Содержание к диссертации
Актуальность работы 6
Цели и задачи работы 7
Научная новизна 8
Практическая ценность работы 8
Апробация работы 9
Объем работы 9
Место проведения работы 9
Благодарности 10
Принятые сокращения и обозначения 11
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ В ВОДОЕМАХ
1.1. Места обитания аноксигенпых фототрофных бактерий 12
1.1.1. Термальные источники 12
1.1.2. Мелководные водоемы 12
А. Мелководные соленые водоемы 13
Б. Мелководные пресные водоемы 13
1.1.3. Стратифицированные водоемы 14
1.2. Аноксигенные фототрофные бактерии в меромнктическнх водоемах 15
1.2.1. Структура стратифицированного (меромиктического) водоема 15
1.2.2. Взаимосвязь микробных сообществ в меромиктическом водоеме 15
1.2.3. Гидрохимические особенности меромиктических водоемов 16
A. Влияние солености водоемов на развитие аноксигенных фототрофных бактерий 16
Б. Влияние кислорода и сероводорода на развитие аноксигенных фототрофных бактерий 18
B. Влияние трофии водоема на развитие аиоксигенных фототрофных бактерий 19
Г. Влияние спектрального состава света, а также интенсивности и характера освещения на развитие аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах 20
а) Поглощение света каротиноидами 20
б) Поглощение света бактериохлорофиллами 21
в) Интенсивность и характер освещения 22
ГЛАВА 2. АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ: СИСТЕМАТИКА, ЦИТОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ, МЕТАБОЛИЗМ
2.1. Отличительные особенности группы аноксигенных фототрофных бактерий 24
2.2. Систематика аноксигенных фототрофнх бактерий 25
2.3. Морфология, цитология, физиология, темновой метаболизм аноксигенных фототрофных бактерий 27
2.3.1. Морфология, цитология пурпурных бактерий 28
2.3.2. Отношение пурпурных бактерий к параметрам внешней среды 30
2.3.3. Темновой метаболизм пурпурных бактерий 32
2.3.4. Морфология, цитология зеленых серобактерий 33
2.3.5. Отношение зеленых бактерий к параметрам внешней среды 34
2.3.6. Темновой метаболизм зеленых серобактерий 35
2.4. Особенности бактериального фотосинтеза 36
2.4.1. Особенности строения фотоспнтетического аппарата аноксигенных фотогрофных бактерий и процесс фотосинтеза 36
2.4.2. Доноры электронов 37
2.5. Фиксация углекислоты и потребление органических
веществ аноксигенньши фототрофными бактериями 39
2.5.1. Фиксация углекислоты и потребление органических веществ пурпурными бактериями 39
2.5.2. Фиксация углекислоты и потребление органических
веществ зелеными серобактериями 42
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МАССОВОГО РАЗВИТИЯ АНОКСИГЕННЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В ВОДОЕМАХ
3.1. Динамика сообщества аноксигенных фототрофных бактерий 46
3.2. Влияние аноксигенных фототрофных бактерий на озерную экосистему 47
3.3. Вклад аноксигенных фототрофных бактерий в первичную продукцию водоемов 48
ГЛАВА 4. ЯВЛЕНИЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ИЗОТОПОВ УГЛЕРОДА
4.1. Изотопный состав углерода, степень фракционирования 52
4.2. Механизмы фракционирования изотопов углерода 53
4.2.1. Химическое фракционирование изотопов углерода 53
4.2.2. Фракционирование изотопов углерода в биологических системах.. 54
4.3. Зависимость фракционирования от путей потребления углеродсодержащих соединений 57
4.3.1. Рост в фотоавтотрофных условиях 57
4.3.2. Фракционирование при фотомиксотрофном росте 59
4.3.3. Легкие и тяжелые клеточные фракции 59
4.4. Физиологические последствия наличия в клетках углерода с повышенным содержанием изотопа 13С 62
4.5. Изотопный состав органического углерода взвеси в водоемах 63
Заключение к обзору литературы 65
Примечания к обзору литературы 67
ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1. Исследование образцов озерной воды и взвеси водной толщи 68
Объекты исследования — озера 68
Оборудование и методы 69
Отбор проб 69
Определение профилей температуры, солености и рН 69
Определение содержания ионов СГ и БО " в озерной воде... 69
Измерение концентрации кислорода п сероводорода в пробах воды 69
Измерение скорости фотосинтеза 69
Определение общей численности микроорганизмов 69
Определение содержания бактериохлорофиллов в воде озер 70
Изотопный анализ проб озерной воды и биомассы культур в экспериментах 70
1.2. Выделение и изучение культур аноксигенных фототрофных бактерий 71
Использованные питательные среды 71
Получение накопительных культур аноксигенных фототрофных бактерий 72
Определение численности аноксигенных фототрофных бактерий в воде озер 72
Выделение и очистка культур аноксигенных фототрофных бактерий 72
Исследование пигментного состава аноксигенных фототрофных бактерий 72
Определение оптимальных условий развития бактерий 72
Изучение морфологии бактерий внутреннего строения клеток и
получение микрофотографий 72
Филогенетический анализ 73
1.3. Проведение экспериментов по фракционированию стабильных изотопов углерода аноксигенными фототрофнымн бактериями 74
Объекты исследования - аноксигенные фототрофные бактерии... 74
Использованные среды 74
Схема постановки эксперимента 74
Анализируемые показатели 74
Методы анализа показателей 75
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Озеро Могильное 76
2.1.1. Физико-химическая характеристика 76
2.1.2. Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий 78
2.1.3. Выделенные и идентифицированные аноксигенные фототрофные бактерии 84
2.1.4. Определение и анализ оптимальных параметров роста выделенных штаммов 85
2.2 Озеро Шира 87
2.2.1. Физико-химическая характеристика 87
2.2.2. Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий 88
2.2.3. Характеристика и идентификация выделенных аноксигенных фототрофных бактерий 89
2.2.4. Определение и анализ оптимальных параметров роста
выделенных штаммов 97
2.3. Озеро Шунет 100
2.3.1 .Июль 2002 100
Физико-химическая характеристика 100
Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий 101
2.3.2. Август 2003 101
Физико-химическая характеристика 101
Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий 104
2.3.3. Февраль-март 2003 104
Физико-химическая характеристика 104
Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий 105
2.3.4. Морфофизиологическая характеристика и таксономическое положение выделенных культур аноксигенных фототрофных бактерий 106
2.3.5. Определение и анализ оптимальных параметров роста
выделенных штаммов 111
2.4. Озеро Гек-Гёль 114
2.4.1. Физико-химическая характеристика 114
2.4.2. Активность аноксигенных фототрофных бактерий 114
2.4.3. Выделенные и идентифицированные аноксигенные фототрофные бактерии 116
2.4.4. Определение оптимальных параметров роста выделенных
штаммов аноксигенных фототрофных бактерий 119
2.5. Продукция органического вещества в исследованных водоемах... 120
2.6. Фракционирование изотопов углерода в процессе ассимиляции соединений неорганического углерода в водоемах 122
2.7. Результаты экспериментов по фракционированию изотопов углерода 12С н 3С выделенными аноксигенными фототрофнымн бактериями 129
ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Доминирующие н минорные виды аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических водоемах 133
3.1.1. Доминирующие и минорные виды в озере Могильное 133
3.1.2. Доминирующие и минорные виды в озере Шира 135
3.1.3. Доминирующие и минорные виды в озере Шунет 137
3.1.4. Доминирующие и минорные виды в озере Гек-Гёль 138
3.2. Закономерности развития аноксигенных фототрофных бактерий в хемоклине озер в зависимости от физико-химических характеристик водной толщи
3.3. Продукция и изотопный состав органического вещества в
озерах 141
3.4. Сравнение результатов экспериментов по фракционированию стабильных изотопов углерода с данными исследований 513С в озерах и литературными данными 143
3.4.1. Зависимость эффекта фракционирования изотопов углерода от пути фиксации углекислоты клетками аноксигенных фототрофных бактерий 143
3.4.2. Взаимосвязь эффекта фракционирования изотопов углерода и скорости роста аноксигенных фототрофных бактерий 144
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 147
ВЫВОДЫ 149
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 150
Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1
Введение к работе
Актуальность работы
К настоящему времени накоплено много данных, касающихся геохимической деятельности, физиологии и распространения аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах {Горленко, 1977; Кондратьева, 1996; Van Gemerden, Mas, 1995; Overmann, 1997; Imhoff, 2003, 2005). Места массового обитания фототрофных бактерий обычно делят на три типа: термальные источники, мелководные (соленые и пресные) водоемы, стратифицированные водоемы {Горленко, 1981). Однако в небольших количествах аноксигенные фототрофные бактерии присутствуют практически во всех водоемах, а также в затопляемых почвах.
Широкое распространение фототрофных серобактерий обусловлено их способностью использовать при фотосинтезе сероводород в качестве донора водорода. Эта физиологическая особенность позволяет пурпурным и зеленым серобактериям занять особую экологическую нишу в меромиктических водоемах, имеющих анаэробную зону, доступную солнечному свету. Первичная продукция фототрофных серобактерий может быть весьма значительной, и при активном росте в водоемах биомасса этих бактерии становится. пищей для амеб, ряда ракообразных и других беспозвоночных животных. Несерные пурпурные бактерии, которые не используют сероводород или используют, но имеют при этом низкую скорость роста, никогда не развиваются в значительном количестве. Фототрофные серобактерии обладают также альтернативными путями обмена, которые служат у них средством для переживания неблагоприятных периодов существования.
Большинство предыдущих исследований базировалось на морфо-физиологическом определении видов выделенных аноксигенных фототрофных бактерий (Горленко, 1977; Кондратьева, 1996; Van Gemerden and Mas, 1995). Однако с развитием молекулярно- биологических методов морфо-физиологической идентификации оказалось недостаточно для установления видовой принадлежности микроорганизмов. Поэтому на сегодняшний день требуется ревизия большинства видов фототрофных бактерий, выделенных в 70-80 гг. прошлого столетия из различных меромиктических водоемов, с целью установления их филогенетического положения. Мало изученными остаются также сезонная изменчивость структуры и активность сообществ аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических водоемах различных типов.
На чистых культурах фототрофных и хемолитотрофных бактерий показан эффект фракционирования углерода, что приводит к некоторому облегчению образующейся биомассы бактерий по сравнению с используемой углекислотой {Wong, Sackett, 1975;
Бондарь и др., 1976; Qandt et al., 1977; Zyahin et al., 1977; Зякуи u др., 1996, 1998; Зякун, Ивановский, 2000; Ладыгина, 2003). Поэтому изотопный состав органического углерода взвеси и углекислоты может быть хорошим индикатором зоны развития фототрофных и/или хемолитотрофных бактерий в природных сообществах. Вместе с тем до сих пор в литературе известны лишь единичные данные о закономерностях фракционирования изотопов углерода микробным сообществом, развивающимся на границе окисленных и восстановленных вод в меромиктических водоемах. В частности, имеются сведения об изменении изотопного состава органического углерода взвеси в водной толще Черного моря вблизи хемоклина {Иванов и др., 2000), в меромиктическом озере Могильное (Иванов, 2001), в соленом меромиктическом озере Кейки (Kaiike) в Японии (Ohkouchi et al., 2003, 2005), а также в пресном меромиктическом озере Каданьо (Cadagno) в Швейцарии (Camacho et al., 2001). Поэтому представляет интерес исследование эффекта фракционирования изотопов углерода в зоне массового развития фототрофных бактерий в меромиктических водоемах в сочетании с лабораторным изучением особенностей фракционирования на чистых культурах фототрофных бактерий.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы было определение биоразнообразия аноксигенных фототрофных бактерий и их роли в продукции органического вещества в меромиктических водоемах.
В задачи входило:
1. Количественная оценка вклада аноксигенных фототрофных бактерий в продукцию органического вещества в меромиктических водоемах.
2. Выделение чистых культур аноксигенных фототрофных бактерий и их идентификация с использованием микробиологических и молекулярных методов.
3. Проведение сравнительных сезонных исследований структуры и активности сообществ аноксигенных фототрофных бактерий.
4. Определение эффектов фракционирования стабильных изотопов углерода сообществом аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических озерах различных типов.
5. Изучение особенностей фракционирования стабильных изотопов углерода чистыми и монокультурами аноксигенных фототрофных бактерий в лабораторных условиях.
Научная новизна
Впервые проведены исследования сообществ аноксигенных фототрофных бактерий озер Шира и Шунет (Хакасия), определена их структура и биологическая продуктивность, описаны сезонные изменения, а также проведен филогенетический анализ выделенных аноксигенных фототрофных бактерий. Также впервые проведен филогенетический анализ выделенных аноксигенных фототрофных бактерий из озер Могильное и Гек-Гёль.
Показано, что сообщества аноксигенных фототрофных бактерий, развивающиеся на границе окисленных и восстановленных вод являются динамичными системами, видовой состав которых изменяется в зависимости от сезона.
Из исследованных озер выделено 16 штаммов аноксигенных фототрофных бактерий, 2 из которых являются новыми родами пурпурных несерных бактерий, а 6 - новыми видами уже известных родов аноксигенных фототрофных бактерий.
На примере озер с разной степенью трофии установлено, что измерение изотопного состава органического и минерального углерода дает представление о локализации и масштабах продукции органического вещества сообществом аноксигенных фототрофных бактерий.
В ходе экспериментов с чистыми культурами выделенных аноксигенных, фототрофных бактерий показано, что фотоавтотрофный рост серобактерий сопровождался фракционированием изотопов углерода, представленных величиной Д13С (°/00), которую определяли по разности изотопных характеристик Снсо3" и 5 Сорг. Полученные различия в величинах фракционирования изотопов углерода при фотоавтотрофном росте исследованных культур определяются различиями в путях фиксации углекислоты у пурпурных и зеленых серобактерий, что согласуется с данными предыдущих исследований (Бондарь и др., 1976; Wong, Sackett, 1975; Бондарь и др., 1976; Quandt et al., 1977).
Практическая ценность работы
Исследованные меромиктические водоемы являются уникальными природными экосистемами, требующими бережного отношения. Аноксигенные фототрофные бактерии, развивающиеся в хемоклине меромиктических водоемов, являются естественным биологическим фильтром, препятствующим проникновению сероводорода в верхние слои озер, и тем самым сохраняют баланс между аэробными и анаэробными водами. Проведенные микробиологические и изотопно-геохимические исследования структуры и активности сообществ АФБ позволяют выявить сезонные, физико-химические и другие факторы, определяющие динамику развития и изменчивость аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах. Полученные данные являются необходимой базой для дальнейших мониторинговых исследований этих уникальных экосистем, а также будут необходимы при выработке эффективных мер по сохранению этих природных объектов в случае их деградации.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на: 8-й Международной конференции по соленым озерам (Жемчужный, Хакасия, 2002), на 4-й и 5-й Международных конференциях "Водные экосистемы и организмы" (Москва, 2003, 2004), на Всероссийской конференции "Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем центральной Азии" (Улан-Удэ, 2003); на 2-ом Байкальском микробиологическом Симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007).
Объем работы
Диссертация состоит из введения, литературного обзора и экспериментальной части, включающей главы, заключения и выводов, изложенных на 161 странице печатного текста и включает 32 табицы и 48 рисунков, а также список литературы из 135 наименований, из них 46 на русском и 89 на английском языке.
Место проведения работы
Работа проведена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им С.Н. Виноградского РАН, в лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов.
Благодарности
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. Н.В. Пименову, а также д.б.н., проф. В.М. Горленко, д.б.н. A.M. Зякуну и академику М.В. Иванову за внимание, заинтересованность и неоценимую помощь при проведении работы, при обсуждении результатов и при подготовке рукописи диссертации. Хочется горячо поблагодарить к.б.н. И.А. Брянцеву и Т.С. Прусакову за большое непосредственное участие в ходе работы, д.б.н., проф. В.К. Плакунова за ценную консультацию при подготовке экспериментов по оптимумам роста культур, к.б.н. Е.С. Баринову, к.б.н. Н.Е. Сузину за получение замечательных микрофотографий, к.б.н. В.Н. Акимова за помощь в проведении филогенетических исследований, к.ф-м.н. Д.Ю. Рогозина за помощь в отборе проб, а также сотрудников лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов С.К. Юсупова, Е.Е. Захарову принимавших активное участие на отдельных этапах отбора проб, к.б.н. И.И. Русанова, к.б.н. A.C. Саввичева, к.б.н. A.M. Лысенко и к.б.н. Ю.В. Болтянскую за большую личную поддержку. Искреннюю признательность автор выражает всем сотрудникам лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов за предоставление технической базы, помощь в освоении методик и содействие в процессе работы.
Принятые сокращения и обозначения
АДФ - аденозиндифосфат, АМФ - аденозинмонофосфат АТФ - аденозинтрифосфат, АФБ — аноксигенные фототрофные бактерии, Бхл - бактериохлорофилл(ы), ВЦТК - восстановительный цикл трикарбоновых кислот, ГДФ - гуанозинтрифосфат, ЗБ - зеленые бактерии, ЗСБ - зеленые серобактерии, КоА - коэнзим А, НАД(Ф)/НАД(Ф)Н, АО(Р)Н2] - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный/восстановленный, ОВ - органическое вещество, ПБ - пурпурные бактерии, ПНБ - пурпурные несерные бактерии, ПСБ — пурпурные серобактерии, РБФ(К) - рибулозобифосфат(карбоксилаза), редокс-зона (хемоклин) - зона одновременного присутствия кислорода и сероводорода, РЦ - реакционный центр, СБ - серобактерии, ФБ - фототрофные бактерии, ФдВОсст/ ФДокнсл — Ферредоксин окисленный/восстановленный, ФЕП - фосфоенолпируват, Фн, ФФН - фосфат неорганический, пирофосфат неорганический, ФСА - фотосинтетический аппарат, ФСБ — фототрофные серобактерии, Хл - хлорофилл(ы), ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, ЦТК - цикл трикарбоновых кислот.
