Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Микробиота желудочно-кишечного тракта человека в норме и патологии 12
1.2. Функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта 16
1.3. Кишечник и иммунитет 24
1.4. Роль кишечной палочки в норме и патологии у детей, характеристика ее антигенной структуры и основных факторов патогенности 32
Глава 2. Материалы и методы исследований 49
2.1. Объекты исследований 49
2.2. Методы исследований 51
2.2.1. Микробиологические исследования 51
2.2.2. Молекулярно-генетические исследования 54
2.2.3. Статистические методы 57
Глава 3. Характеристика кишечного микробиоценоза у детей разного возраста, проживающих в г. Иркутске 58
3.1. Микроэкологическая характеристика интестинального биоценоза детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта 58
Глава 4. Молекулярно-генетическая характеристика факторов патогенности Escherichia coli, выделенных из кишечника здоровых детей и детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта 68
4.1. Обнаружение генетических детерминант токсинообразования у штаммов Escherichia coli, выделенных от детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта 69
4.2. Определение частоты встречаемости генов, кодирующих способность к формированию связывания пилей и синтез адгезина интимина у аутоштаммов Escherichia coli 75
4.3. Характеристика комплекса генетических маркеров факторов патогенности в штаммах Escherichia coli, выделенных из кишечника детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта 77
Глава 5. Обсуждение результатов 90
Выводы 101
Список использованных источников 104
- Функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта
- Роль кишечной палочки в норме и патологии у детей, характеристика ее антигенной структуры и основных факторов патогенности
- Микроэкологическая характеристика интестинального биоценоза детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта
- Определение частоты встречаемости генов, кодирующих способность к формированию связывания пилей и синтез адгезина интимина у аутоштаммов Escherichia coli
Введение к работе
Актуальность проблемы
Международные исследования микробиома человека, позволили пролить свет на огромную роль микробиоты человека в сохранении физиологического здоровья и тесной взаимосвязи его дисбиотических состояний со множеством заболеваний макроорганизма (Arumugam M. et al., 2011; Qin J. et al., 2010). В микробиоме человека наиболее представительна микробиота желудочно-кишечного тракта, в структуре патологии которого значительное место в детском возрасте занимают функциональные нарушения (Хавкин А.И., 2001; Tyler A.D. et al., 2013). В нормальных физиологических условиях макроорганизм и его микробиота представляют собой сложный, многофункциональный, динамический, равноправный симбиоз (эубиоз) (Ефимов Б.А. и др., 2002; Войда Ю.В. и др., 2012). При превышении пороговой величины отрицательно воздействующих на организм экзогенных и эндогенных факторов микробиоценозы выходят из состояния равновесия, что проявляется не только микроэкологическими или иммунными нарушениями, но и огромным спектром заболеваний, сопряженных с нарушением микроэкологического гомеостаза (Abbasian F. et al., 2013). Иммунная система детей играет решающую роль в этих процессах как мощный защитный барьер и регулятор патологических состояний организма, а возрастная структура детей характеризуется некоторыми особенностями развития иммунитета. Для понимания функциональных возможностей иммунитета растущего организма важно знать физиологию его становления, которая определяется наличием пяти критических периодов развития (Стефани Д.В. и др., 1977; Хаитов Р.М., 2001; Леванова Л.А. и др., 2003; Никулин Б.А., 2007; Щеплягина Л.А. и др., 2009). Немногочисленные исследования свидетельствуют о том, что для каждого периода развития иммунной системы детей характерен своеобразный состав микробиоты кишечника (Леванова Л.А. и др., 2003; Спирюкова У.А., 2010; Куандыкова А.К. и др., 2010). Поэтому вопросы профилактики дисбиотических расстройств вызывают возрастающий интерес, поскольку поддержание на физиологическом уровне нормальной микробиоты человека предупреждает как развитие дисбиозов, так и многих других заболеваний, развивающихся и углубляющихся на их фоне (Янковский Д.С. и др., 2010).
Любые нарушения приводят к доминированию в биотопе потенциально опасных микроорганизмов, усилению генетического обмена и формированию клонов, несущих геномные «острова» патогенности, а также множественную лекарственную устойчивость микроорганизмов (Янковский Д.С. и др., 2010).
Escherichia coli, являясь постоянным обитателем кишечника человека, выполняет ряд полезных для хозяина функций – синтезирует витамины и аминокислоты, поддерживает колонизационную резистентность кишечника, обеспечивает антигенную стимуляцию местного иммунитета (Тюрин Ю.А. и др., 2002). Между тем, при нарушениях микроэкологического характера E.coli способна резко наращивать не только свое количественное присутствие, но и проявлять патогенные свойства, что играет важную роль в патогенезе развития дисбиоза кишечника. Постоянный антигенный дрейф, наличие или приобретение различных факторов патогенности (токсины, гемолизины, некротизирующий и гемолитический факторы, сидерофоры) затрудняют проведение эффективной специфической профилактики эшерихиоза, что побуждает не только постоянно осуществлять мониторинг данной инфекции, но изучать и контролировать биологические свойства возбудителя, прежде всего, его антибиотикорезистентность и наличие различных маркеров патогенности (Мамбетова Э.Ф., 2007; Лайман Е.Ф. и др., 2012). Наличие подобных свойств повышает патогенный потенциал микробов, придавая им высокую экологическую пластичность и способность активно участвовать в воспалительном процессе (Малов В.А. и др., 2005; Гриценко В.А. и др., 2000).
Особого внимания заслуживают кишечные (диарейные) заболевания, обусловленные штаммами E.coli, продуцирующими Shiga-подобный токсин. Вызываемые шигатоксигенным типом вспышки происходят все чаще, последняя из них (май-июнь 2011 г. в Германии)
охватила свыше 4000 человек, у 25% из которых диарея сопровождалась развитием гемолитико-уремического синдрома. Заболевание завершилось летальным исходом в 39 случаях (возбудитель серотип О104:Н4) (Кафтырева Л.А. и др., 2011; Brzuszkiewicz E. et al., 2011; Corogeanu D. et al., 2012).
Цель работы. Изучить динамику формирования патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов кишечного микробиоценоза для оценки риска развития воспалительных процессов у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Дать микробиологическую характеристику кишечного биоценоза и изучить ассоциативные взаимоотношения симбионтов толстой кишки у детей разного возраста с ФН ЖКТ.
-
Установить наличие и частоту встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности у аутоштаммов Escherichia coli, выделенных при ФН ЖКТ у детей разных возрастных групп.
-
Определить характер взаимосвязи между наличием патогенного потенциала изученных культур индигенной Escherichia coli с сопутствующей кишечной микробиотой.
Научная новизна работы
Впервые показано, что аутоштаммы E.coli с нормальной ферментативной активностью, выделенные от детей с ФН ЖКТ, несут фрагменты ДНК «островов» патогенности, гомологичные известным генам кластеров патогенности Escherichia coli и характерным для диареегенных штаммов (энтеропатогенных, энтерогемморагических E.coli).
Регистрация генетических детерминант патогенности в аутоштаммах индигенных эшерихий в сочетании с сопутствующей потенциально-патогенной микробиотой дают основание для дальнейшего изучения вопросов, связанных с внутривидовой пластичностью и эволюцией E.coli.
Практическая значимость работы обоснована научной новизной проведенных исследований.
Полученные в работе данные расширяют и углубляют представления о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание микросимбиоценозов кишечника, что позволит оптимизировать диагностику, профилактику и коррекцию патомикробиоценозов.
Использование метода ПЦР для детекции факторов патогенности в аутоштаммах индигенной E.coli целесообразно для получения объективной информации о локальной циркуляции аутоштаммов E.coli с наличием детерминант патогенности.
Полученные новые данные используются в учебном процессе на кафедре эпидемиологии и микробиологии ГБОУ ДПО ИГМАПО МЗ РФ, физико-химической биологии ФГБОУ ВПО ИГУ.
Положения, выносимые на защиту:
-
Развитие микроэкологических нарушений в кишечном биотопе у детей с ФН ЖКТ характеризуется снижением доминирования и значимости индигенной симбиотической биоты, что сопровождается нарушением контроля за составом условно-патогенных видов.
-
Штаммы E.coli разных фенотипических групп (вариантов), выделенные от детей с ФН ЖКТ, являются резервуаром генетических детерминант факторов патогенности, обеспечивающих главным образом колонизацию (закрепление) микроорганизмов и синтез шига-подобных токсинов.
-
Потенциал факторов патогенности в составе популяций E.coli формируется у детей с ФН ЖКТ чаще при дисбиотических нарушениях, нежели при эубиозе.
Апробация диссертационных материалов проведена на разных уровнях. Фрагменты диссертации были представлены на 3-х международных конференциях, на 9 форумах регионального и межрегионального значения. В их числе: Ежегодная научно-теоретическая конференция аспирантов и студентов Иркутского государственного университета (г.
Иркутск, 2009); Научно-практическая конференция «Экспериментальные подходы в решении медико-биологических проблем» (г. Иркутск, 2011); II Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (г. Иркутск, 2011); IX Научно-практическая конференция молодых ученых, посвященная 35-летнему юбилею Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (г. Красноярск, 2011); Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Экологические и медицинские проблемы Сибири» (г. Ангарск, 2012); Научно-практическая конференция молодых ученых «Диагностика, профилактика и надзор за природно-очаговыми и другими инфекционными болезнями» (г. Иркутск, 2013); 80-ая Юбилейная Всероссийская Байкальская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины» (г. Иркутск, 2013); Международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (г. Санкт-Петербург, 2013); Юбилейная научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 90-летию организации кафедры инфекционных болезней «Актуальные проблемы современной инфектологии» (г. Иркутск, 2013); Научно-практическая конференция педиатров «Актуальные проблемы детской инфектологии (г. Иркутск, 2013); III Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (г. Иркутск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 8 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами, 20 рисунками. Библиографический указатель включает 147 наименований отечественных и 77 зарубежных источников литературы.
Функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта
Функциональные нарушения (ФН) желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) занимают одно из ведущих мест в структуре патологии органов пищеварения (Хавкин А.И. и др., 2006). В клинической практике врача-гастроэнтеролога данные нарушения функции кишечника встречаются часто (Сергиенко Е.И., 2009), особенно у детей. Но наиболее часто они встречаются в первый год жизни ребенка (Самсыгина Г.А., 2000; Беляева И.А. и др., 2006; Белоусов Ю.В., 2007; Анастасевич Л.А., 2008).
Учитывая анатомо-физиологические особенности ребенка, можно с уверенностью утверждать, что в той или иной степени кишечные дисфункции возникают практически у всех детей раннего возраста и являются функциональным, в какой-то мере «условно» физиологическим состоянием периода адаптации и созревания ЖКТ грудного ребенка (Хавкин А.И., 2001). Однако проблема нарушения функции кишечника, как это ни странно, вызывает особый интерес педиатров, неонатологов, гастроэнтерологов и даже невропатологов. Ведение таких детей связано с определенными сложностями, так как мало учитывается тот факт, что пищеварительная система ребенка наиболее сложно адаптируется к внеутробному существованию и очень многие факторы влияют на это (Бердникова Е.К. и др., 2006; Leung A.K. et al., 2004).
Функциональными заболеваниями (или нарушениями) принято считать ситуации, когда в ходе обследования не удается обнаружить анатомических, морфологических, метаболических или иных нарушений, которые могли бы объяснить имеющиеся у ребенка симптомы. Причины функциональных расстройств часто лежат вне пораженного органа и обусловлены нарушением нервной и гуморальной регуляции деятельности пищеварительного тракта. ФН ЖКТ, как правило, связаны именно с расстройствами систем саморегуляции желудка, кишечника, билиарного тракта и др. (Приворотский В.Ф. и др., 2012).
Основными физиологическими функциями ЖКТ являются секреция, переваривание, всасывание и моторика; он является средой обитания симбионтной микробиоты, влияет на становление функций иммунной системы. Перечисленные функции связаны между собой, вначале заболевания может иметь место нарушение только одной из функций, по мере развития болезни могут изменяться и другие. В настоящее время, если о функциональных нарушениях ЖКТ, то говорят как о нозологической форме, подразумеваются нарушения моторной функции и соматической чувствительности, однако к ним часто присоединяются изменения секреторной, всасывающей функций, микробиоты пищеварительной системы и иммунного ответа (Мухина Ю.Г. и др., 2003).
Согласно широко распространенному определению функциональных нарушений по D.A. Drossman (1994), они представляют собой «разнообразную комбинацию гастроинтестинальных симптомов без структурных или биохимических нарушений». Близким по смыслу является определение ФН, представленное в «Римских критериях II», международном консенсусе по функциональным заболевания органов пищеварения 1999 года (Drossman D.A., 1994; Drossman D.A., 1999). Уязвимость такого определения функциональных нарушений заключается в его зависимости от текущего уровня наших знаний и возможностей методов исследования, которые не позволяют выявить те или иные структурные нарушения, подвергая сомнению сам факт существования этой группы заболеваний. С другой стороны, ФН являются «нарушениями функций органа, причины которых лежат вне пораженного органа и связаны с измененной регуляцией нарушенной функции». Именно это определение представляется наиболее приемлемым как для практической деятельности, так и для теоретического осмысления многообразия патологических процессов в человеческом (да и не только человеческом) организме (Бельмер С.В. и др., 2005).
Несмотря на то, что «Римские критерии II» указывают на стабильный и благоприятный характер течения ФН, практика показывает, что возможна их эволюция в органическую патологию. Например, заболевания, сопровождающиеся гастроэзофагеальным рефлюксом (ГЭР), могут эволюционировать в гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь (ГЭРБ), функциональная диспепсия – в гастрит, а синдром раздраженного кишечника – в колит. Таким образом, отношение к функциональным заболеваниям должно быть достаточно серьезным, а меры лечения – адекватными (Бельмер С.В. и др., 2005).
Функциональные нарушения кишечника включают группу гетерогенных клинических состояний, которые проявляются симптомами со стороны среднего и нижнего отделов ЖКТ и не сопровождаются какими-либо структурными, системными либо метаболическими изменениями. Несмотря на отсутствие органической основы, функциональные заболевания снижают качество жизни пациентов и наносят большой экономический ущерб обществу как по прямым показателям затрат на медицинское обслуживание и лечение, так и по непрямым показателям, включающим компенсацию временной нетрудоспособности (Amouretti M. et al., 2006; Longstreth G.F. et al., 2006). У большинства практических врачей диагностика функциональных расстройств кишечника вызывает озабоченность из-за новой терминологии, недостаточно четкого понимания их сущности (Yale S.H. et al., 2008). В 2006 году экспертами Международной группы по изучению функциональных заболеваний органов пищеварения рассмотрены и уточнены определение, классификация, критерии диагностики и рекомендации по лечению функциональных расстройств кишечника, что нашло отражение в материалах III Римского консенсуса (Drossman D.A., 2006; Longstreth G.F. et al., 2006). В классификацию функциональной патологии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) включены следующие рубрики кишечных расстройств: I. Функциональные кишечные расстройства (III Римский консенсус) синдром раздраженного кишечника (СРК); функциональный запор; функциональная диарея; функциональный метеоризм; функциональные абдоминальные боли. II. Дисфункциональные расстройства билиарного тракта: дисфункция желчных путей; дисфункция сфинктера Одди. Наиболее распространенным среди функциональных заболеваний ЖКТ является СРК. В странах Западной Европы СРК выявляется у 10-20 % населения (Longstreth G.F. et al., 2006; Talley N.J., 2006). Показатели распространенности СРК в Украине, вероятнее всего, близки к таковым в странах Европы. СРК встречается преимущественно в молодом возрасте, причем чаще у женщин. Среди клинических подтипов СРК чаще других встречается смешанный СРК (Talley N.J., 2006).
Эпидемиологические данные о распространенности функционального запора вариабельны, что связано с различными представлениями врачей и пациентов о функциональном запоре. В целом запором страдает почти 27% взрослого населения, на долю функционального запора приходится предположительно около 3%. Так же затруднительно охарактеризовать распространенность функционального вздутия живота и функциональной диареи. Известно, что около 2% визитов к врачу общей практики вызвано диареей, в том числе СРК с диареей и функциональной диареей (Сергиенко Е.И., 2009; Longstreth G.F. et al., 2006; Talley N.J., 2006).
Роль кишечной палочки в норме и патологии у детей, характеристика ее антигенной структуры и основных факторов патогенности
Патогенные серотипы кишечных палочек могут быть причиной эшерихиозов – различных инфекционных заболеваний, протекающих с интоксикацией, лихорадкой, обычно с поражением желудочно-кишечного тракта, реже – мочевыводящих, желчевыводящих путей, других органов или с развитием сепсиса (O Boyle C.J. et al., 1998), гемолитико-уремического синдрома (Венцель Р. и др., 2003; Karmali M.A. et al., 1983; Srivastava R.N., et al., 1991), перитонита, пневмонии. Эшерихиозы чаще встречаются у детей раннего возраста (Воробьев А.В. и др., 2003; Меньшиков В.В., 2009; Лабинская А.С. и др., 2008; O Boyle C.J. et al., 1998). Кишечная палочка имеет сложную антигенную структуру. Она содержит соматический, или О-антиген, поверхностный (капсульный) К-антиген и жгутиковый Н-антиген. О-антигены у бактерий рода Escherichia имеют сходную химическую структуру и связаны с липополисахаридами (ЛПС) клеточной стенки. Н-антигены имеются только у жгутиковых форм бактерий и состоят из белка флагеллина. О-антигены являются основными антигенами, определяющими серологическую группу эшерихий. В настоящее время описано около 170 О-серогрупп Е. coli. Большинство эшерихий, принадлежащих к разным О-серогруппам, связаны друг с другом перекрестными антигенными связями. Около 100 серогрупп имеют антигенные связи с шигеллами, сальмонеллами и другими энтеробактериями. К-антигены представлены тремя антигенами, обозначаемыми буквами А, В и L. Они отличаются друг от друга чувствительностью к нагреванию и химическим веществам. К-антигены обладают способностью маскировать О-антигены, которые можно выявить только после разрушения первых кипячением культуры. Эшерихии содержат около 97 разных К-антигенов, преимущественно В-типа. Н-антигены в отличие от О- и К-антигенов являются типоспецифическими. У эшерихий описано 50 разных Н-антигенов. Антигены эшерихий обозначают антигенными формулами, указывающими на серогруппу, например, Е.coli О26:К6О(В6), или серовар – Е.coli О26:К6О(В6):Н2. Патогенность для людей связана с определенными серогруппами (Воробьев А.В. и др., 2003; Борисов Л.Б., 2005; Лабинская А.С. и др., 2012). Однако даже неагрессивная, нормальная кишечная палочка становится потенциально опасной при ее попадании, росте и размножении в нетипичных экологических нишах. Данный результат может быть частично объяснен переходом авирулентных E.coli, получивших участок генома, содержащего гены, ответственные за адгезию от энтеропатогенных E.coli, в типы, образующие белковые факторы вирулентности (Тюрин Ю.А. и др., 2002; McDaniel T.K. et al., 1997). Иными словами, существует возможность превращения симбиозов нормально биологических в симбиозы патологические. Условно-патогенные микроорганизмы начинают играть роль паразита в том случае, если после окончания заболевания у макроорганизма не установятся с ним вновь симбиотические взаимоотношения (Ильина Н.А. и др., 2008).
Полиморфизм клинической картины, патогенез и особенности эпидемиологии обусловлены наличием комплекса разнообразных факторов вирулентности (адгезинов, инвазинов, токсинов) (Меньшиков В.В., 2009). Эволюционное происхождение большинства факторов патогенности энтеробактерий остается неизвестным. Но в свете последних достижений изучения генетического аппарата бактерий и особенно после обнаружения в них так называемых «геномных островов» – фрагментов чужеродной ДНК – можно полагать, что значительная часть факторов вирулентности может передаваться посредством горизонтального переноса генов. В этом плане энтеробактерии не являются исключением, и в геномах многих из них имеются чужеродные «острова», где возможны совершенно неожиданные вариации генетического кода. Подобная ситуация во многом объясняет фантастическую пластичность их генетического аппарата и за время своего существования (120-140 млн. лет) среди энтеробактерий произошла эволюция, а чуть позже селекция генов, кодирующих образование факторов патогенности. При этом в некоторых видах они консервативно закрепились в генетическом аппарате, в других – рассеялись в составе трансмиссивных элементов (Поздеев О.К., 2010).
Условно факторы патогенности можно разделить на две большие группы. Первая группа факторов патогенности связана с генами адаптации, продукты которых обеспечивают адгезию и колонизацию организма внеклеточным паразитам или проникновение (инвазию) и размножение in vivo и распространение в ткани – внутриклеточным паразитам. Вторая группа связана с генами токсигенности и токсиногенезом, т.е. способностью патогенов продуцировать токсины. Данная группа прямо вовлечена в формирование собственно заболевания. Это не означает, что токсины не играют роли на первых этапах взаимодействия паразита и хозяина, а только указывает на их наиболее важную роль как специфических веществ (Тюрин Ю.А. и др., 2002; Лабинская А.С. и др., 2008). 1. Факторы адгезии и колонизации. Процесс взаимодействия эшерихий с эпителием слизистой кишечника начинается с адгезии, основанной на избирательном взаимодействии бактерий с рецепторами эпителиоцитов и / или покрывающим их слоем слизи (муцина), с последующим размножением бактерий в зоне инфицирования (Сидоренко С.В., 2001; Поздеев О.К., 2010; Лабинская А.С. и др., 2012).
Для практических целей выделяют две группы механизмов адгезии – неспецифические и специфические. Неспецифическая адгезия опосредована физико-химическими взаимодействиями бактерий с поверхностями. К ним относятся: электростатические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия, Ван-дер Ваальсовы взаимодействия, броуновское движение. Неспецифическая адгезия, как правило, обратима. Для описания этого типа адгезии в англоязычной литературе иногда используют термин «docking» (постановка в док). Для описания специфической адгезии, которую считают необратимой, используют термин «anchoring» (заякоревание). Специфическая адгезия происходит в результате молекулярных взаимодействий между адгезином (поверхностные структуры микробных клеток и входящие в их состав макромолекулы, обычно белки, посредством которых осуществляется прикрепление к специфическим поверхностям) микробной клетки и рецептором (структура, комплементарная адгезину и находящаяся на поверхности эукариотической клетки) клетки хозяина (Сидоренко С.В., 2001).
Адгезины E.coli представляют собой, обычные пили (pili) или фимбрии (Сидоренко С.В., 2001; Лабинская А.С. и др., 2008). Известно, что бактерии одного штамма E.coli способны экспрессировать различные типы фимбрий, которые кодируются различными хромосомными или плазмидными генами (Лабинская А.С. и др., 2008). Описаны также завитки (curli), представляющие собой высокоагрегативные поверхностные структуры, способствующие прикреплению бактерий к белкам макроорганизма – фибронектину и плазминогену. Энтеропатогенные E.coli синтезируют пили, формирующие пучок, обозначенные как Bfp (Bundle forming pili, англ.), которым приписывается роль в первичном прикреплении эшерихий к эпителию (Лабинская А.С. и др., 2012). Ген, кодирующий формирование связывание пилей (расшифровка английского термина bfp) был найден на поверхности энтеропатогенных кишечных палочек (EPEC), он играет важную роль в обеспечении вирулентных свойств штаммов типичных EPEC. Данный ген bfp отвечает за формирование связей пилей между бактериями, что ведет к образованию бактериальных агрегаций (микроколоний), а также за инициацию адгезии бактерий с клеткой хозяина (в данном случае – с эпителиоцитами кишечника) и, следовательно, колонизацию эпителия слизистой толстой кишки человека (Girn J.A. et al., 1995; Tobe T. et al., 2001; Ramboarina S. et al., 2005; Saldana Z. et al., 2009).
Микроэкологическая характеристика интестинального биоценоза детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта
По результатам бактериологических исследований копрологических проб почти у всех детей с ФН ЖКТ диагностированы нарушения состава нормальной микробиоты толстой кишки различной степени выраженности. Дисбаланс облигатной микробиоты в основном характеризовался снижением популяционной плотности на 1-3 порядка от физиологической нормы представителей индигенных бактерий у большей части обследованных (73,3±2,9%). Дефицит бифидобактерий зарегистрирован у половины детей (55,5±3,3%), а дефицит лактобацилл – достаточно редко, только у 1,3±0,7%. В 16,4±2,4% случаев (40 чел.) у детей определялся дефицит E.coli с нормальными ферментативными свойствами (рис. 4).
Характеристика частоты регистрации дефицитного состояния индигенной микробиоты кишечника у детей с ФН ЖКТ (n = 225) Популяционная плотность бифидобактерий в кишечном биоценозе детей в среднем составляла 7,7±1,6 lg КОЕ/г, что на 2-3 порядка ниже общефизиологических нормативов (ОСТ, 2003), и региональных ориентиров (Попкова С.М. и др., 2012). Содержание лактобацилл у этих детей было досточно высоким (9,4±1,1 lg КОЕ/г), а средний уровень популяционной плотности E.coli с нормальной ферментативной активностью (полноценная E.coli) также соответствовал физиологическим стандартам (7,1±0,9 lg КОЕ/г).
На фоне определенного дисбаланса индигенной микрофлоры в микроэкологической системе кишечника детей отмечалась вегетация различных представителей УПМ в диагностически значимой концентрации (5 – 7 lg КОЕ/г).
В целом иерархия бактериального сообщества в изучаемой группе была четко выражена. Спектр кишечной микробиоты обследованных детей был представлен различными видами микроорганизмов с показателем постоянства (с): для Enterococcus spp. – 71,6% (средний уровень популяционной плотности – lg 6,8±0,5 КОЕ/г), Klebsiella spp. – 37,3% (lg 6,0±1,0 КОЕ/г), E.coli со слабой ферментативной активностью – 27,1% (lg 7,2±0,6 КОЕ/г), Staphylococcus spp. – 24,5% (lg 4,8±0,6 КОЕ/г), Clostridium spp. – 17,3% (lg 4,6±1,4 КОЕ/г), Candida spp. – 15,1% (lg 4,7±0,7 КОЕ/г), E.coli с гемолитической активностью – 11,6% (lg 7,3±0,6 КОЕ/г), Enterobacter spp. – 9,7% (lg 5,6±0,9 КОЕ/г), Citrobacter spp. – 4,4% (lg 5,6±0,8 КОЕ/г), Pseudomonas spp. – 3,1% (lg 5,1±1,1 КОЕ/г) и Proteus spp. – 1,8% (lg 6,7±0,5 КОЕ/г) (рис. 5).
Таким образом, у детей с ФН ЖКТ отмечается наиболее значимая роль энтерококков в составе микробиоценоза (с=71,4%) по сравнению с другими видами микроорганизмов, которые в большинстве случаев попадают в категорию случайных видов (с=18,6% – 2,0%), за исключением Klebsiella spp., E.coli со слабой ферментативной активностью и Staphylococcus spp., попадающих в группу добавочных видов.
У большей части детей (66,2%) в кишечном биотопе выявлялись условно-патогенные микроорганизмы. В монокультуре представители УПМ встречались у каждого третьего ребенка (31,6%). При этом наиболее выявляемыми в монокультуре являлись Klebsiella spp. (12,4%), реже – Clostridium spp. (5,8%), Enterobacter spp. (4,9%), Staphylococcus aureus (4,4%) и Candida spp. (2,7%); Pseudomonas aeruginosa (1,3%), Citrobacter spp. (0,4%) и S.epidermidis (0,4%). В большинстве же случаев (34,7%) данные микроорганизмы формировали ассоциации, состоящие из нескольких компонентов (от двух до четырех ассоциантов в биотопе). Необходимость изучения микроорганизмов как ассоциантов в сообществе, а не как суммы монокультур, обосновывается тем, что в ассоциациях микробные продукты действуют синергически, способствуя росту и размножению бактерий, экспрессии факторов патогенности (Бухарин О.В. и др., 2012).
Из двухкомпонентных ассоциаций доминировали Klebsiella spp. + S.aureus (28,1%), Klebsiella spp. + Candida spp. (26,3%), реже встречались Klebsiella spp. + Clostridium spp. (8,8%), Enterobacter spp. + S.aureus (7,0%), Klebsiella spp. + Citrobacter spp. (3,5%). Другие двухкомпонентные сочетания УПМ встречались крайне редко (около 2% случаев – Candida spp. + Clostridium spp., Enterobacter spp. + Citrobacter spp., S.aureus + Pseudomonas spp., S.aureus + Clostridium spp., S.aureus + Citrobacter spp., Enterobacter spp. + Clostridium spp., Citrobacter spp. + Candida spp., Enterobacter spp. + Candida spp., Klebsiella spp. + Proteus spp., Klebsiella spp. + Pseudomonas spp., Klebsiella spp. + S.epidermidis, S.epidermidis + Clostridium spp., Candida spp. + Proteus spp.).
Частое выявление Klebsiella spp. в ассоциациях с S.aureus (28,1%) и Candida spp. (26,3%), скорее всего, обусловлено дисбиотическими нарушениями, связанными с предшествующей колонизацией биотопа данными микроорганизмами (клебсиеллами), создающими условия для последующего заселения стафилококками и грибами, что свидетельствует о необходимости изучения этих межмикробных взаимодействий в ассоциативных симбиозах (Бухарин О.В. и др., 2012).
Дисбиотические изменения в составе микробиоты толстого кишечника были зарегистрированы у большинства детей (88,4%), независимо от возраста, но степень выраженности дисбиоза у них различна. Более чем у половины из них отмечался дисбиоз кишечника II степени (62,2%), а дисбиоз I и III степени – в 22,2% и 4,0% случаев соответственно. И только 11,6% детей не имели качественных и количественных изменений кишечной микробиоты (рис. 7).
Состав микробиоты толстой кишки у детей с ФН ЖКТ первого года жизни и старше имел свои особенности (табл. 4). Анализ полученных данных показал, что доминирующими видами в кишечной биоте детей являются факультативно-энаэробные бифидо- и лактобактерии, а также аэробные эшерихии (с индексом постоянства «с» , равным 100%). Однако обращает на себя внимание высокая распространенность у этих детей энтерококков (около 70%, табл. 4) по сравнению со здоровыми (13,3%, табл. 5). Таблица 4
Распространенность дефицита представителей индигенной биоты у детей с ФН ЖКТ первого года жизни и детей старшего возраста регистрировалось приблизительно на одинаковом уровне. Частота встречаемости E.coli со слабой ферментативной активностью, и патогенных энтеробактерий (Klebsiella spp.) у детей первого года жизни была выше почти в 2 раза по сравнению с детьми старше года. Носительство стафилококков (золотистых) у детей младшей группы регистрировалось у каждого второго ребенка (49,4%), что в 6 раз чаще по сравнению с детьми старшей возрастной группы (8,6%) (табл. 4). Эти возрастные особенности микроэкологических характеристик согласуются с процессами сукцессии кишечного тракта, особенно активно проходящих в первый год жизни детей.
С возрастом у детей реже регистрировались почти все определяемые нами условно-патогенные микроорганизмы, за исключением грибов рода Candida. Их частота встречаемости (20,0±3,3%) среди детей старшей группы превышала 3 раза таковую по сравнению с младшей (7,1±2,7%). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о наличии дисбиотических проявлений (дисбиоза первой-второй степени) у более, чем у половины детей с ФН ЖКТ. Причем дисбиотические изменения в микробиоте кишечника преобладали у детей первого года жизни на фоне активных процессов сукцессии кишечного тракта. У детей старшей возрастной группы условно патогенная микрофлора регистрировалась реже, и только дрожжеподобные грибы Candida spp. вегетировали в кишечнике чаще по сравнению с младшей группой. Для детализации динамики возрастных изменений микроэкологического статуса кишечного биоценоза у детей с ФН ЖКТ дальнейший анализ проводился по группам, соответствующим периодам критического развития иммунной системы у детей (Стефани Д.В. и др., 1996) (табл. 6). Особое внимание было уделено III, IV и V возрастным периодам, объединяющих детей (135 чел.) от 2 до 15 лет. Как видно из таблицы 6, значимых отличий в характеристиках микроэкологического баланса кишечной микробиоты у детей в первых двух группах не выявлено. И средние характеристики микробиоценоза соответствовали выше представленным по общей группе детей первого года жизни.
Резюмируя эту часть исследования, можно сказать, что, наряду с общими закономерностями, связанными с широким распространением среди детей с ФН ЖКТ дефицита индигенной микрофлоры, отличительной особенностью микроэкологического статуса кишечного биоценоза является значительно большее по сравнению со здоровыми детьми распространение среди них энтерококков. Это может быть риском для появления штаммов с наличием ряда факторов патогенности, вызывающих инфекционные процессы. Кроме того, нами отмечено, что у детей с пониженной колонизационной резистентностью, к коим относятся дети с ФН ЖКТ, процессы сукцессии, установление микроэкологического гомеостаза, завершаются достаточно поздно – к третьему-четвертому году жизни.
Определение частоты встречаемости генов, кодирующих способность к формированию связывания пилей и синтез адгезина интимина у аутоштаммов Escherichia coli
Частота встречаемости генов патогенности, кодирующих способность к формированию связывания пилей (bfp) была высокой как среди разных биохимических вариантах E.coli, так и в разных возрастных группах детей, по сравнению с остальными искомыми детерминантами патогенности. Ген, отвечающий за синтез бактериального адгезинa интимина (eae), который, наряду с bfp, также отвечает за колонизацию кишечного биотопа микроорганизмами, регистрировался редко (p 0,05).
В общем пуле исследуемых штаммов эшерихий, выделенных у детей с ФН ЖКТ, отмечена высокая частота встречаемости гена bfp (90,9±1,7%), незначительно различаясь по группам эшерихий с разными фенотипическими вариантами. Из них у E.coli с нормальной ферментативной активностью ген bfp регистрировался в 92,1±1,9% случаев, у E.coli со слабой ферментативной активностью – в 86,6±4,3% и у гемолитических E.coli – в 91,6±5,7% случаев. Однако при этом регистрация гена bfp в геноме E.coli с нормальной ферментативной активностью на фоне низкой ее популяционной плотности в кишечнике детей (на нижнем пределе физиологической нормы – 106 КОЕ/г) была низкой и составляла всего 6,4%. При более высокой концентрации типичного фенотипического варианта E.coli, который был на 2-3 порядка выше сравниваемого, (107 – 108 КОЕ/мл) bfp регистрировался чаще (36,7% – 49,0%.).
В группе сравнения ген, кодирующий способность к формированию связывания пилей (bfp) выявлялся во всех штаммах генома E.coli с нормальной ферментативной активностью и в геноме у E.coli со слабой ферментативной активностью (100%). Ген, отвечающие за синтез бактериального адгезинa интимина (eae) в геноме этих двух фенотипических вариантов (E.coli с нормальной ферментативной активностью и E.coli со слабой ферментативной активностью) в группе сравнения отсутствовал.
У детей до года (85 чел.) ген bfp регистрировался практически по всем аутоштаммам, хотя и немного реже (90,6%), чем у детей старше года (94,3%). Наличие данного гена в разных возрастных группах и в разных фенотипических вариантах кишечной палочки регистрировалось практически с одинаковой частотой, не имея статистически значимой разницы (рис. 13). Так, в геноме аутоштаммов E.coli с нормальной ферментативной активностью у детей до года и после ген bfp определялся в 95,6% и 91,8% соответственно, в геноме E.coli со слабой ферментативной активностью в 81,6% и 86,4%, в геноме аутоштаммов гемолитических E.coli – в 87,8% и 94,3% случаев. Однако следует отметить, что в исследуемом нами материале чаще всего этот ген циркулировал среди штаммов E.coli с нормальной ферментативной активностью (91,8% – 95,6%) по сравнению, например, с нетипичными штаммами (81,6% – 86,4%).
Гены, отвечающие за синтез бактериального адгезинa интимина (eae) в геноме разных фенотипических вариантов (E.coli с нормальной ферментативной активностью, гемолитических E.coli) определялись только в группе детей младшей возрастной группы (до года). У гемолитических кишечных палочек данный ген выявлялся в 4 раза чаще (12,5%), чем у E.coli с нормальной ферментативной активностью (2,9%).
В данной главе приведен суммарный анализ исследованных нами генов, определяемых в разных фенотипических вариантах E.coli. Тестирование штаммов E.coli, выделенных у детей с ФН ЖКТ показало, что не зависимо от изучаемой фенотипической группы бактерий, чаще всего искомые ампликоны выявлялись при использовании праймеров к генам bfp, stx1, stx2 и pCVD432. Частота встречаемости данных ампликонов у кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью составила 92,1%, 12,9%, 5,0% и 5,0% соответственно (в группе сравнения соответственно – 100,0%, 15,0%, 5,0% и 30,0%; p 0,05). Редко встречаемыми генами являлись eae – 1,0%, eltA – 0,5%. Как правило, изучаемые гены патогенности чаще определялись на фоне высокой популяционной плотности эшерихий (107 – 108 КОЕ/г), на 2-3 порядка превышающих зарегистрированную нами их низкую концентрацию (ОСТ, 2003). В данной фенотипической группе эшерихий ампликоны, специфичные ipaH гену, отсутствовали.
В группе слабоферментативных E.coli доля генетических детерминант факторов патогенности была несколько ниже по сравнению с типичными эшерихиями. Так, искомых ампликонов, специфичных bfp гену, составило 86,6%, stx1 – 8,3%, stx2 и ipaH – по 5,0%. Гены eae, pCVD432 и eltA в данной фенотипической группе отсутствовали. В группе сравнения ген bfp присутствовал во всех выделенных аутоштаммах (100%), pCVD432 определялся в 40,0% случаев (значительно выше по сравнению с детьми с ФН, p 0,05), другие изучаемые генетические детерминанты патогенности не выявлялись (рис. 14, 15).
В группе гемолитических E.coli, вегетирующих только в кишечном биотопе детей с ФН, частота встречаемости генетических детерминант в ДНК данного микроорганизма была несколько ниже, чем в типичных и слабоферментативных вариантах эшерихий. Анализ материала по определению изучаемых ампликонов показал, что среди изолятов кишечных палочек с гемолитической активностью преобладали аутоштаммы с наличием bfp - гена, отвечающего за формирование связывания пилей (91,6%). Гены eae, stx1, stx2 и eltA выявлялись в геноме микроорганизмов данной фенотипической группе бактерий с равной частотой – по 4,2%.
