Содержание к диссертации
Введение
1.1. Распространение и экология фагов клубеньковых бактерий 9
1.1.1. Экология ризобиофагов 9
1.1.2. Лизогения у клубеньковых бактерий 11
1.1.3. Дефектные фаги 16
1.2. Специфичность литического действия бактериофагов Rhizobium. ..,.....,........»,., 19
1.3. Морфология частиц ризобиофагов и их физико-химические свойства 26
1.4. Фаги Rhizobium в генетических исследованиях .... 31
1.4.1. Общая трансдукция у клубеньковых бактерий. Картирование хромосомы бактерии-хозяина ... 32
1.4.2. Специализированная трансдукция у клубеньковых бактерий. Картирование фагового генома. 38
1.5. Симбиотические свойства фагоустойчивых мутантов. . . 44
1.6. Влияние бактериофагов на формирование симбиотических взаимоотношений Rhizobium -бобовое растение. .... 47
Заключение 50
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДО ИССЛЕДОВАНИЯ 53
2.1. Штаммы 53
2.2. Условные обозначения ......... 57
2.3. Среды, использованные в работе 57
2.4. Методы 61
Глава 3. СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ 69
3.1. Выделение фагов и изучение их литической активности . 69
3.2. Фаготипирование мутантов клубеньковых бактерий
люцерны . . 76
3.3. Обсуждение результатов 82
Глава 4. ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ R.MELILOTI-БОБОВОЕ РАСТЕНИЕ 89
4.1. Влияние лизогенизации на характер симбиотических свойств у клубеньковых бактерий люцерны . ...... 89
4.2. Свободный фаг и его роль в конкурентной способности штаммов клубеньковых бактерий люцерны 98
4.3. Обсуждение результатов. 101
Глава 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСЛИРУЮЩИХ ФАГОВ Rhizobium meliloti 106
5.1. Выделение трансдуцирующих фагов клубеньковых бактерий люцерны. 106
5.2. Свойства транслирующих бактериофагов. ....... 109
5.3. Трансдукпия маркеров устойчивости к антибиотикам и способности к синтезу метаболитов ......... 113
5.4. Обсуждение результатов 121
Глава 6. «БИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРОТОТРОФШХ ТРАНСДУКТАНТОВ 125
6.1. Оценка симбиотических свойств трансдуктантов в условиях микровегетационного опыта 125
6.2. Изучение стабильности наследования симбиотических признаков у прототрофных трансдуктантов 137
6.3. Анализ симбиотических свойств трансдуктантов
в условиях вегетационного опыта 141
6.4. Обсуждение результатов. 143
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. І5Ї
ВЫВОДИ. . 155
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 157
- Распространение и экология фагов клубеньковых бактерий
- Штаммы
- Выделение фагов и изучение их литической активности
- Влияние лизогенизации на характер симбиотических свойств у клубеньковых бактерий люцерны .
- Выделение трансдуцирующих фагов клубеньковых бактерий люцерны.
Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышение роли "биологического азота" в земледелии является одной из важнейших задач сельскохозяйственной микробиологии. Наиболее активными микроорганизмами-азот-фиксаторами являются клубеньковые бактерии (род Rhizobium), осуществляющие фиксацию азота в симбиозе с бобовыми растениями. На основе клубеньковых бактерий производят препарат нитрагин (ризо-торфин). Для изготовления препарата используют активные штаммы клубеньковых бактерий. Нитрагинизация семян перед посевом способствует увеличению урожая бобовых культур, улучшению его качества, повышению плодородия почвы (Доросинский, 1970; Мишустин, Шильникова, 1973). Известно, что помимо особенностей макро- и микросимбионта, взаимоотношения бобовых растений с клубеньковыми бактериями зависят от множества различных факторов, среди которых важную роль играют бактериофаги. Фаги клубеньковых бактерий широко распространены в природе. Наиболее высок их титр в тех почвах, в которых содержится много клубеньковых бактерий. Известно также,
ЧТО бОЛЫШНСТВО ШТаММОВ Rhizobium Несут ПрофаГИ, Причем ПрирОД- ные культуры клубеньковых бактерий часто являются полилизогенны-ми. Фаги оказывают влияние на многие свойства клубеньковых бактерий, в том числе и на их симбиотические признаки. С одной стороны, свободный фаг в прикорневой зоне растений может снижать численность фагочувствительннх штаммов, что наобходимо иметь в виду при селекции новых высокоактивных и конкурентоспособных штаммов. С ДРУГОЙ СТОРОНЫ, фаГИ Rhizobium ЯВЛЯЮТСЯ факторами ИЗМЄНЧИ- вости бактерий, однако, их роль в изменчивости симбиотических признаков исследована недостаточно. Кроме того, на основе бакте- риофагов клубеньковых бактерий могут быть созданы векторы для клонирования генов, контролирующих симбиотическую азотфиксацию, что позволит использовать методы генной инженерии в селекции. Однако, в целом, влияние бактериофагов на формирование симбиоти-ческих взаимоотношений между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями практически не исследовано. Не изучена и возможность их использования в селекции высокоэффективных и конкурентоспособных штаммов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния бактериофагов Rhizobium (на примере клубеньковых бактерий люцерны) на формирование симбиотических взаимоотношений между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями. В нашу задачу входило: создать коллекцию бактериофагов клубеньковых бактерий люцерны различного происхождения и охарактеризовать их литическую активность; исследовать связь между симбиотическими и культуральными свойствами мутантов клубеньковых бактерий и их чувствительностью к бактериофагам; изучить влияние лизогенизации на аимбиотические свойства клубеньковых бактерий; оценить роль фага в конкурентной способности штаммов клубеньковых бактерий; осуществить поиск фагов клубеньковых бактерий люцерны, способных переносить наследственный материал бактерии-хозяина, и изучить их свойства; с помощью трансдукции провести генетический анализ мутантов, утративших способность к симбиотической азотфиксации; изучить возможность использования трансдукции в селекции высокоактивных штаммов клубеньковых бактерий.
Научная новизна, В работе впервые показано, что: фаги, выделенные из почвы, обладают более широким спектром литической активности по отношению к штаммам клубеньковых бактерий люцерны чем фаги, индуцированные из лизогенных культур; экспериментальная лизогенизация нелизогенных штаммов клубеньковых бактерий может вызывать снижение их симбиотической эффективности и азотфиксирующей активности по сравнению с исходным штаммом; свободный фаг, присутствующий в прикорневой зоне бобовых растений, резко снижает конкурентоспособность фагочувствитель-ных штаммов, при этом конкурентоспособность устойчивых к данному фагу вариантов значительно возрастает; среди новых трансдупирующих бактериофагов имеются фаги, осуществляющие трансдукцию маркеров с высокой частотой - до 6-ІСГ4; - с помощью трансдукции можно получать штаммы клубеньковых бактерий, обладающие повышенной азотфиксирующей активностью и симбиотической эффекзлшностью.
Практическая ценность» Создана коллекция из 89 бактериофагов клубеньковых бактерий люцерны. Она может быть использована для фаготипирования и быстрой идентификации штаммов Rhizobium. Выделенные фаги можно использовать для изучения лизогении у клубеньковых бактерий, для проведения генетического анализа мутантов Rhizobium, для картирования бактериальной хромосомы и т.д. На основе охарактеризованных бактериофагов могут быть созданы векторы для клонирования и переноса генов, ответственных за симбиотическую азотфиксацию. В результате изучения симбиотиче-ских свойств полученных трансдуктантов, проведенного в условиях микровегетационных и вегетащонных опытов, показано, что транс-дукция может быть использована в селекщи высокоактивных штаммов клубеньковых бактерий.
Распространение и экология фагов клубеньковых бактерий
Распространение бактериофагов клубеньковых бактерий в природе и основные источники их выделения изучались многими исследователями. Наиболее богаты фагами почвы, на которых в течение ряда лет выращивали бобовые растения. Максимальная плотность фаговых частиц была отмечена в прикорневой зоне. С удалением от корней на 30-50 см плотность заметно снижалась (Demoion, Dunez, 1935; Vandecaveye, Katznelson, 1936; Katznelson, Wilson, 1941; Доросин-ский, 1941). По всей вероятности, фаги являются обязательным компонентом почвенной микрофлоры бобовых. Так, например, фаги R.tri-folii были изолированы из 10 различных почв, на которых произрастал клевер, причем особенно богата фагами оказалась почва столетней клеверной поляны (Kieczkowska, 1957). Почвы, на которых возделываются небобовые растения, как правило, характеризуются отсутствием специфических бактериофагов (Kieczkowska, 1957). Изучение распространения фаГОВ R.leguminosarum И R.species В ПОЧВаХ
Индии показало, что во всех почвенных образцах, взятых с 30 полей из-под посевов бобовых, присутствуют активные бактериофаги, лидирующие хотя бы I из 60 тестированных штаммов клубеньковых бактерий (шаг et ai., 1979). Однако, исследователям не всегда удается выделить фаги клубеньковых бактерий из почвенных образцов. В частности, среди 14 образцов, взятых с люцерновых полей, фаги были выделены только из 8 (Golebiowska et al., 1976). По мнению Маннингера (Manninger, 1978), неудача в выделении ризобио-фагов с полей бобовых культур объясняется, вероятнее всего, недостаточным набором используемых штаммов клубеньковых бактерий. Этот вывод был сделан на основе анализа более чем 1500 почвенных образцов, взятых из-под посевов вики, фасоли, клевера, сои, люцерны,люпина и других бобовых.
Штаммы
Основным объектом наших исследований были штаммы клубеньковых бактерий люцерны Rhizobium meiiioti, а также клубеньковые бактерии других видов из музея типовых культур ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (табл.4). Кроме того, на чувствительность к бактериофагам, специфичным для клубеньковых бактерий люцерны, были исследованы 3 штамма Agrobacterium radiobacter и 9 штаммов Azotobacter. Номера культур:
Agr.radiobacter - 5/247, 7/777, 57/136
Azotobacter vinelandii - I/I5, 87/11
Az.chroococcum - 47/7, 67/A-240
Az.beijerinclm - 81/Э1, 84/Hp
Az.agile - 2/21
Az.indicrai - 76/ATCC-9037-YM-1172, 77/JP0-3745.
Для фаготипирования и проведения трансдукции была использована обширная коллекция мутантов R.meiiioti, полученных в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Среди них были мутанты, имеющие дефект, в синтезе метаболитов (табл.5), прототрофные мутанты по симбиоти-ческим свойствам (табл.6), а также штаммы, неспособные к слизе-образованшо на твёрдой питательной среде (номера мутантов -CXMI-30, 31, 32, 33; Федоров, 1983). Кроме того, для фаготипирования были использованы 40 трансконъюгантов, полученных Черновой Т.А. после введения плазмиды R68.45 из вирулентного штамма
Эти трансконъюганты различались по вирулентности и уровню слизеобразования (Чернова, 1982; Аронштам и др., 1983а, 19836). В качестве штаммов-доноров в экспериментах по трансдукпии использовали стрептомицин- и ри-фамшпинустойчивые мутанты, полученные у штаммов "дикого типа" L5-30 и 425а, а также прототрофные ревертанты, возникшие у штамма MI-I2, ауксотрофного по изолейцинвалину (табл.7). Симбиотиче-ские свойства донорных и реципиентных штаммов представлены в табл.8.
Для изучения влияния фага на конкурентоспособность штаммов R.meiiioti совместно с Федоровым С.Н. у штамма CXMI был получен мутант СЖС-ІІ8, устойчивый к стрептомицину и фагу Нт1б и не отличающийся от штамма СЖІ по своим симбиотическим свойствам. В качестве фагочувствительных вариантов в этих опытах использовали штаммы СХМІ-І27, устойчивый к стрептомицину и рифампипину и М57 (рифампицинустойчивый мутант штамма L5-30).
Выделение фагов и изучение их литической активности
Свободные фаги клубеньковых бактерий широко распространены в почвах под посевами бобовых растений. Чувствительность штаммов Rhizobium, вносимых с препаратом, к фагам, свободно присутствующим в почве, в значительной степени может определять жизнеспособность селекционных штаммов клубеньковых бактерий. С другой стороны,известно, что большинство,культур R.meiiioti являются лизоген-ными (Маранц и др., 1973а), следовательно, с препаратом в почву могут попадать бактериофаги, освобождаемые лизогенными штаммами при производстве ризоторфина. Таким образом, встает вопрос о широте спектра литического действия фагов клубеньковых бактерий люцерны, свободно присутствующих в почве, и фагов, выделяемых из лизогенных штаммов, в отношении культур клубеньковых бактерий.
Фаги из почвы и из лизогенных штаммов выделяли, используя индикаторный штамм L5-30 R.meiiioti, который свободен от профага (Kowaiski, 1965). Для выделения бактериофагов из почвы было использовано 22 различных образца почвы, взятых в весенне-летний период из-под посевов люцерны и донника в различных районах страны (табл.9). Из 22 исследованных образцов фаги, лизирующие штамм L5-30, обнаружены только в 15. Тот факт, что в семи образцах мы не выявили бактериофагов, лизирующих штамм L5-30, не является доказательством их отсутствия в данных почвах. Скорее всего, их можно было бы выделить, используя дополнительные индикаторные культуры R.meiiioti. После процедуры обогащения с использованием штамма L5-30 титр фага в супернатанте варьировал от 10 до 10 БОЕ/мл. При титровании бактериофагов двуслойным методом на штамме L5 30 было обнаружено большое разнообразие морфологических типов негативных колоний. Маранц с соавт. (19736) были описаны 4 основных типа негативных колоний (рис.2, а-г):
а) мелкие, почти точечные, прозрачные;
б) прозрачные колонии с четкими краями, диаметром 1,5-2 мм;
в) колонии диаметром 2,5-3 мм с точечным прозрачным центром, окруженным зоной неполного лизиса;
г) колонии по типу (в), но центральная зона крупнее - до 1,5мм.
Мы обнаружили дополнительные типы (рис.2, д-ж): д) прозрачные колонии с четкими краями диаметром 3-5 мм;
е) крупные мутные колонии диаметром около 5 мм с расплывчаты ми краями;
ж) крупные негативные колонии диаметром 5 мм с большим мутным центром, окруженным узким прозрачным ободком.
У фагов, образующих крупные прозрачные негативные колонии на газоне чувствительного штамма, в центре бляшки нередко формируются зоны вторичного роста культуры в виде отдельных мелких клонов (рис.2д).
title4 ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ R.MELILOTI-БОБОВОЕ РАСТЕНИЕ title4
Влияние лизогенизации на характер симбиотических свойств у клубеньковых бактерий люцерны
Фаги клубеньковых бактерий встречаются в природе в двух формах: в виде свободного фага и в форме профага. Мы решили исследовать влияние бактериофагов R.meiiioti, находящихся в различных состояниях,на формирование симбиоза между R.meiiioti и растениями люцерны.
Известно, что большинство природных культур клубеньковых бактерий являются лизогенными. К сожалению, практически не исследованы вопросы влияния лизогенизапии на проявление симбиотических свойств у лизогенных штаммов по сравнению с нелизогенными. Мы предприняли попытку экспериментального получения лизогенных штаммов с помощью умеренных бактериофагов у свободных от профага мутантов R.meiiioti и изучения симбиотических свойств полученных вариантов.
Для лизогенизапии использовали экспериментально делизогенизи-рованный штамм L5-30 R.meiiioti (Kowaiski, 1965), и два его мутанта, М5 и M3I (табл.5, 8). Лизогенизировали не сам штамм L5-30, а его вариант ДІ, маркированный устойчивостями к рифампицину и стрептомицину. Мы выбрали три умеренных бактериофага Rmi, Rm2 и Rm3, образующих мутные негативные колонии на газоне чувствительного штамма (см. главу 5). Во избежание трансдукции обработку культур проводили лизатами фагов, размноженных на тех же штаммах, которые подвергались лизогенизапии. Лизогенные клоны отбирали из центра зоны лизиса, возникшей на газоне исследуемого штамма после нанесения капель фаголизата.
Всего мы получили 36 лизогенных культур (по 12 у каждого исследуемого штамма). лизогенные варианты сохранили морфологию колонии и маркеры исходных мутантов. Все культуры были иммунны к своему фагу и освобождали его как спонтанно, так и после индукции УФ-излучением, причем в последнем случае титр фага возрастал, как правило, на 1-2 порядка. Полученные результаты свидетельствуют о том, что мы действительно получили лизогенные варианты. Культу-ральные свойства лизогенных клонов представлены в табл.15 (даны средние значения по 2-3 повторностям).
Мы исследовали симбиотические свойства полученных вариантов. Следует особо отметить тот факт, что все три штамма, послужившие исходными для получения лизогенных клонов, различались по своим симбиотическим характеристикам (табл.8). Штамм ДІ не отличался достоверно от контрольного штамма "дикого типа" CXMI. Штамм M3I не обладал ацетиленредуктазной активностью, и, соответственно, масса растений, инокулированных этим штаммом, оставалась на уровне контроля без инокуляции. Кроме того, у этого мутанта был нарушен процесс клубенькообразования, в результате чего на растениях образовывалось меньшее количество клубеньков, а те, которые появлялись, имели дефектную форму. Штамм М5 обладал достоверно сниженной азотфиксирующей активностью. Инокулированные им растения незначительно отличались по массе от контрольных растений без инокуляции.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСЛИРУЮЩИХ ФАГОВ Rhizobium meliloti
Выделение трансдуцирующих фагов клубеньковых бактерий люцерны
Клубеньковые бактерии начали выступать как объект усиленных генетических исследований сравнительно недавно, несмотря на то, что они вызывают большой практический интерес в связи с их способностью к высокоэффективной симбиотической азотфиксапии. Для создания высокоактивных и конкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий необходимо не только получать новые формы под действием мутагенных факторов, но также и использовать методы гибридизации, позволяющие комбинировать полезные признаки в одном штамме. Одним из таких способов является трансдукция.
Известно, что штаммы R.meiiioti представляют собой обширную группу бактерий, характеризующихся различной фагочувствительно-стью (Lesley, 1981). Описанные до настоящего времени трансдуци-рующие фаги R.meiiioti обладают способностью лизировать ограниченное количество лабораторных штаммов, поэтому мы предприняли попытку выделить поливалентные трансдуцируюшие фаги для штаммов R.meiiioti 05-30 и CXMI. Доля фагов, способных осуществлять трансдукцию, невелика: среди 26 бактериофагов, выделенных из почвы и лизирующих штаммы R.ieguminosarum, обнаружено только 2 трансдупирующих фага (Buchanan-Wollaston, 1979).
Мы решили исследовать на трансдуцируюшие свойства коллекцию из 66 бактериофагов клубеньковых бактерий люцерны, выделенных -нами из почвы и из лизогенных штаммов. В качестве маркера, по которому велась селекция, была использована мутация потребности в пантотеновой кислоте (табл.5). Штаммом-донором в наших опытах служил прототрофный штамм L5-30 R.meiiioti. Частота ревертирования от рап к Рап+ у штамма M3I достаточно низка (10 ), следовательно, появление црототрофных колоний у штамма-реципиента после обработки его тестируемым бактериофагом могло свидетельствовать в пользу того, что произошел перенос маркера рап 31+ из штамма L5 30 в штамм M3I в результате трансдукнии.
Мы обнаружили, что среди 60 бактериофагов, выделенных из почвы, 8 фагов индуцировали появление црототрофных колоний (табл.22). Среди них 5 фагов переносили маркер рап«31+ с низкой частотой, и 3 бактериофага переносили этот маркер с частотой, превосходящей частоту спонтанного ревертирования более чем на два порядка. Для дальнейшего изучения были отобраны только те бактериофаги, которые осуществляли перенос рап-31+ с наиболее высокой частотой.
Появление црототрофных колоний, могло быть, однако, обусловлено генетической трансформацией, поскольку, как известно, в фаго-лизатах присутствует достаточное количество ДНК, освободившейся из лизировавшихся клеток. Для того, чтобы исключить эту возможность, мы обработали фаголизаты ДНКазой, разрушающей ДНК, и, таким образом, снимающей ее трансформирующую активность (Raina, Modi, 1972). Оказалось, что обработка фаголизатов ДНКазой не влияет на частоту возникновения црототрофных колоний (табл.23). Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансформация не является причиной возникновения Рал+ клонов.
