Содержание к диссертации
стр.
Список сокращений 7
Введение 8
Глава 1. Обзор литературы 14
-
Рост-стимулирующие ризобактерии p. Azospirillum — модельный объект в исследованиях эффектов ассоциативности 14
-
Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий 18
1.2.1. Липополисахариды как мажорные компоненты наружной
мембраны грамотрицательных бактерий 22
-
Структурам функции ЛПС 22
-
Характеристика основных структурных элементов
ЛПС 27
»
-
ЛПС как соматический антиген 30
-
Методы исследования иммунохимической специфичности ЛПС 34
-
Физико-химические свойства ЛПС 38
-
Изменения антигенных свойств ЛПС 40
-
Гетерогенность ЛПС 41
-
Изменения ЛПС при R-S диссоциации бактериальных культур 44
-
Капсульные полисахариды 47
-
Бактериальный жгутик 50
-
Строение бактериальных жгутиков 51
-
Жгутик как Н-антиген 52
-
Гликозилирование полярного жгутика 53
-
Выявление чехла на поверхности полярного
жгутика 56
-
Роль поверхностных структур микроорганизмов в растительно-микробных взаимодействиях 58
-
Роль углеводных компонентов наружной мембраны в процессах бактериальной агрегации 63
-
Иммунохимические подходы в исследовании поверхности почвенных бактерий 67
-
Детектирование и идентификация бактерий в природной среде 67
-
Серологические исследования диазотрофов 69
-
Перспективы серологического анализа азоспирилл 72
1.6. Формулировка задач исследования 75
Глава 2. Материалы и методы исследования 79
-
Бактериальные штаммы, условия выращивания бактерий и использованные реактивы 19
-
Иммунизация животных и получение антител 82
-
Иммунизация животных целыми бактериальными клетками 82
-
Иммунизация животных изолированными препаратами ЭПС 83
-
Иммунизация животных изолированным препаратом
ЛПС 83
-
Иммунизация животных мономерами флагеллина полярного жгутика 83
-
Получение антител 84
-
Реакция агглютинации 84
-
Препараты углеводных антигенов 85
-
Получение препаратов полярного жгутика 86
-
Изучение подвижности бактериальных клеток 87
-
Двойная иммунодиффузия 87
-
Иммуноэлектрофорез 88
2.9. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и
иммуноблоттинг , 89
-
Дот-анализ целых клеток и иммуноэлектронная микроскопия.... 89
-
Иммуноферментный анализ (вариант ELISA) 90
-
Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных эпитопов бактерий 90
-
Определение иммунохимической активности О-специфического
полисахарида с применением метода спектротурбидиметрии.. .91
-
Исследование агрегации клеток в супензиях 92
-
Исследование агглютинации эритроцитов и фазового разделения их суспензий под действием ЛПС-содержащих препаратов азоспирилл 93
2.16 Радиоиндикаторный анализ 94
Глава 3. Разработка способа получения моноспецифических антител на
О-антигены и модификация способа выделения высокоочищенных
препаратов ЛПС 96
3.1. Разработка способа получения моноспецифических антител на
ЛПС 96
-
Оценка эффективности иммунизации животных целыми бактериальными клетками, обработанными бифункциональным реагентом 96
-
Обсуждение возможного механизма ингибирования глутаро-вым альдегидом иммунного ответа на нативные белковые поверхностные антигены 103
3.2. Модификация способа получения высокоочищенных препаратов
ЛПС 106
Глава 4. Иммунохимический анализ ЛПС модельных штаммов Azospirillum
brasilense Ill
4,1. Анализ строения О-антигенных детерминант типового штамма
A. brasilense Sp7 111
4.2. Исследование нетипичного характера R-S диссоциации штамма
A. brasilense Sp7 118
4.3. Исследование иммунохимической гетерогенности ЛПС
азоспирилл 131
4.3.1. Исследование иммунохимической гетерогенности О-
специфических полисахаридов штамма^, brasilense
Sp245 131
-
Изменение антигенных свойств О-специфических полисахаридов штамма A brasilense Sp245 при модификации условий культивирования 139
-
Исследование иммунохимической гетерогенности О-специфических полисахаридов штамма A. brasilense Sp7 и близкородственных штаммов 143
Глава 5. Сравнительный иммунохимический анализ ЛПС, капсульных
полисахаридов и экзополисахаридов Azospirillum brasilense 153
Глава 6. Изучение Н-антигенов Azospirillum brasilense 162
-
Выявление полисахаридного чехла на поверхности полярного жгутика 162
-
Исследование углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика 165
-
Получение и анализ антител на флагеллин A. brasilense Sp7 171
-
Исследование изменений подвижности клеток азоспирилл при взаимодействии с антителами к О- и Н-антигенам 173
Глава 7. Характеристика некоторых физико-химических свойств ЛПС
азоспирилл 177
-
Сравнение спектрофотометрических характеристик ЛПС различных серотипов 177
-
Оценка структурообразующих эффектов бактериальных липополисахаридов в клеточных суспензиях азоспирилл и модельных клеточных суспензиях 179
Глава 8. Тест-система серологической идентификации бактерий
p. Azospirillum 195
Заключение 205
Выводы 211
Список использованных источников 214
Список сокращений
Аг - антиген
АЗП - агглютинин зародышей пшеницы
Ат - антитела
БСА - бычий сывороточный альбумин
В ПС - внеклеточный полисахарид
ГА — глутаровый альдегид
ДСН - додецилсульфат натрия
ЗФР — забуференный физиологический раствор
ИФА - иммуноферментный анализ
КПС - капсульный полисахарид
ЛПБК - липополисахарид-белковый комплекс
ЛПС - липополисахарид
ЛСБ - липополисахарид-связывающий белок
О-ПС - О-специфический полисахарид
ПААГ - полиакриламидный гель
ПСЛК - полисахарид-липидный комплекс
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин
ТРИС - трис(гидроксиметил)аминометан
ФМСФ - фенилметансульфонилфторид
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПС - экзополисахарид
ELIS A — enzyme linked immunosorbent assay, фермент-зависимый
иммуносорбционный анализ HEPES - N-2-гидрокси-этилпиперазин- N-2-этансульфоновая кислота TLR - Toll-like рецепторы
Введение к работе
Бактериальная поверхность представляет собой сложную комбинацию иммуногенных компонентов, и точное устройство этой антигенной мозаики часто зависит от условий культивирования организма, так же, как и от его генетического потенциала. Это не статичная, строго очерченная химическая структура, ее состав может являться отражением условий, в которых организм обнаруживается в какое-то определенное время (Freer, 1985).
Понимание свойств поверхности требуется для адекватного контроля над такими процессами, как бактериальная адгезия, адсорбция и клеточное разрушение. Изучение поверхностных структур, вовлеченных в контактные взаимодействия микроорганизмов с растениями, обоснованно занимает одно из центральных мест в проблеме микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета растений (Dazzo and Brill, 1979; Kato et al., 1980; Noel, 1992; Smit et al, 1987, 1989; 1992; Hrabak et al, 1981; Whatley et al, 1976; Matthysse et al, 1981; Newman et al., 2000 и др.). Компоненты клеточной поверхности рассматриваются также в качестве важных хемотаксономических маркеров для идентификации и классификации бактерий (Hancock and Poxton, 1988).
Хорошую перспективу при исследовании данных бактериальных структур имеют подходы с применением методов иммунохимии (Кэбот и Мейер, 1968; Кульберг, 1985; Kabat, 1976; Westphal et al, 1983). Перспективность подобных приемов определяется, среди прочих, двумя предпосылками. Во-первых, высокой селективностью и чувствительностью определения разнообразных органических соединений в реакциях типа антиген+антитело (Аг+Ат). Во-вторых, достаточной обоснованностью предположения о том, что иммуногенные компоненты клеточной поверхности исследуемых микроорганизмов могут оказаться достаточно активными также и при их взаимодействии с клетками растительных партнеров. Однако число работ с использованием подобных подходов при
9 исследовании представителей почвенной микрофлоры ко времени начала наших исследований было сравнительно невелико. В том числе это касалось бактерий p. Azospirillum, которые, благодаря их способности увеличивать продуктивность сельскохозяйственных растений (Dobereiner and Day, 1976), на протяжении последних трех десятилетий являются модельным объектом в исследовании феномена растительно-микробной ассоциативности. Отчасти такое положение объяснялось, по-видимому, недостаточной развитостью для этих микроорганизмов соответствующей методологии, которая позволяла бы не только определять те или иные антигенные детерминанты в составе клеток, но и исследовать особенности структурной организации основных антигенов и оценить их вклад в общее строение клеточной поверхности.
В первую очередь сказанное можно отнести к основным антигенам бактериальной поверхности: соматическому (О-антиген), жгутиковому (Н-антиген) и капсульному (К-антиген). Изучение деталей строения этих важнейших бактериальных структур представляет фундаментальный интерес, поскольку даёт возможность выяснить, как в целом организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие знания необходимы для создания биоспецифических зондов при экологических и таксономических исследованиях азоспирилл.
Среди перечисленных мажорных антигенов бактериальной поверхности особый интерес представляет липополисахарид (ЛПС) или О- антиген. Строение О- специфического полисахарида (О-ПС) определяет иммунохимическую специфичность микроорганизмов, что служит основой для их надежной внутривидовой классификации (Staub et al.y 1959; Westphal et al., 1983). Данные углеводные структуры относят к важным детерминантам, участвующим в процессах молекулярного «узнавания» при формировании ассоциативных ризосферных ценозов и адсорбции бактерий на корнях растений (Коннова с соавт., 1995; Федоненко с соавт., 2001), В этой связи представляют интерес сведения о степени гетерогенности и о химическом строении и локализации углеводных антигенных детерминант
10 (эпитопов), позволяющие судить об «архитектуре» поверхности клеток азоспирилл. Кроме того, несомненный интерес представляют результаты сравнения иммунохимической специфичности соматических и капсульных полисахаридов данных бактерий, на основании которых можно делать вывод о наличии или отсутствии индивидуального капсульного антигена у бактерий p. Azospirillum, что является принципиально важным фактом при построении системы серологической классификации данных бактерий.
В связи с обнаружением факта гликозилированности флагеллина полярного жгутика у различных бактерий (Doig et ah, 1996; Brimer and Montie, 1998; Wyss, 1998 и др.) стало очевидным, что спектр углеводных антигенов бактериальной поверхности может быть расширен за счет углеводных компонентов Н- антигена. В связи с этим большой интерес, на наш взгляд, представляет выяснение иммунохимической специфичности углеводных структур, выявленных в составе полярного жгутика азоспирилл (Moens et al.t 1995), и ее сравнение с иммунохимическими характеристиками ЛПС и капсульных полисахаридов.
Сказанное выше свидетельствует об актуальности темы данной диссертационной работы. Ее целью явилось изучение углеводных антигенов почвенных бактерий p. Azospirillum и оценка их вклада в архитектуру клеточной поверхности исследуемых бактерий. Нами впервые была выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических полисахаридов азоспирилл, сопровождающаяся отсутствием у данных бактерий индивидуального капсульного антигена и оценен вклад отдельных О-специфических полисахаридов в формирование капсульного и экзополисахаридного слоя. Описан новый характер микробной R-S диссоциации, обусловленной изменяющимся вкладом двух О-антигенов в архитектуру клеточной поверхности в зависимости от возраста культуры. Впервые с использованием оригинального подхода на основе спектротурбидиметрического анализа получены данные о моносахаридном составе эпитопов и серотипе типового штамма A. brasilense Sp7. Обнаружено, что разные О-специфические полисахариды, определяющие гетерогенность * ЛПС азоспирилл, могут отличаться по способности к антигенной модификации, являющейся результатом изменений условий выращивания бактерий на лабораторных средах. У модельных штаммов A. brasilenseвпервые выявлено наличие прочно связанного чехла (липо)полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика. Установлено, что углеводные фрагменты гликозилиро ванного флагеллина полярного жгутика типового штамма A. brasilense Sp7 антигенно идентичны одному из двух О- специфических полисахаридов соматического антигена. С учетом выявленной идентичности антигенных детерминант капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и липополисахаридов азоспирилл, это позволяет предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещивающихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий рода Azospirillum. Впервые систематизированы структурообразующие свойства ЛПС азоспирилл в клеточных суспензиях.
Практическая значимость работы заключается, прежде всего, в том, что на примере решения конкретных задач изучения поверхности азоспирилл в работе продемонстрирована высокая эффективность развитой методологии комплексного иммуноанализа как средства, позволяющего получать информацию о тонких деталях структурной организации клеточной поверхности почвенных бактерий. Полученные данные, характеризующие особенности антигенного строения клеточной поверхности азоспирилл, могут способствовать разработке адекватных представлений о механизме ассоциативных взаимоотношений между растениями и почвенной микрофлорой. Выполненная в работе идентификация Оспецифического полисахарида, гомологичного по составу основным внеклеточным структурам A. brasilense, обеспечивает целенаправленный поиск эффективных биоспецифических зондов при проведении цитохимических, таксономических и экологических исследований азоспирилл. Предложен эффективный способ иммунизации животных целыми клетками,
12обработанными глутаровьш альдегидом, обеспечивающий получение ь моноспецифических антител на бактериальные ЛПС, демонстрирующих штаммовую специфичность, и создана биотест-система серологической идентификации бактерий p. Azospirillum, учитывающая иммунохимические особенности их липополисахаридных антигенов. Кроме этого, разработан новый способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС, защищенный патентом РФ.
Результаты диссертационной работы Матора Л.Ю. применяются при проведении научных исследований в Лаборатории генетики, Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур, Лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и др. Они используются также при проведении диссертантом лекционных занятий по курсу «Основы аналитической иммунохимии» и практических занятий со студентами, подготовке ими курсовых и дипломных работ в Учебно-научном центре физико-химической биологии Саратовского госуииверситета и ИБФРМ РАН. Материалы * диссертации использованы при написании методического пособия «Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.). Под научным руководством диссертанта выполнены и защищены две кандидатские диссертации.
Личный вклад соискателя. Все основополагающие экспериментальные результаты и их теоретические обобщения, представленные в данной диссертации, получены автором лично. Ему принадлежит также основная роль в обработке и интерпретации результатов экспериментов. Из части разработок, которые были проведены в соавторстве с другими исследователями, в диссертацию включены и вынесены на защиту только те положения, в развитии которых автору принадлежит определяющая роль.
Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов
13 и растений» (№ гос. per, 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Создание эффективной биотест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бактерий, ассоциированных с высшими растениями», выполненному в соответствии с Госзаказом от Миннауки РФ в рамках ГНТП «Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии» (Распоряжение № 816ф от 15.03.95 г. и последующие, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.). Работа поддержана грантами Комиссии РАН по работе с молодежью по итогам конкурсов 2002-2004 г. г. по поддержке базовых кафедр и филиалов кафедр, созданных при институтах РАН, грантом Президента РФ № НШ-1529.2003.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ, грантом Саратовского Международного центра перспективных исследований 98-4-04, грантом INTAS 96-1015 и грантами NATO LST.CLG 975040 и LST.EV 980093.
