Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Бактерии рода Azospirillum. Морфологические и физиологические особенности азоспирилл 11
1.2. Практическое использование бактерий рода AzospirШит. Механизмы воздействия на растения 14
1.3. Основные этапы ассоциативного взаимодействия 21
1.3.1. Хемотаксис 21
1.3.2. Прикрепление азоспирилл к корням растения 23
1.3.3. Деформации корневых волосков 28
1.3.4. Проникновение внутрь корня 30
1.4. Компоненты клеточной поверхности азоспирилл, участвующие во взаимодействии с растениями 32
1.5. Внеклеточные полисахариды и полисахаридсодержащие компоненты бактерий рода Azospirillum 43
1.5.1. Внеклеточные полисахариды 43
1.5.2. Липополисахарид-белковые и полисахарид-липидные комплексы 45
1.5.3. Липополисахариды азоспирилл 47
1.6. Физиологическая роль внеклеточных полисахаридов микроорганизмов 48
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Использованные штаммы азоспирилл и условия их культивирования 53
2.2. Растительные объекты 54
2.3. Приборы и материалы 54
2.4. Методы 55
2.4.1. Стерилизация зерновок пшеницы 55
2.4.2. Исследование адсорбции бактерий на корнях растений 55
2.4.3. Методы выделения полисахаридных комплексов азоспирилл 56
2.4.4. Изучение влияния М-ацетил-Б-глюкозамина, полисахаридсодержащих комплексов азоспирилл и лектина пшеницы на прикрепление бактерий к корням 58
2.4.5. Исследование деформации корневых волосков пшеницы под действием липополисахаридов, липополисахарид-белковых и полисахарид-липидных комплексов азоспирилл 59
2.4.6. Получениие бескапсульных клеток азоспирилл 60
2.4.7. Определение относительной гидрофобности клеточной поверхности азоспирилл 60
2.4.8. Методы исследования выживаемости капсулированных и бескапсульных бактериальных клеток в экстремальных условиях 61
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 63
3.1. Исследование закономерностей прикрепления бактерий рода Azospirillum к корням проростков пшеницы 63
3.1.1. Адсорбция азоспирилл в зависимости от времени контакта, возраста бактериальной культуры, концентрации клеток в инокуляте 63
3.1.2. Изучение прочности прикрепления азоспирилл к корням пшеницы 67
3.1.3. Штаммовые различия бактерий Azospirillum brasilense в способности к адсорбции на корнях и индукции деформации корневых волосков 69
3.1.4. Наблюдение колонизации азоспириллами корней пшеницы посредством световой микроскопии 75
3.2. Защитная роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы бактерий A. brasilense от действия неблагоприятных факторов 80
3.2.1. Устойчивость капсулированных и бескапсульных клеток A. brasilense Sp245 к действию экстремальных температур 81
3.2.2. Выживаемость азоспирилл при различных рН среды 85
3.2.3. Влияние высушивания на выживаемость бактериальных клеток 87
3.3. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы бактерий A. brasilense в процессах взаимодействия с корнями проростков пшеницы 91
3.3.1. Способность к адсорбции на корнях пшеницы капсулированных и бескапсульных клеток A. brasilense Sp245 91
3.3.2. Ингибирование адсорбции бактерий на корнях пшеницы N-ацетил-О-глюкозамином и полисахаридсодержащими компонентами капсулы 92
3.3.3. Деформации корневых волосков пшеницы, индуцированные полисахаридсодержащими комплексами капсулы азоспирилл, и ингибирование их 1М-ацетил-0-глюкозамином и хитотриозой 102
3.3.4. Влияние агглютинина зародышей пшеницы на эффективность адсорбции клеток A. brasilense 80 на корнях проростков пшеницы 104
3.4. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы 107
3.4.1. Сравнительное изучение способности исходного Sp245 и мутантного штамма КМ252, дефектного по структуре ЛПС, к адсорбции на корнях пшеницы 108
3.4.2. Активность ЛПС бактерий A. brasilense Sp245 и его мутантов в отношении морфологических изменений корневых волосков пшеницы 110
Заключение 113
Выводы 120
Список использованной литературы 122
- Практическое использование бактерий рода AzospirШит. Механизмы воздействия на растения
- Физиологическая роль внеклеточных полисахаридов микроорганизмов
- Наблюдение колонизации азоспириллами корней пшеницы посредством световой микроскопии
- Активность ЛПС бактерий A. brasilense Sp245 и его мутантов в отношении морфологических изменений корневых волосков пшеницы
Практическое использование бактерий рода AzospirШит. Механизмы воздействия на растения
Главный фактор, препятствующий интродукции Azospirillum в большом масштабе, - это непредсказуемость и непостоянство результатов. Эти недостатки известны с первых дней использования Azospirillum в качестве инокулята. Уже самые первые работы по инокуляции различных растений азоспириллами дали неоднозначные результаты. Значительная часть таких опытов не подтвердила положительного влияния инокуляции на урожай сельскохозяйственных культур (Barber et al., 1976; Barber et al., 1979). Однако, в ряде случаев был получен ощутимый эффект от применения Azospirillum sp.. В частности, было обнаружено увеличение урожая проса и кормовых трав соответственно на 21 и 18 %; последующие опыты подтвердили эти результаты и показали возможность более значительного влияния азоспирилл на продуктивность этих культур (прибавка урожая составила 11-34 %) (Smith et al., 1976; Smith et al., 1978). Дальнейшие многочисленные эксперименты были связаны главным образом с изучением влияния Azospirilum sp. на урожай основных зерновых культур - пшеницы, ячменя, риса, сорго, проса, кукурузы. Как правило, увеличение урожая не превышало 25 % (Kapulnik et al., 1981; Boddey and Dobereiner, 1982; Smith et al., 1984), но имеются данные об увеличении урожая и общего азота в урожае на 20-60 % и даже более чем на 100 % (Boddey and Dobereiner, 1982; Baldani et al., 1983; Mertens and Hess, 1984). В то же время сообщалось о незначительном положительном эффекте инокуляции или отсутствии такового и даже 0 некотором снижении урожая и содержания общего азота (Albrecht et al., 1981; Boddey and Dobereiner, 1982; Smith et al., 1984).
И все же оценка данных полевых экспериментов за последние 20 лет показала, что 60-70 % всех экспериментов были удачными со значительным повышением урожая в пределах от 5 до 30 %. Наиболее важными факторами являлись применение жизнеспособных клеток и правильная организация экспериментов (Okon and Labandera-Gonsales, 1994; Окоп and Itzigsohn, 1995). Клетки должны отбираться с экспоненциальной фазы роста предпочтительнее, чем со стационарной фазы (поскольку такие бактерии лучше выживают в почве) (Vandenhove et al., 1993). Природная бактериальная микрофлора и штаммы A. lipoferum оценивались по способности к стимуляции роста подсолнечника в тепличных экспериментах. Было отмечено, что больший ростовой отклик вызывали 2 штамма Azospirillum lipoferum и 1 штамм Xanthomonas maltophilla (Fages and Arsac, 1991). Влияние инокуляции A. brasilense на рост и урожай Sorghum bicolor в гидропонной системе выразилось в значительном увеличении содержания сухого вещества, развития листовой поверхности и урожая зерна, причем наступление последней стадии развития растения - стадии увядания листьев, у инокулированных растений было задержано (Sarigetal., 1990). В полевых экспериментах в Аргентине для пшеницы, инокулированной A. lipoferum, было отмечено удвоение количества зерен в колосе, повышение сухого веса зерна на 59 % и значительное стимулирование развития корней (Fulchieri and Frioni, 1994). Существенное влияние на рост и урожай маиса было обнаружено при определенной комбинации растение-бактерии и отсутствовало при другой, демонстрируя взаимосвязь между генотипом растения и бактериальным штаммом (Garcia de Salomone and Dobereiner, 1996). Данное явление нашло отражение и в работах других исследователей с инокуляцией горчицы и пшеницы (Kesava Rao et al., 1990; Bhattarai and Hess, 1993).
Интересны сообщения о положительном влиянии инокуляции растений азоспириллами на фоне минерального азота (Chela et al., 1993; Zaady et al., 1994). Одним из условий повышения продуктивности сельскохозяйственных культур при инокуляции Azospirillum sp. является внесение средних доз азотных удобрений (Smith et al., 1976; Smith et al., 1984). Урожай сахарного тростника, инокулированного азоспириллами на фоне удобрения с низким содержанием азота, был более высоким, чем урожай только инокулированных, неинокулированных или только удобренных растений. Инокуляция заменяла до 60 % требуемого азотного удобрения (Macalintal and Urgel, 1992). Подобный эффект был отмечен и в экспериментах с инокуляцией пшеницы и подсолнечника бактериями A. brasilense и A. lipoferum (Del Gallo et al., 1991; Itzigsohn et al., 1995). В ряде опытов был получен одинаковый результат от инокуляции при всех уровнях минерального азота (Reynders and Vlassak, 1982), а в некоторых случаях эффект возрастал с увеличением количества внесенного в почву азота удобрений (Smith et al., 1976). Таким образом, широкомасштабная инокуляция азоспириллами может представлять средство повышения сельскохозяйственной продукции без использования экологически неблагоприятных удобрений.
Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению взаимодействия растений с ассоциированными азотфиксирующими и ростстимулирующими бактериями, до сих пор не удается надежно прогнозировать реакцию растений на инокуляцию, которая может варьировать от положительной или нейтральной до отрицательной (Майорова с соавт., 1986; Kloepper et al., 1989). Одним из важных факторов, обусловливающих активность интродуцируемых бактерий, является их взаимодействие с аборигенными микроорганизмами, поскольку интродуценты в природных условиях находятся в постоянном контакте с пулом почвенной микрофлоры (Белимов с соавт., 1998). Известно, что целый ряд азотфиксирующих и ростстимулирующих бактерий родов Pseudomonas (Suslov and Schroth, 1982), Azotobacter (Lakshmi-Kumari et al., 1972), Azospirillum (Redkina, 1990), Flavobacterium (Шенин с соавт., 1996) являются антагонистами по отношению к фитопатогенным микроорганизмам. С другой стороны, многие ризосферные бактерии в условиях жесткой конкуренции за субстрат в виде корневых выделений продуцируют антибиотики и другие ингибиторы роста микроорганизмов (Артишевская с соавт., 1978; Ковров с соавт., 1981; Suslov and Schroth, 1982). Результаты экспериментов in vitro показали, что диазотрофы p. Azospirillum были высокочувствительны к различным антибиотикам (Omar et al., 1992), и их рост существенно ингибировался метаболитами многих ризосферных актиномицетов, грибов (Kulinska and Drozdowicz, 1983), а также азотобактера (Jaskowska, 1987). Быстрое уменьшение численности штамма Azospirillum brasilense Cd на корнях пшеницы (Bashan, 1986а) и кукурузы (Fallik and Okon, 1988), связанное со слабой способностью интродуцента конкурировать с ризосферной микрофлорой, приводило к снижению эффективности инокуляции.
Проблема непоследовательности результатов инокуляции Azospirillum послужила толчком для появления новых исследований, связанных с использованием совместной инокуляции Azospirillum с другими микроорганизмами. Литература, посвященная данной тематике, достаточно обширна. Так, в лабораторных экспериментах было показано, что комбинированная инокуляция A. lipoferum с фосфат-растворяющими бактериями Agrobacterium radiobacter или Arthrobacter mysorens способствовала значительному повышению урожая зерна ячменя, а полевые испытания с тремя сортами ячменя подтвердили вывод о том, что инокуляция смешанной культурой превосходит инокуляцию отдельными культурами (Belimov et al., 1995а, 1995b). Как было показано Андреевой с соавторами (Андреева с соавт., 1993), эффект от двойной инокуляции бобовых Azospirillum и Rhizobium был более значительным по сравнению с инокуляцией бактериями какого-либо одного штамма. Авторы объясняют это стимулированием азоспириллами клубенькообразования, функционирования клубенька и, возможно, метаболизма растения. Фитогормоны, продуцируемые Azospirillum, способствуют эпидермально-клеточной дифференциации в корневых волосках, что повышает число потенциальных сайтов для ризобиальной инфекции (Yahalom et al., 1990, 1991). Как результат, формируется больше клубеньков. В полевых экспериментах на чечевице инокуляция смешанной культурой Azospirillum и Rhizobium повышала общее число клубеньков, сухой вес клубенька, значительно увеличивала урожай зерна и соломы (Yadav et al., 1992). Сходные результаты получены для турецкого гороха (Del Gallo and Fabbri, 1991; Fabbri and Del Gallo, 1995) и люцерны (Hassouna et al., 1994). Совместное культивирование A. brasilense Cd и R. leguminosarum bv. phaseoli приводило к коагрегации бактерий двух штаммов и продукции больших флокул. Инокуляция бобовых смешанными флокулами выразилась в увеличении нодуляции и роста растений (Neyra et al., 1995). Однако, опубликованы данные и об отсутствии положительного влияния комбинированной инокуляции Rhizobium и Azospirillum на растения земляного ореха (Raverkar and Konde, 1990) и на бобовые (Kundu et al., 1993). Интересны результаты, полученные при смешанной инокуляции Azospirillum с везикулярно-арбускулярными микоризными грибами Glomus sp. Так, наблюдалось изменение морфологии корней клубники (Bellone and de Bellon, 1995), повышение веса проростков и корней пшеницы (Gori and Favilli, 1995), а также урожая зерна и соломы при инокуляции семян различных генотипов пшеницы (Singh et al., 1990). При инокуляции сорго было обнаружено повышение многих параметров роста растений, увеличение содержания фосфора в растениях и улучшение поглощения азота, цинка, меди и железа (Veeraswamy et al., 1992). Авторы считают, что такая двойная инокуляция может заменить применение азотных и фосфорных минеральных удобрений. В заключении следует сказать, что совместная инокуляция Azospirillum с другими микроорганизмами - одна из наиболее передовых технологий в сельском хозяйстве.
Несмотря на многочисленные исследования, механизм стимулирующего влияния азоспирилл на растения не вполне ясен. Считают, что эффективность ассоциаций растений с азоспириллами определяется такими характеристиками бактерий, как способность к азотфиксации (Sarig et al., 1986), продукции фитогормонов (Barbierio et al., 1986; Harari et al., 1988; Fallik et al., 1989; Iosipenko and Ignatov, 1995; Patten and Glick, 1996) и нитрита (Zimmer et al., 1988), накоплению железа (Barton et al., 1986; Rai, 1988), а также улучшению минерального питания (Lin et al., 1983; Kapuknik et al., 1985a; Song et al., 1990; Stancheva et al., 1995) и водного баланса инокулированных растений (Sarig et al, 1988).
Физиологическая роль внеклеточных полисахаридов микроорганизмов
На основании обширного экспериментального материала, накопленного к настоящему времени, с определенностью можно сказать, что физиологическое значение экзополисахаридов заключается в создании и поддержании благоприятных для микроорганизмов условий обитания (Экологическая роль микробных метаболитов, 1986).
ВПС, благодаря своей гидрофильности, длительное время удерживают воду, сохраняя жизнеспособность клеток, что особенно важно для почвенной и эпифитной микрофлоры засушливых районов (Горин с соавт., 1979). Капсульные гликаны ряда почвенных бактерий обеспечивают выживание их продуцентов, предохраняя клетки от поглощения амебами (Блинов и Аркадьева, 1965). Имеются наблюдения, свидетельствующие о большей радиорезистентности инкапсулированных клеток по сравнению с клетками, лишенными капсулы (Громов, 1985). Сохранение жизнеспособности клеток микроорганизмов в условиях ультрафиолетового (УФ) облучения может быть также обусловлено защитным действием экзогликанов. Таким действием обладают экзогликаны Bacillus muscilaginosus, Schigella flexneri, серотипы Klebsiella, Mycobacterium lacticolum 121, Escherichia coli (Милевский, 1966; Donch, Greenberg, 1970; Егоров с соавт., 1978).
Также изучалась устойчивость мутантных штаммов Acinetobacter sp., не образующих ЭПС, к неблагоприятным факторам: действию формальдегида, додецилсульфата натрия, тяжелых токсичных металлов Си , Сг и УФ-обработке (Пирог с соавт., 2000). Было показано, что УФ-обработка не приводила к гибели клеток исходного штамма, в то время как количество жизнеспособных клеток мутантных штаммов в аналогичных условиях снижалось на 40-80 %. Клетки ЭПС-мутантов и клетки исходного штамма, освобожденные от ЭПС, характеризовались одинаковой устойчивостью к действию неблагоприятных факторов и процент живых клеток был значительно ниже, чем у исходного штамма. Однако, не удалось выявить защитную функцию ЭПС по отношению к тяжелым металлам, результаты свидетельствовали о наличии у этих бактерий, кроме синтеза ЭПС, других механизмов устойчивости к тяжелым металлам. Приведенные результаты подтвердили полученные ранее данные о защитных функциях ЭПС Acinetobacter sp. по отношению к клеткам продуцента (Пирог, 1997; Пирог с соавт., 1997).
Следует отметить, что в литературе практически отсутствуют сведения о возможной роли ЭПС как фактора, регулирующего уровень изменчивости микробной популяции. Обсуждалось участие ассоциированного с клетками полисахарида эмульсана в устойчивости штаммов Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 к фагам ар-2 и ар-3. Полученные мутанты, устойчивые к одному из фагов, сохраняли устойчивость к другому, причем устойчивость к фагу ар-3 сопровождалась снижением синтеза эмульсана (Pines and Gutnick, 1981). Мутанты RAG-1, дефектные по синтезу ЭПС, также оказывались устойчивыми к фагам (Gutnick et al., 1981). Авторы предполагают, что эмульсан принимает участие в адсорбции фага, а устойчивость к фагам обусловлена неспособностью его адсорбироваться на поверхности клетки. Результаты недавних исследований свидетельствуют о том, что ЭПС может являться одним из факторов, обеспечивающих генетическую стабильность штамма-продуцента (Пирог с соавт., 2000). В пользу такого вывода авторы приводят тот факт, что в течение 15 лет использования штамма-продуцента этаполана в лабораторных и опытно-промышленнных условиях не наблюдали изменчивости и фаголизиса клеток.
Чрезвычайно разнообразны формы участия ВПС в удовлетворении трофических потребностей клеток продуцентов. Наиболее простой из них является способность микроорганизма использовать собственный гликан. Такая способность была обнаружена у Mycobacterium lacticolum 121, отдельных видов Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas и некоторых других микроорганизмов (Егоров с соавт., 1978; Мальцева, 1981). ВПС некоторых микроорганизмов способны предохранять экзоферменты продуцентов от протеолитической деградации и других дестабилизирующих внешних воздействий (Заикина с соавт., 1970). Например, ЭПС Arthrobacter citreus стимулировал активность экзопротеаз Nocardia sp. (Егоров с соавт., 1982), а внеклеточный гликан Mycobacterium lacticolum 121 в 2 раза повышал термостабильность щелочной протеазы, выделенной из Actinomyces sp. (Гоголева, 1976). Механизм протекторного действия экзогликанов, вероятно, заключается в образовании устойчивого гликопротеинового комплекса (Заикина с соавт., 1970).
Экзогликан, образуемый углеводородокисляющей бактерией Acinetobacter calcoaceticus, действуя как поверхностно-активное вещество, эмульгирует нерастворимые в воде углеводороды и делает их доступными для клетки (Goldman et al, 1982). ВПС морских псевдомонад, обладая свойством ионообменников, адсорбируют из окружающей среды органические и неорганические ионы, концентрируя их вокруг клеток микроорганизмов, что обеспечивает им преимущество в условиях пониженной концентрации питательных веществ (Sutherland, 1972). Благодаря экзогликанам, многие морские и пресноводные бактерии прикрепляются к твердым поверхностям - осадку, детриту и т.д. Прикрепление к субстрату обеспечивает быстрое размножение бактерий и способствует выживанию популяции в олиготрофных условиях (Ellwood et al., 1982).
Установлено, что ЭПС не только участвуют в механическом прикреплении микроорганизмов к клеткам макроорганизмов, но и обеспечивают безошибочное узнавание клеток хозяина. Такое узнавание лежит в основе инфекционных процессов и симбиотических отношений между макро- и микроорганизмами. К примеру, вирулентность представителей родов Xanthomonas, Erwinia, Flavobacterium и Pseudomonas определяется образованием ими ВПС и его специфической реакцией с ПС клеточных стенок растения-хозяина (Ayers et al., 1979; Матышевская, 1980; Dolph et al., 1988). Строгая специфичность в отношении растения-хозяина, проявляемая различными видами Rhizobium, обусловлена химической уникальностью их капсул. Капсульные гликаны взаимодействуют с лектинами корневых волосков или семян бобовых растений по принципу антиген-антитело (Dazzo and Brill, 1979; Tsien and Schmidt, 1981). Даже незначительное изменение в составе КПС ведет к неспособности ризобий реагировать с лектинами. R. japonicum теряет активность в отношениии растения-хозяина при появлении в капсулах 4-0-метил-галактозы вместо галактозы, что наблюдается при старении культуры (Mort and Bauer, 1980). У других видов Rhizobium лектин-связывающая способность коррелирует с количеством ацетильных и пирувильных групп в экзогликанах (Cadmus et al., 1982). Таким образом, обеспечивая специфическую реакцию с лектинами, ЭПС лежат в основе образования симбиотических сообществ ризобий с бобовыми растениями. Подробнее роль бактериальных ПС в процессах взаимодействия с растениями рассматривалась выше.
Существует еще один аспект физиологической роли ВПС - являясь потенциально ценным питательным субстратом, они могут обеспечивать развитие не только самому продуценту, но и сопутствующей микрофлоре (Егоров с соавт., 1978; Косенко и Мальцева, 1981). Особенно важны с этой точки зрения экзогликаны, образуемые автотрофными, азотфиксирующими и олиготрофными микроорганизмами. Обеспечивая развитие сопутствующей микрофлоры с более высокими трофическими потребностями, ВПС этих микроорганизмов играют определенную роль в образовании и поддержании стабильности природных экосистем (Экологическая роль микробных метаболитов, 1986).
Для бактерий рода Azospirillum также неоднократно сообщалось о защитной роли ВПС. Отмечалось, что при различных неблагоприятных условиях азоспириллы способны к формированию цист и флокул (клеточных агрегатов), что способствует их выживанию (Bashan and Holguin, 1997). Эти явления могут быть вызваны старением (Sadasivan and Neyra, 1987), условиями культивирования (Bleakley et al., 1988), наличием токсических металлов (Gowri and Srivastava, 1996) или водным стрессом (Bashan et al., 1991a). Об обнаружении полисахаридов в составе агрегатов бактерий, образованных при флокуляции сообщалось неоднократно (Sadasivan and Neyra, 1985; Del Gallo et al., 1989; De Troch et al., 1992).
Было показано, что цистированные клетки азоспирилл, богатые ПГБ, лучше сохраняются (Zaady et al., 1993; Assmus et al., 1995), обладают большей устойчивостью к высыханию, осмотическому шоку и действию ультрафиолета (Das and Mishra, 1984; Таї and Okon, 1985). Сообщалось, что предпочтительной формой инокуляции являлась инокуляция клеточными агрегатами (Zaady et al., 1993; Neyra et al., 1995). Вероятно, формирование агрегатов позволяет бактериям в большем количестве накапливаться на поверхности корней, а также способствует выживанию их при неблагоприятных условиях.
Достаточно часто инокуляция проводится в неоптимальных для роста растений условиях, например, в засушливых районах, что ассоциируется с повышенной засоленностью почвы. Поэтому большой интерес вызывают работы, связанные с исследованием влияния солевого стресса на выживаемость азоспирилл в почве и колонизацию корней (Jofre et al., 1998). Сообщалось, что у бактерий p. Azospirillum толерантность по отношению к высоким концентрациям NaCl, сахарозе или полиэтиленгликолю повышалась в ряду: A. amazonense, A. lipoferum, A. brasilense и A. halopraeferens (Hartmann et al., 1991). Было показано, что в условиях осмотического стресса инокуляция азоспириллами способствовала уменьшению увядания листьев у растений сорго (Sarig et al., 1990), а также росту проростков пшеницы (Alvarez et al., 1996).
Наблюдение колонизации азоспириллами корней пшеницы посредством световой микроскопии
Паралельно с изучением прикрепления азоспирилл к корням пшеницы с помощью косвенных методов (посев серийных разведений гомогената корней на твердые питательные среды) мы проводили исследование колонизации корней и прямыми методами. Наблюдения с помощью световой микроскопии показали, что изучаемые нами бактерии A. brasilense 75 и 80 активно колонизируют корневую поверхность пшеницы (рис. 6а). С течением времени количество прикрепившихся клеток увеличивается, что подтверждает полученные нами ранее данные количественного анализа.
Было замечено, что бактерии распределяются по корневой поверхности неравномерно. Больше бактерий обнаруживалось на кончике корня (рис. 66), в зоне элонгации и в местах соединения корневых волосков с поверхностью корня (рис. 7а). На корневых волосках бактериальные клетки встречались реже, иногда поверхность корневых волосков была свободна от бактерий. Клетки располагались вдоль корневого волоска в беспорядке, без группирования предпочтительно в какой-либо его части (рис. 76). В некоторых случаях бактериальные скопления обнаруживались около кончика корневого волоска, а также встречались корневые волоски, густо заселенные бактериями, причем количество таких волосков при длительном совместном инкубировании (24, 48 ч) увеличивалось (рис. 8а, б; 9а, б). Характер распределения адсорбированных клеток A. brasilense 75 и 80 на корнях проростков пшеницы согласуется с данными по адсорбции других штаммов A brasilense, представленными в работах ряда исследователей (Okon and Kapulnik, 1986; Bashan and Levanony, 1989).
Итак, в этом разделе нами исследованы некоторые закономерности в процессе прикрепления азоспирилл к поверхности корней растения, что может быть полезным при планировании экспериментов по инокуляции пшеницы бактериями р. Azospirillum. Скрининг различных почвенных ризосферных бактерий на способность колонизировать корни растений включает интродукцию исследуемых штаммов и проведение длительных полевых экспериментов. Поскольку развитие растения требует значительного времени, такие эксперименты могут занимать недели и месяцы. В связи с этим, быстрые испытания, которые предсказывают колонизацию корней, могут быть ценным инструментом в исследовании факторов и процессов, вовлеченных в колонизацию, еще до того, как начаты работы по интродукции бактерий в почву.
Активность ЛПС бактерий A. brasilense Sp245 и его мутантов в отношении морфологических изменений корневых волосков пшеницы
Как сообщалось ранее, эффект деформации индуцируется индолилуксусной кислотой - ростовым гормоном, продуцируемым азоспириллами (Jain and Patriquin, 1985), а также ПС-содержащими комплексами, локализованными в капсульном материале и поступающими в окружающую среду в процессе роста бактерий (Коннова с соавт., 1995). Влияние ЛПС азоспирилл на корневую систему злаков практически не исследовано.
В работе использовали препараты ЛПС1 исходного A. brasilense Sp245 и ЛПС2 и ЛПСЗ мутантных (КМ252, КМ018) штаммов, предоставленные сотрудниками группы биоорганической химии ИБФРМ РАН. ЛПС были выделены из наружной мембраны исследуемых бактерий экстракцией горячим 45 %-м фенолом (Федоненко с соавт., 2000). Существенных различий в биополимерном составе ЛПС исходного и мутантных штаммов авторами не обнаружено. Однако, ЛПС различались по количеству гексадекановой и октадеценовой кислот. Показано наличие в составе ЛПС A. brasilense Sp245 двух О-ПС: нейтрального и кислого, в то время как ЛПС мутантного штамма КМ018 содержал только кислый 0-ПС1, а КМ252- только нейтральный 0-ПС2. Дефектность мутантных штаммов по синтезу полисахаридных субъединиц ЛПС была подтверждена данными электрофоретического и иммунохимического анализов (Федоненко с соавт., 2000).
Препараты ЛПС1, ЛПС2 и ЛПСЗ в концентрации 0,125 мкг/мл добавляли в минеральную среду, где выращивали проростки. Концентрация комплексов выбрана в соответствии с проведенными ранее экспериментами с ЛПБК и ПСЛК. Наблюдения показали, что препараты ЛПС бактерий A. brasilense способны индуцировать деформации корневых волосков проростков пшеницы, однако эффект, вызванный ЛПС2 и ЛПСЗ мутантных штаммов, был значительно ниже, чем под действием ЛПС1 исходной культуры (рис. 18). Добавление в среду выращивания проростков ЛПС1 увеличивало количество деформаций корневых волосков на 133 % по сравнению с контролем (без ЛПС), ЛПС2 на 44 %, а ЛПСЗ на 26 %. Таким образом, активность ЛПС мутантных штаммов была снижена.
Молекулярный механизм процесса деформаций корневых волосков пока не выяснен. Предполагается, что он включает в себя цепь реакций, одним из звеньев которой может быть взаимодействие рецепторов, находящихся на поверхности корней, с ПС-содержащими комплексами или их составляющими, локализованными на поверхности бактерий (Коннова с соавт., 1995). Как уже сообщалось, ЛПС бактериальной мембраны не участвует во взаимодействии с агглютинином зародышей пшеницы. Приобретает ли ЛПС такую способность при выделении из мембраны или при попадании в капсульный материал, предстоит выяснить в ходе дальнейших исследований.
Таким образом, на основании полученных результатов можно предположить, что изменения в составе ЛПС наружной мембраны A. brasilense Sp245, как результат инсерции омегона в плазмиду 120-МДа (Katzy et al., 1998), привели у мутантных штаммов к снижению биологической активности в отношении корней проростков пшеницы. Представленные выше данные позволяют предположить, что липополисахариды азоспирилл, вероятно, принимают участие на начальных этапах взаимодействия бактерий p. Azospirillum с корнями растений.
