Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Формирование бобово-ризобиальногосимбиоза 11
1.1.1. Прединфекционная стадия 11
1.1.2. Инфекция и формирование клубенька 13
1.1.3. Функционирование клубенька 17
1.2. Регуляция симбиотического взаимодействия 19
1.3. Влияние минерального азота на взаимодействие ризобий и корней бобовых в ризосфере 22
1.4. Влияние минерального азота на бобово-ризобиальный симбиоз 23
1.5. Влияние высоких доз минерального азота на инфицирование бобовых ризобиями и функционирование клубеньков 28
1.6. АФК и АФА у бобовых при симбиозе в зависимости от уровня минерального азота в среде 36
1.7. Синтез и роль NO 39
1.7.1. NO в животных клетках 41
1.7.2. Роль NO в растениях 43
1.7.3. Взаимодействие NO с другими сигнальными молекулами 45
1.7.4. Синтез NO у растительных организмов 49
1.7.5. Механизмы предотвращающие токсический эффект NO 55
1.7.6. Синтез и роль NO при симбиозе 58
Заключение по литературному обзору 61
Глава 2. Материалы и методы 63
2.1. Объект исследования 63
2.2. Реактивы и питательные среды 63
2.3. Аппаратура 64
2.4. Температурный режим 65
2.5. Проращивание растительного материала 65
2.6. Методика проведения микробиологических исследований 65
2.7. Определение нитратов с помощью салициловой кислоты 66
2.8. Методика проведения микроскоскопических исследований 66
2.9. Методика определения роста клубеньковых бактерий в культуре 67
2.10. Определение содержания пероксида водорода 68
2.11. Определение активности каталазы 69
2.12. Определение общего белка 69
2.15. Определение N0 в корнях этиолированных проростков гороха с помощью флуоресцентной микроскопии 70
2.16. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты и обсуждения
3.1. Влияние инокуляции на поглощение проростками гороха нитратного азота 72
3.2. Рост клубеньковых бактерий в культуре в зависимости от концентрации азотных соединений 75
3.3. Влияние высокой концентрации азотных солей на адгезию и проникновение ризобий в ткани корней этиолированных проростков гороха 79
3.4. Оценка влияния минерального азота на начальные этапы взаимодействия ризобий с корнями гороха с помощью световой микроскопии 83
3.5. Влияние ризобиальной инфекции на содержание перекиси водорода, активность каталазы в этиолированных корнях гороха 86
3.5.1. Содержание пероксида водорода в корнях гороха в зависимости от ризобиальной инфекции 87
3.5.2. Влияние минерального азота на синтез проростками гороха Н202 91
3.5.3. Влияние нитропруссида натрия на генерацию Н2О2 корнями проростков гороха в зависимости от ризобиальной инфекции 93
3.5.4. Активность каталазы в этиолированных корнях проростков гороха при ризобиальной инфекции 95
3.6. Влияние экзогенных факторов на генерацию оксида азота (NO) в корнях этиолированных проростков гороха 97
3.6.1. Минеральный азот и синтез NO в этиолированных корнях проростков гороха, неинокулированных Rhizobium 99
3.6.2. Влияние ризобиальной инокуляции, гемоглобина, на синтез NO в корнях проростков гороха 107
Заключение 113
Выводы 119
Список литературы 121
- Влияние высоких доз минерального азота на инфицирование бобовых ризобиями и функционирование клубеньков
- Механизмы предотвращающие токсический эффект NO
- Определение N0 в корнях этиолированных проростков гороха с помощью флуоресцентной микроскопии
- Оценка влияния минерального азота на начальные этапы взаимодействия ризобий с корнями гороха с помощью световой микроскопии
Введение к работе
Бобово-ризобиальная система — межвидовое сообщество, образуемое высшими растениями (бобовыми) и микроорганизмами (клубеньковыми бактериями - ризобиями) (Brewin, 1991; Hirsch, 1992). Ризобиям это сожительство позволяет избежать конкуренции за источники питания в почвенной среде, а растениям получать необходимый для жизнедеятельности минеральный азот в виде NH3 из недоступного молекулярного азота воздуха (Кретович, 1994).
Известно, что повышение продуктивности сельскохозяйственных культур определяется многими факторами, среди которых первостепенная роль принадлежит азоту. Рациональное использование человеком симбиотической азотфиксации, этого уникального биологического феномена, позволяет повышать плодородие почв и получать стабильно высокие урожаи сельскохозяйственных культур, не подвергая риску загрязнения природную среду, как это случается при внесении минеральных удобрений.
Бобовые (Fabaceae) являются одним из самых больших семейств цветковых растений. У более 90% изученных видов обнаружена способность к азотфиксации (Проворов, 1992; Sprent, 2002). От взаимоотношения процессов ассимиляции азота и азотфиксации зависит применение азотных удобрений под бобовые с целью повышения их продуктивности (Кретович, 1987).
В настоящее время по степени изученности бобово-ризобиальный симбиоз значительно превосходит любую другую симбиотическую или фитопатогенную систему. В большинстве работ посвященных проблемам бобово-ризобиального симбиоза, рассматриваются стадии собственно азотфиксации, когда азотфиксирующий аппарат (зрелый клубенек) уже сформирован. Исследованию же начальных его этапов уделяется гораздо меньше внимания, в то время как именно от начальных стадий симбиоза зависит успешное прохождение его дальнейших этапов и в конечном итоге формирование эффективного азотфиксирующего аппарата.
Начальные этапы симбиоза стали изучаться сравнительно недавно (Vincent, 1980; Brewin, 1991; Franssen et al. 1992). Одной из важнейших причин для изучения симбиоза стала возможность его использования в качестве очень удобной модели для разработки ряда фундаментальных и прикладных проблем физиологии, биохимии и генетики высших растений. Горох относится к числу бобовых растений наиболее эффективно фиксирующих атмосферный азот. Это растение выращивается в разных регионах земного шара. Главными странами производителями гороха являются Канада - 3,5 млн. тонн; Россия - 1,25; Европа 1,17; Китай - 0,9; Индия - 0,8; США ~ 0,56 (FAO, 2008).
Основными проблемами на начальных этапах бобово-ризобиального взаимодействия являются: - узнавание растением-хозяином ризобий как симбиотических партнеров, отличие их от других многочисленных групп почвенных бактерий; - механизмы проникновения и супрессирование защитных систем растения-хозяина, которые могут быть установлены заранее или индуцированы для защиты от патогенных микроорганизмов; регуляция количества проникающих ризобий для предотвращения их избытка в клетках растений и образования вследствие этого избыточного количества малоэффективных клубеньков; включение растением защитных механизмов в органах не связанных с нодуляцией для предотвращения проникновения в них ризобий; несоответствие конкурентоспособности ризобий и их азотфиксирующей активности (Ames-Gottfred, Christie, 1989; Орлова и др., 1991; Bottomley, 1992)
Формирование симбиоза между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями представляет собой сложный многоэтапный процесс, подверженный влиянию различных экологических факторов, регулирующих образование данной системы. Однако в естественной среде формированию и функционированию этой системы препятствуют различные внешние факторы, которые контролируют от 30 до 80% варьирования симбиотических признаков и их действие может быть более значительным, чем суммарное действие обоих партнеров (Генетика симбиотической..., 1998). В число таких факторов входит и минеральный азот (нитратный и аммонийный), высокие концентрации которого в почве при внесении азотных удобрении негативно сказываются на жизнедеятельности обоих партнеров, что ведет к снижению эффективности симбиоза или прекращению симбиотических взаимоотношений (Мишустин, Шильникова, 1973; Arrese-Igor et al., 1997). Нитратный азот задерживает появление клубеньков, снижает их количество, ингибирует активность нитрогеназы, индуцирует преждевременное старение клубеньков и их отмирание. И хотя вопрос об отрицательном влиянии высоких доз минерального азота возник еще в начале 20 века (Fred, Graul, 1916) он до сих пор не получил своего окончательного разрешения. Главная причина этого заключается в сложности и многоэтапности формирования и функционирования бобово-ризобиальных структур.
Исходя из недостаточной изученности влияния высоких доз минерального азота на установление симбиоза между бобовым растением и клубеньковыми бактериями были определены цель и задачи настоящей работы.
Влияние высоких доз минерального азота на инфицирование бобовых ризобиями и функционирование клубеньков
Процесс взаимодействия ризобий с бобовыми начинается при достижении в ризосфере определенной концентрации клубеньковых бактерий, что определяется так называемыми "кворум-чувствительными" сигналами, активирующими rhi- и nod-гены бактерий (Soto et al., 2006). Данные о влиянии минерального азота на размножение ризобий и их адсорбцию на поверхности корней немногочисленны. Так, по данным Шумного и др. (1991), высокая доза нитратов в среде усиливала размножение ризосферных Rhizobium meliloti в 2 раза через 10 дней после внесения азота. Усиление микробиальной активности в ризосфере при внесении N-удобрений некоторые авторы объясняют увеличением выделения корневых экссудатов растений, используемых бактериями для своей жизнедеятельности (Mahmood et al., 2005). В этой связи показана зависимость активности Rhizobium leguminosarum в ризосфере от фенольных соединений (ФС), выделяемых проростками гороха при разных концентрациях нитратного азота в среде (Латышева и др., 2007). Синтезируемые бобовыми растениями некоторые ФС способны ускорять рост ризобий в ризосфере (Hartwig et al., 1991), они служат хемоаттрактантами при их взаимодействии с корнями бобовых (Caetano-Analles et al., 1988). Активность ризобий в ризосфере может зависеть от количественного и качественного состава ФС и других биологически активных веществ, синтезируемых растением в ответ на разные дозы азота и выделяемых в ризосферу (Dakora, 2003). Известно, что азотные соли, применяемые в качестве удобрений не оказывают существенного отрицательного влияния на рост клубеньковых бактерий в культуре даже в очень высоких концентрациях (до 60-80 мМ) (Федоров, Козлов, 1954; Связывание молекулярного азота..., 1984; Кириченко и др., 1993; Митанова и др., 2007).
По литературным данным высокие дозы минерального азота в среде активируют размножение клубеньковых бактерий и их адсорбцию на поверхности корней бобового растения. На этой стадии взаимодействия ризобий и бобового растения отрицательного влияния высокой концентрации азота в среде не наблюдается. По-видимому, в этих условиях негативное действие со стороны растения-хозяина на ризобии происходит на последующих стадиях симбиотического взаимодействия, а именно, в растительных клетках. Но при этом следует учитывать и такой факт как изменение метаболизма ризобий под влиянием указанных азотных соединений, что также может сказаться на последующих этапах взаимодействия симбионтов.
Следует остановиться и на таком обстоятельстве, как присутствие в ризосфере веществ, могущих оказать негативное влияние на симбиотическое взаимодействие организмов. Так, внесение в почву азотных удобрений усиливает активность почвенных денитрифицирующих и нитрифицирующих бактерий, в результате чего образуются газообразные соединения азота -оксид азота (NO) и закись азота (N20) (Anderson, Levine, 1986; Scibe et al., 1993). По данным Skibe et al. (1993), при внесении в почву (NHj SC в дозе 100 кг N/ra эмиссия NO из почвы усиливается в 20 раз, a N20 - более чем в 7 раз. Из этих соединений особый интерес представляет NO, многофункциональная сигнальная молекула.
Образованный в ризосфере в результате активности микрофлоры NO в оптимальных количествах может оказывать положительный эффект на рост растений (Molina-Favero et al., 2007).
Влияние высоких доз минерального азота на бобово-ризобиальный симбиоз неоднократно обсуждалось в научной литературе (Streeter,1985; Carroll, Mathews, 1990; Шумный и др., 1991; Vessey, Waterer, 1992; Кириченко, 2001; Patriarca et al, 2002; Сидорова и др, 2006; Глянько и др., 2009а). Минеральный азот в больших концентрациях препятствует образованию клубеньков и подавляет симбиотическую азотфиксацию. При этом степень и продолжительность ингибирования зависят от дозы внесенного азота, а так же от видовых особенностей бобового растения (Мс Neil, 1982; Streeter, 1985). Каков механизм угнетающего действия нитратов на бобово-ризобиальный симбиоз? В обзоре Кириченко (2001) отмечается один из возможных механизмов ингибирования бобово-ризобиального симбиоза - это активация защитных систем растения-хозяина в условиях достаточного обеспечения почвенным азотом, что препятствует установлению симбиоза. Иначе говоря, растение-хозяин в этих условиях воспринимает клубеньковые бактерии как патогенные. Такая реакция растения может быть связана с тем, что энергетические и пластические затраты растительного организма на формирование симбиотических структур и №-фиксацию значительно превышают затраты на усвоение растением почвенного минерального азота (Кретович, 1994). С другой стороны, чувствительность бобово-ризобиального симбиоза к экзогенному аммонийному азоту гораздо ниже, чем в случае нитратного азота (Richardson et.al., 1957; Vessey, Bollman, 2006). Отсюда следует, что механизмы ингибирующего влияния нитратного и аммонийного азота на бобово-ризобиальный симбиоз различные. Важно отметить такой факт, как отсутствие отрицательной реакции суперклубеньковых мутантов бобовых на высокие дозы минерального азота в почвенной среде (Jacobsen, Nijdam, 1983; Carroll et al., 1985; Gremaud, Harper, 1989;). Это объясняется нарушением у них механизма авторегуляции клубенькообразования (нодуляции) и позволяет макросимбионту формировать большое количество мелких клубеньков (Day et al., 1989).
Однако по некоторым данным, -фиксация у суперклубенькового мутанта в присутствии высоких доз минерального азота, также как и у нормального генотипа, может быть ниже, чем у родительской формы (Hansen et al., 1992). Делается вывод, что у суперклубенькового мутанта фасоли устойчивы к высоким дозам азота процессы клубенькообразования, но не процессы -фиксации (Hansen et al., 1992). По другим данным (Gresshoff, 1990) суперклубеньковый мутант сои в присутствии нитратов увеличивает не только количество клубеньков (в 3-5 раз), но и урожай зерна (на 30%) по сравнению с родительским генотипом. Как предполагают, причина супернодуляции — в блокировании синтеза в листьях или транспорта в корни неустановленного низкомолекулярного водорастворимого соединения, регулирующего клубенькообразование (Gresshoff et al, 1988). В то же время установлено, что небольшие дозы минерального азота (стартовые дозы) благоприятствуют развитию симбиотических взаимоотношений между ризобиями и бобовыми растениями (Becana, Sprent, 1987; Waterer et al, 1992; Gulden, Vessey, 1997; Сидорова и др., 2006). В почвенной среде, вне растения, клубеньковые бактерии питаются за счет минерального азота и N2 - фиксацию не осуществляют (Monza et al., 1992).
Механизмы предотвращающие токсический эффект NO
NO обладает как антиоксидантными, так и прооксидантными свойствами. Так, оксид азота способен регулировать уровень и токсичность АФК (Halliwell, Gutteridge, 1984) и оказывать защитное действие при окислительных стрессах (Wink et al., 1995). Кроме того, молекула NO сама по себе обладает антиоксидантными свойствами (Kanner, 1991). Модуляция фитогормонального баланса высокими дозами минерального азота является одной из возможных причин негативного влияния минерального азота на установление симбиоза. Тесная связь NO с фитогормонами подробно обсуждена в обзорах Lamattina et al. (2003), Molina-Favero et al. (2007), которые полагают, что оксид азота, возможно, является синхронизирующим химическим мессенджером, активирующим действие гормонов. Экзогенные фитогормоны (ауксин, АБК, кинетин) приводят к усилению синтеза эндогенного NO в растениях (Lombardo et al., 2006; Neill et al., 2002; Tun et al., 2001). И, наоборот, экзогенный NO ингибирует синтез этилена в растениях (Leshem et al., 1998). Образование боковых корней, корневых волосков у растений, сходное с инициацией образования примордия клубеньков, происходит при участии ауксина и оксида азота (Pagnussat et al., 2002). В этих процессах ауксины с помощью неизвестного механизма усиливает синтез NO (Lombardo et al., 2006).
По данным Zhao D-Y. et al. (2007), высокая доза нитратов (10 мМ) в среде ингибировала рост корней проростков кукурузы. Ингибирование снималось добавлением в питательную среду донора NO - нитропруссида натрия, или ИУК. Авторы делают вывод, что высокая доза нитратов уменьшает эндогенный уровень ИУК, а также ингибирует образование (через NO-синтазный путь) оксида азота, который служит триггером в нитратзависимом росте корня. Tominaga et al. (2009) связывают повышенную способность мутантных (по чувствительности к АБК) растений Lotus japonicus к нодуляции и -фиксации с низким уровнем АБК и NO в корнях этих растений. Таким образом, четко прослеживается связь между фитогормонами и N0, их взаимное влияние как в условиях ризобиальной инфекции, так и при действии высоких доз минерального азота. Исходя из вышеизложенного, одной из возможных причин негативного влияния высоких доз нитратного азота на формирование симбиоза бобовых и ризобий может быть нарушение соотношения в балансе ауксинов и оксида азота, инициирующих деление кортикальных клеток и образование примордия клубенька. Однако остается непонятным механизм влияния ауксина на синтез NO и механизм влияния N0 на деление клеток в ассоциации с ауксином. Непонятны также источники образования NO - нитратредуктаза, нитритредуктаза или Ж)-синтазный(е) фермент(ы)?
Литературных данных по содержанию NO в клетках корней макросимбионта на ранних стадиях формирования симбиоза мы не обнаружили. Однако синтез NO в функционирующих клубеньках четко показан с помощью NO-специфической флуоресцентной пробы (с 4,5-диаминофлюоресцеин диацетатом) с применением конфокальной микроскопии (Baudouin et al., 2006). По данным этих авторов, синтез NO локализован в бактероидсодержащих клетках, в -фиксирующей зоне клубенька. Авторы считают, что синтез NO в зрелых клубеньках осуществляется с участием фермента подобного NO-синтазе и роль оксида азота в клубеньках при нормальных физиологических условиях связана не с защитными реакциями и гибелью клеток, а скорее с другими неизвестными функциями.
Вопрос о возможной роли NO в функционировании бактероидов в литературе обсуждается. Так, предполагается, что NO в функционирующих клубеньках может выполнять роль регулятора переноса Ог в бактероиды, образуя комплекс с леггемоглобином (Herouart et al., 2002). Однако при этом уровень NO в клубеньках должен быть на достаточно низком уровне, не позволяющем ингибировать активность нитрогеназы (Kanayama et al., 1990; Trichant, Rigaud, 1992) и доставку кислорода в бактероиды путем образования комплекса с леггемоглобином. Для этого в клубеньках должен функционировать механизм, эффективно обезвреживающий избыток NO. Предполагается, что леггемоглобин и несимбиотический гемоглобин могут быть эффективными скавангерами NO в клубеньках (Shimoda et al., 2005; Vieweg et al., 2005). По данным Shimoda et al. (2005), содержание несимбиотического гемоглобина (LbHgl) увеличивается в функционирующих клубеньках в ответ на ризобиальную инфекцию, сопряженную с преходящим увеличением NO в корнях Lotus japonicus. Однако вопрос о влиянии высоких доз минерального азота на синтез NO и его функции на ранних стадиях инфицирования в литературе остается не раскрытым.
Наличие NO в клубеньках люцерны подтверждено в опытах Baudouin et al. (2006), причем авторы полагают, что генерация NO в клубеньках происходит в участием NO-синтазы, но не нитрат- или нитритредуктазы. Подчеркивается, что в нормальных физиологических условиях роль NO как негативного регулятора -фиксации в клубеньках маловероятна (Herouart et al., 2002). Вопросы механизма синтеза NO и роль этой молекулы в регуляции активности азотфиксирующего аппарата ризобий в бактероидах остаются до конца не выясненными. С одной стороны, есть данные о том, что синтез NO в клубеньках может происходить за счет ферментов, обладающих NO-синтазной активнстью (Guo et al., 2003; Cueto et al., 1996), с другой - при высоких дозах нитратного азота не исключено участие в генерации NO нитрат- и нитритредуктазы (Kanayama et al., 1990(a)).
Определение N0 в корнях этиолированных проростков гороха с помощью флуоресцентной микроскопии
Повышение уровня АФК (Н202) при ризобиальной инфекции через 30 мин указывает на межклеточный сигнальный механизм, включающийся при взаимодействии корня с клубеньковыми бактериями. Подобное наблюдается в случае внедрения в клетки растения патогенных микроорганизмов (Аверьянов, Лапикова, 1988; Baker, Orlandi, 1995; Doke et al., 1996; Levine et al., 1996; Lamb, Dixon, 1997; Bolwell, 1999; Tang, Smith, 2001; Тарчевский, 2002; Desaki et al., 2006). В снижении уровня пероксида через 60 мин и отсутствие изменений в ее содержании при более длительных временных экспозициях (2, 6, 24, 48 час) свидетельствует о важной роли структурно-функционального соответствия между ризобиальным Nod-фактором и растительным(и) рецептором(ами), которое обуславливает узнавание партнеров и подавляет запуск защитных механизмов у растений (Blilou et al., 1999). Такая картина характерна и для вирулентного патогена, хотя механизмы регуляции синтеза АФК будут, вероятно, другие. Существуют работы, показывающие, что при симбиотическом взаимодействии растение-хозяин отвечает на инфекцию образованием 02 и Н202, то есть проявляет сходство с ранними ответами на инфекцию патогенными бактериями (Васильева и др., 2001; Santos et al., 2001; Herouart et al., 2002).
По мнению Herouart et al. (2002) усиление окислительных процессов на начальных стадиях формирования бобово-ризобиального симбиоза может выполнять двоякую роль: отключение каскада защитных реакций при проникновении ризобий или, наоборот, их включение при неблагоприятных условиях для симбиоза. По данным Ramu et al. (2002) усиление окислительных процессов в ответ на "вторжение" в ткани ризобий необходимо для экспрессии у бобовых ранних генов нодулинов, например, гена Rip 1 пероксидазы. Дальнейшая задача состояла в выяснении влияния минерального азота на синтез растениями гороха пероксида водорода на фоне ризобиальной инфекции.
Изучение влияния минерального азота на генерацию проростками гороха пероксида водорода мы проводили на инокулированных и неинокулированных ризобиями растениях. Результаты представлены на рис. 3.5.2.1. Показано, что на варианте без инокуляции высокая концентрация KNO3 в среде (20 мМ) не оказывала достоверного влияния на уровень Н2О2 в корнях как при краткосрочных экспозициях (30 и 60 мин), так и при длительных экспозициях (2, 6, 24, 48 час) по сравнению с вариантом без азота (рис.3.5.2.1.). Следовательно, высокая доза нитратного азота в среде при данных условиях опытов не инициирует усиление синтеза пероксида водорода.
Другая картина наблюдается, если действие высокой дозы азота происходит на фоне инокулированных растений, когда этот фактор при 30-минутной экспозиции вызывал увеличение уровня Н2О2 в корнях на 39% (различие достоверно при Р 0,99, v=4), если сравнивать с вариантом без инокуляции растений. Возрастание содержания Н2Ог происходит, очевидно, за счет реакции растения на ризобиальную инфекцию, поскольку высокая доза азота сама по себе не вызывает усиления генерации пероксида водорода.
Таким образом, при краткосрочной экспозиции (30 мин) наблюдается очевидная взаимосвязь между двумя факторами: высокой дозой минерального азота и ризобиальной инфекцией, что проявляется в уровне генерации растением РЬОг. Каков механизм этого взаимодействия предстоит выяснить в дальнейших исследованиях.
Рассмотрение результатов по содержанию пероксида в корнях при более длительных экспозициях на среде с высоким содержанием азота и без инокуляции растений ризобиями не выявило (как и при краткосрочном воздействии) достоверного влияния минерального азота на уровень Н2О2 в корнях по сравнению с контролем (Н20) (рис. 3.5.2.1). Это еще раз подтверждает наш вывод о том, что высокая доза минерального азота на варианте без инокуляции растений не является стрессовым фактором для бобового растения.
Что касается влияния высокой дозы азота на синтез пероксида водорода на фоне ризобиальной инфекции, то наблюдается пик в накоплении Н2О2 через 24 часа на варианте с высокой дозой азота по сравнению с контролем (Н20). Накопление пероксида водорода в этом случае превосходит контроль на 70%. Трудно объяснить физиологическое значение накопления пероксида в этот временной период. Возможно, это связано с защитно-регуляторными механизмами растения-хозяина, так как именно в этот период наблюдается выход ризобий из инфекционных нитей в коровые клетки. Возможно влияние образующегося из нитратов оксида азота на ферментные системы, генерирующие АФК. Последнее подтверждается результатами наших опытов с влиянием нитропруссида натрия на синтез пероксида водорода в корнях гороха. Результаты этих исследований приводятся ниже.
Оценка влияния минерального азота на начальные этапы взаимодействия ризобий с корнями гороха с помощью световой микроскопии
Решение проблемы симбиотической азотфиксации важно как с научной, так и практической точек зрения. Научный аспект этой проблемы состоит в познании механизмов формирования и функционирования в бобовых растениях симбиотических структур — корневых клубеньков, своеобразной эндоплазматической ниши для клубеньковых бактерий, обеспечивающих снабжение растения усвояемым азотом. Практический интерес к симбиотической азотфиксации связан, прежде всего, с необходимостью повышения эффективности симбиотического усвоения растением атмосферного азота. В решении этой практической задачи несомненную роль играет познание физиологических, биохимических, генетических, анатомо-морфологических и других механизмов бобово-ризобиального симбиоза.
Немаловажное значение в формировании и функционировании бобово-ризобиального симбиоза играют внешние факторы, которые могут препятствовать установлению симбиоза. По литературным данным (Генетика симбиотической..., 1998) внешние условия контролируют от 30 до 80 % варьирования симбиотических признаков и их влияние может быть более значительным, чем суммарное действие макро- и микросимбионта. В число таких внешних факторов входит и минеральный азот, высокие концентрации которого в почве при внесении азотных удобрений ингибируют формирование симбиоза, снижают его эффективность или ведут к полному прекращению симбиотического взаимоотношения между организмами. Хотя отрицательное влияние высоких доз минерального азота на симбиоз было замечено еще в начале 20 века (Fred, Graul, 1916), причина этого явления до сих пор окончательно не установлена.
При симбиотическом взаимодействии клубеньковые бактерии и растение-хозяин обмениваются химическими сигналами, что ведет к инициации внедрения ризобий в клетки растения и образованию симбиотических структур. В нашем обзоре (Глянько, Митанова, 2009) обобщены литературные данные о возможных физиологических причинах негативного влияния высоких концентраций почвенного минерального азота на бобово-ризобиальный симбиоз и особое внимание обращено на возможную роль активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) в установлении бобово-ризобиального симбиоза в условиях повышенного азотного питания бобового растения. Следует отметить, что вопрос о роли АФК и АФА в формировании бобово-ризобиального симбиоза на начальных этапах практически не изучен (Глянько, Васильева, 2007).
Исходя из этого, мы в настоящей работе исследовали влияние активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) на начальные этапы бобово-ризобиального симбиоза и на основании полученных результатов дали оценку роли АФК и АФА как эндогенных факторов, могущих влиять на установление симбиоза в условиях повышенных концентраций минерального азота.
Мы показали, что рост клубеньковых бактерий в культуре (in vitro) не нарушается даже при сверхвысоких дозах (до 60 мМ) минерального азота в среде культивирования. Однако дозозависимое ингибирование роста ризобий в культуре вызывает нитропруссид натрия - донор оксида азота (NO): на 58 и 23 % при концентрации нитропропруссида натрия 0,67 и 0,019 мМ соответственно, что составляет приблизительно 3,3 и 0,1 мкМ оксида азота. Концентрация нитропруссида натрия 2 мМ на 80% ингибирует проникновение ризобий в ткани корня проростков гороха и нарушает взаимодействие ризобий с корнями гороха, что выражается в уменьшении длины корневых волосков и в отсутствии инфекционных нитей в волосках (Митанова и др., 2006; Глянько и др., 2008).
Интерес к оксиду азота обусловлен также тем, что уже в ризосфере образование этой и других газообразных молекул азота может достигать значительного уровня, особенно при внесении азотных минеральных удобрений, подвергающихся действию почвенных денитрифицирующих и нитрифицирующих бактерий (Skibe et al., 1993). Поэтому отрицательное влияние оксида азота на клубеньковые бактерии может проявляться уже в ризосфере, что может лишать их (по нашим данным) способности к взаимодействию с бобовым растением. Негативное влияние оксид азота оказывает и на рост корней растения: ингибирование накопления сырой массы корней проростков гороха достигало 58% при концентрации нитропруссида натрия 2 мМ.
Нами впервые установлено, что клубеньковые бактерии усиливают поглощение растением-хозяином нитратного азота при повышенной его дозе в среде. Этим свойством не обладает бесклубеньковый мутант гороха (Митанова и др., 2006а). Подобное явление было также отмечено при действии на клетки табака элиситора патогенного гриба (Phytophtora cryptoged) - криптогейна (cryptogem), который вызывал усиление потока экзогенных нитратов в цитоплазму через анионные каналы, экспрессию защитных генов, генерацию АФК, модуляцию активности протеинкиназ, сверхчувствительную реакцию клеток табака и их гибель (Wendehenne et al., 2002). По мнению этих авторов, усиленный поток нитратов в цитоплазму через анионные каналы плазмы модулирует метаболизм растения, что ведет к активации сигнальных систем и модуляции обмена веществ.
Возможно, что подобный механизм характерен и для ризобиальной инфекции в условиях повышенных концентраций минерального азота в среде. Экспрессия защитных генов, в которой участвуют нитраты, может быть одной из причин негативного влияния повышенных доз минерального азота на установление симбиоза. Дальнейшее изучение механизма этого явления при бобово-ризобиальном симбиозе представляет несомненный интерес и прежде всего с точки зрения изучения функций тех сигнальных молекул, которые могут образовываться при превращении нитратов в клетке.
