, они не угнетают рост аско-мицетов Sacharomyces cerevisia в противоположность другому липопептиду бацилл - итурину [Feignier С. et al., 1996].
Поэтому одной из задач данной работы было изучение антигрибной активности, проявляемой препаратом сурфактин В. subtilis ИБ-17 и отдельных его фракций, разделенных методом препаративной ВЭЖХ, на аскомицет S. cerevisia и некоторые мицелиальные грибы: Drechslera sorokiniana, Fusarium gibbosum, F. sambucinum и Penicillium variabile.
Однако до проведения этих исследований необходимо было выяснить оказывает ли сама культура В. subtilis ИБ-17 антагонистическую активность по отношению к тестируемым микроорганизмам.
Штамм В. subtilis ИБ-17 подвергали проверке на антагонистическую активность к тестируемым грибам методом укола, совместного культивирования на чашках Петри и регистрации зон подавления грибного мицелия вокруг бактериальных колоний. Было показано, что культура В. subtilis ИБ-17 подавляет только два тестируемых организма - D. sorokiniana и P. variabile.
Для дальнейших исследований были взяты грибы D. sorokiniana и Р. variabile, которые подавляются метаболитами В. subtilis ИБ-17 и культура S. cerevisia - устойчивая к действию метаболитов. Методом лунок, анализировали очищенный препарат сурфактина В. subtilis ИБ-17 и отдельные его фракции, разделенные с помощью ВЖХ, на антагонистическую активность к D. sorokiniana, P. variabile и S. cerevisia.
В проведенных исследованиях (табл. 10), как и ожидалось ингибирования роста дрожжей S. cerevisia обнаружено не было, но в то же время мы не наблюдали подавления мицеллиального гриба P. variabile во всех исследованных концентрациях вещества от 40 до 1000 мкг/мл.
В биотесте с мицелиальным почвенным грибам D. sorokiniana при концентрации веществ 40 мкг/мл антагонистическая активность также не обнаружена. Однако самая сильная антагонистическая активность наблюдалась у общей фракции, несколько меньшую активность показала 6 фракция, и небольшую пятая фракция и четвертая в концентрации 1000 мкг/мл.
В дополнение к этим биотестам в лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН и Уфимском городском кожно-венерологическом диспансере было установлено, что культуры В. subtilis ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19 способны подавлять рост и развитие грибов Trichophyton ги-Ъгит, Т. Mentagrophytes var. Gipseum и Microsporium canis, вызывающих дерма-томикозы, что является новым, ранее не известным свойством бацилл, образующих липопептиды.
Наибольшая антигрибная и гемолитическая активность проявляется в сыром препарате. Она отсутствует в первой, второй и третьей фракциях и начинает проявляться в четвертой и последующих, также возрастая с увеличением гидрофобности. Это наблюдение позволяет судить о схожести механизмов антигрибного и гемолитического действия сурфактина, обусловленного взаимодействием с мембранами эритроцитов и/или грибных клеток. Данные о гемолитической и антигрибной активности суммированы в сводной таблице 10.
Определяющую роль, при неизменности гидрофильной части молекулы, в процессе взаимодействия с липидными мембранами вероятно имеет структура и длина углеродной цепи р-гидроксижирной кислоты. Из литературных данных известно, что гидрофобный фрагмент Р-гидроксижирной кислоты природных сурфактинов может быть представлен в виде изо- и антеизо-Си, изо- и ан-тиизо-Сн, и изо- и антеизо-Сі5 - структур.
