Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современное состояние систематики коринеподобных бактерий 9
IЛ. Понятие о коринеформах 9
1.2. Классификация корине- и нокардиоформ по Берги-8 XI
1.3. Совершенствование родовой структуры кори-неформ в результате использования новых признаков 14
1.3.1. Хемотаксономические признаки 14
1.3.2. Геносистематика 25
1.3.3. Олигонуклеотидный состав рибосомных I6S-FHK 25
1.3.4. Нумерическая таксономия 30
ГЛАВА 2. Экология коринеподобных бактерий 32
2.1. Распространение коринеформ в природе 32
2.2. Физиологические особенности 35
2.2.1. Источники углерода и азота. Факторы роста 35
2.2.2. Коринеформы как представители автохтонной микрофлоры и микрофлоры рассеяния 37
2.3. Выживаемость коринеформ в природе 40
2.4. Перспективы применения принципов эволюционной экологии в микробиологии 46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 51
3.1. Выделение микроорганизмов и формирование рабочей коллекции 51
3.2. Культивирование 51
3.3. Определение параметров роста 53
3.4. Методы определения таксономических признаков 54
3.5. Методы изучения физиологии и метаболизма 59
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЩЕНИЕ
ГЛАВА 4. Таксономические исследования 62
4.1. Идентификация выделенных культур 62
4.2. Изучение таксономических признаков 67
4.2.1. Морфология и тинкториальные свойства 67
4.2.2. Культуральные и физиолого-биохимические свойства 78
4.2.3. Хемотаксономические признаки 80
4.2.4. Нуклеотидный состав ДНК 91
4.3. Обсуждение результатов 91
ГЛАВА 5. Эколого-физиологические особенности водных коринеподобных бактерий 106
5.1. Сезонная динамика коринеформ в пресноводном водоеме (пруде) 106
5.2. Физиологические свойства представителей различных таксономических групп 109
5.3. Особенности роста водных коринеформ на лабораторных средах 112
5.3.1. Периодические культуры Л2
- Понятие о коринеформах
- Распространение коринеформ в природе
- Выделение микроорганизмов и формирование рабочей коллекции
- Идентификация выделенных культур
- Сезонная динамика коринеформ в пресноводном водоеме (пруде)
Введение к работе
Характерной чертой современной микробиологии является возрождение интереса к экологии и систематике микроорганизмов. Это связано с запросами современной биотехнологии, которая ставит перед классической микробиологией такие задачи, как, например, прогнозирование судьбы в экосистеме введенного в нее искусственно созданного штамма, анализ конкурентных отношений в смешанных популяциях, анализ внутрипопуляционных связей в культуре, растущей в ферментере, прогнозирование стабильности различных популяций и т.п. Чтобы ответить на эти вопросы,нужны фундаментальные исследования, которые позволят понять не просто экологические свойства и таксономическое положение микроорганизмов, а более точно установить их положение в природных экосистемах и по возможности адекватно описать координаты занимаемых ими экологических ниш и реализуемую микроорганизмом экологическую тактику.
Настоящая работа посвящена эколого-таксономическому исследованию водных коринеподобных бактерий.
Актуальность проблемы. I. Биология коринеподобных бактерий содержит ряд интересных теоретических и важных практических проблем, имеющих общемикробиологическое значение. Коринеформы широко распространены в самых разнообразных местообитаниях в природе, способны существовать в олиготрофных условиях - в бедных органикой почвах, водоемах и даже в песке пустыни. Эти организмы крайне разнообразны физиологически невероятно, играют существенную роль в природных экосистемах. Можно предполагать, что занимаемые ими экологические ниши также весьма разнообразны; об этом можно судить по тому, что среди коринеподобных бактерий имеются микроорганизмы фитопатогенные, целлюлозоразрушающие, азотфиксиругощие, водородокисляющие автотрофы, метилотрофы, психрофилы и т.д.
По мнению ряда авторов, коринеформы относятся к истинной автохтонной микрофлоре. Многие из них используют широкий набор субстратов, в т.ч. трудноусвояемые вещества - гуматы, хитин, нуклеиновые кислоты, углеводороды, циклические соединения, целлюлозу и т.д., а также способны трансформировать (частично превращать) многие чужеродные соединения, в частности, пестициды.
Таким образом, коринеподобные бактерии обладают огромным метаболическим потенциалом, реализация же этого потенциала зависит от их экологических особенностей.
2. Изучение микрофлоры внутренних водоемов, в особенности прудов и озер, в настоящее время приобрело большую актуальность в связи с проблемой борьбы с загрязнением биосферы отходами незамкнутых промышленных и сельскохозяйственных процессов. Несмотря на развитие т.н. интенсивных методов очистки сточных вод, искусственные очистные сооружения имеются еще далеко не везде и, кроме того, не осуществляют полной переработки отходов. Поэтому основная нагрузка ложится на естественные (экстенсивные) процессы самоочищения биосферы, в которых малые водоемы играют существенную роль. Для повышения эффективности деструкции веществ - загрязнителей микрофлорой естественных водоемов, решения вопроса о введении в экосистему новых микроорганизмов-деструкторов необходимо знание экологических свойств организмов, составляющих естественные природные экосистемы.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы - изучение особенностей биологии коринеподобных бактерий, определяющих экологическую нишу и реализуемую ими экологическую тактику в прес- новодном водоеме.
Основные задачи исследования:
Изучение родового и видового состава коринеформ, входящих в состав сапрофитной микрофлоры старицы р.Оки.
Изучение сезонной динамики представителей отдельных таксономических групп.
Исследование физиологических особенностей водных корине-подобных бактерий, в частности, отношения к источникам углерода -их качеству и количеству, динамики роста культур в лабораторных средах и в условиях, приближающихся к природным.
Изучение активностей ключевых ферментов промежуточного метаболизма и способности к использованию клеточных компонентов (белков, полисахаридов) в олиготрофных условиях.
Научная новизна работы. Впервые исследованы видовой состав и динамика численности отдельных родов и видов коринеподобных бактерий в пресноводном водоеме (пруде). Изучена таксономическая структура коринеформ, уточнены диагнозы входящих в эту группу родов и видов, установлены наборы таксономических признаков, характеризующие представителей родов Rhodococcus, Mycobacterium, Corynebacterium, Arthxobacter, Curtobacterium И Mycoplana. Исследованы динамика непрерывного роста некоторых коринеформ в ферментере, в условиях, приближающихся к естественным, и динамика активностей ключевых ферментов промежуточного метаболизма в олиготрофных условиях. Описаны экологические ниши, занимаемые корине-формами в природных экосистемах, и реализуемые этими организмами экологические тактики. Дано комплексное определение экониши для микроорганизмов, показана корреляция между видовой принадлежно- стью микроорганизма и занимаемой им экологической нишей.
Практическая значимость. Разработана система коринеподоб-ных бактерий, которая может служить целям практической идентификации представителей этой группы. Определены условия, благо- м приятствугощие разложению коринеформ в природных экосистемах, развито представление об г-, К- и L -тактике прокариот, что позволяет прогнозировать поведение определенных групп микроорганизмов, участвующих в круговороте веществ в водоеме, при тех или иных условиях.
Понятие о коринеформах
Коринеподобными бактериями, или коринеформами, называют группу организмов, которых объединяет своеобразная морфология клеток. Общими морфологическими свойствами являются характерная неправильно палочковидная форма, иногда - ветвление, а также плеоморфность, которая выражается в том, что культуры состоят из разных по величине и форме клеток. Коринеформам свойственно прохождение морфологического цикла, т.е. закономерное изменение формы клеток в процессе роста культуры.
Своим названием данная группа обязана роду Corynebacterium Lehmann et Neumann, 1896, который был первоначально создан для возбудителя дифтерии, а затем расширен за счет включения в него множества фитопатогенных и сапрофитных микроорганизмов, достаточно широко распространенных в природе. Помимо рода Corynebacterium, к коринеподобным бактериям обычно относят представителей родов Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas И некоторые другие организмы, которых объединяет своеобразная форма клеток. Наряду с коринеформами выделяют нокардиоформы, к которым относят род Rhodococcus (ранее - значительная часть видов рода Hocardia и группа "Mycobacterium rhodochrous"). Это разделение не всегда оправдывает себя, так как граница между Корине- и нокардиоформами весьма условна. Характерно, что наибольшие трудности вызывает разграничение типичных представителей этих групп - родов Rhodococcus (Nocardia) И Corynebacterium МОЇ Ниже будет показано, что по ряду таксономически значимых свойств эти два рода гораздо ближе друг другу, чем остальным родам, входящим в группу коринеформ.
В течение продолжительного времени в нашей стране была принята система микроорганизмов, предложенная Н.А.Красильниковым [41J, который объединил все известные к тому времени организмы, Сходные С МИКОбактериями И коринебактериями, В род Mycobacterium и, частично, Paeudobacterium, а позднее [42J перенес часть ВИДОВ микобактерий в род Proactinomyces (Nocardia Waksman, Henrichi, 1943). Несмотря на определенные недостатки названной системы, построенной преимущественно на результатах изучения традиционных морфологических и физиологических свойств, она служила удобным руководством при идентификации культур благодаря достаточно четким диагнозам отдельных родов и видов и,кроме того, содержала в своей основе плодотворную идею о таксономическом и филогенетическом единстве большой группы организмов, которые зарубежные авторы помещали в 7 родов четырех семейств, двух порядков. Однако, все более глубокое и всесторонее изучение кори-неподобных бактерий показало, что система Н.А.Красильникова не отражает их многообразия, и потребовало пересмотра классификации.
Распространение коринеформ в природе
Коринеподобные бактерии широко распространены в природе. В самом деле, трудно назвать такие источники, в которых эти организмы не были обнаружены. Однако, данные об их численности и динамике в различных местообитаниях довольно ограниченны, что обусловлено трудностями их идентификации и количественного учета. Анализ литературных данных о нахождении коринеформ в разнообразных природных средах позволяет видеть, что в этой группе микроорганизмов отчетливо выделяются несколько экологических типов. Прежде всего это группа видов рода Corynebacterium, патогенных для человека и животных (группа I по Берги -8). В эту группу входят не только виды, приспособленные к облигатному паразитизму [82, 83, 273J, но также условно патогенные и комменсалы, обитающие в кишечном тракте, ротовой полости и на кожных покровах млекопитающих, включая продуцентов аминокислот и нук-леотидов Гб5, 86, 127, 206 J и род Bacterionema [86, 114 J . Вместе с тем, имеются данные о выделении представителей Corynebacterium sensu stricto из морской воды и морских рыб [85J. Среди коринеподобных бактерий обнаружено также множество видов, патогенных для растений, и близких к ним сапрофитов (гр. II и III по Берги-8), ранее их относили к роду Corynebacterium, в настоящее время многие из них известны как виды рода Curtobacterium). Эти организмы выделяются, как правило, из растительных объектов [83, 222] и почвы [3, 9, 83, 87J , имеются немногочисленные сообщения о выделении их из воды Г 321 и атмосферного воздуха [212]7 Breuilland et al., 1974 - ЦИТ. ПО Гзз] .
Представители рода Mycobacterium sensu stricto широко распространены не только в организме человека, других млекопитающих и птиц [26, 28, 62, 83L но также в организме рыб, амби-бий, рептилий n4j, птичьих клещей Гб] , почве [26, II4J, пресной и морской воде [26, 98J . Тем не менее, в настоящее время принято считать, что все кислотоустойчивые микобактерии независимо от источника выделения условно патогенны [26 I . Представители всех остальных родов коринеформ - Cellulomonas, Brevi-bacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Rhodococcus - относятся к сапрофитам, однако, их экологическое положение крайне разнообразно.
Выделение микроорганизмов и формирование рабочей коллекции
Объектами исследования служили 58 штаммов микроорганизмов, выделенные в разные периоды из воды старицы р. Оки и предварительно отобранные на основе изучения морфологических свойств.
Микроорганизмы выделяли из воды и ила высевом на чашки с МПА и МЇЇА, разведенным в 10 раз. Все колонии, выросшие на этих средах из третьего или четвертого разведения, просматривали под микроскопом. Из идентичных по культуральным и морфологическим признакам организмов оставляли по одному представителю для идентификации по определителям Берги-7 [82 J и Берги-8 [83] и более детальных таксономических исследований. На основании этих данных осуществляли подсчет колоний разных видов и определяли их процентное содержание от общего числа сапрофитов.
В сравнительных систематических исследованиях были использованы также 16 культур, выделенных из почвы, 4 - из навоза растительноядных животных, 7-е поверхности травянистых растений, 8 -из воздуха и 27 штаммов, полученных из различных коллекций культур микроорганизмов (табл.1).
Идентификация выделенных культур
.На первом этапе работы нами была сделана попытка идентифицировать штаммы, выделенные из природных источников, используя имеющиеся в распоряжении определители [82, 83J, а также работы отдельных авторов [101, 133J.
Результаты идентификации приведены в табл.2 с указанием источника выделения каждой культуры. В этой же таблице (в алфавитном порядке) представлены коллекционные штаммы, использованные в работе, с сохранением за ними тех названий, под которыми они были получены, и коллекционных номеров.
Как видно из таблицы, группа исследуемых организмов включала, согласно первичной идентификации, представителей родов Arth robacter, Brevibacterium, Cellulomonas,Corynebacterium, Mycobacterium u Rhodococcus.
Следует отметить, что определение культур по вышеназванным руководствам в большинстве случаев представляло значительные трудности в связи с отсутствием достаточно четких наборов диагностических признаков, характерных для каждого вида и даже рода и отличающих его от других видов (родов). В особенности это относится к определителю Берги-8, с помощью которого можно идентифицировать некоторые организмы лишь приблизительно, тогда как определение большинства культур по этому руководству вообще не представляется возможным, в связи с чем нам пришлось использовать также издание 1957 года, несмотря на более позднее признание многих приведенных в нем родов и видов genera et species
Сезонная динамика коринеформ в пресноводном водоеме (пруде)
В течение весенне-летнего сезона при колебании общей численности сапрофитов в пределах 0,01-1,1 (при высевах на МПА) и 0,04-1,8 (на МПА/Ю) млн. клеток в I мл воды численность коринеформ составляла в разные периоды сезона от 0,002 до 0,6 млн/мл, равномерно возрастая к середине лета. Как видно из рис. 10а, на фоне колебаний численности основных групп аэробных гетеротрофных бактерий, численность коринеформ в целом поддерживалась на низком уровне, близком, однако, к постоянному. Тем не менее, в пределах этой группы наблюдалась выраженная сукцессия форм (рис. 106): содержание родококков в I мл воды по абсолютной величине было максимальным в конце мая - начале июня; артро-бактеров - в середине июня, тогда как количество куртобактерий равномерно возрастало с конца мая, достигало максимума в июле и резко снижалось к середине августа.
Несколько иная картина наблюдалась при анализе колебаний численности отдельных родов и видов по сравнению с общим количеством сапрофитов. Этот анализ показал, что родовой и видовой состав коринеподобных бактерий существенно менялся в течение сезона (табл.5). В первой половине мая для водной микрофлоры были характерны вполне определенные виды коринеформ, среди которых преобладали артробактеры ( A.citeus, A.globiformis и A.pascens ), несколько меньше было Rhodococcus erythropolis, единичные колонии относились к Mycoplana sp. и R. maris
