Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 9
1.1 Проблема нефтяного загрязнения окружающей среды и восстановление природных экосистем 9
1.2 Влияние нефтяного загрязнения на свойства почвы и почвенную биоту 15
1.3 Микробная деструкция нефти в почве и факторы, влияющие на ее интенсивность 21
1.4 Бактерии рода Pseudomonas и их биологические особенности. Углеводородокисляющие штаммы видов рода Pseudomonas, способные к эффективной биодеструкции углеводородов нефти 24
1.5 Биоремедиация нефтезагрязненных почв и применение биопрепаратов на основе микроорганизмов-деструкторов нефти, в т.ч. бактерий рода Pseudomonas 28
1.6 Проблема выживания интродуцированных микроорганизмов, экологическая безопасность микробного метода очистки нефтезаг рязненных почв 34
Экспериментальная часть 38
II. Объекты, методы и условия проведения экспериментов 38
2.1 Методика изучения влияния нефтепродуктов на физико химические свойства и фитотоксичность почвы 39
2.2 Методика изучения динамики численности микрофлоры в неф-тезагрязненной почве 40
2.3 Методика выделения из почвы штаммов микроорганизмов, способных к разложению нефтепродуктов 42
2.4 Методы изучения свойств выделенных углеводородокисляющих штаммов рода Pseudomonas и методика оптимизации питательныхсред для их культивирования 45
2.5 Методика изучения изменения фитотоксичности нефтезагряз-ненной почвы при внесении углеводород окисляющих бактерий 47
2.6 Методика изучения динамики численности различных групп микроорганизмов нефтезагрязненной почвы при внесении штаммов бактерий-деструкторов нефтепродуктов 48
2.7 Методика приготовления торфяного микробного биопрепарата «Псевдомин» на основе выделенных штаммов микроорганизмов рода Pseudomonas 49
2.8 Методика проведения полевого эксперимента по изучению эффективности разложения нефтепродуктов в почве под действием микробных биопрепаратов 51
2.9. Методика проведения сравнительного исследования эффективности различных биопрепаратов для деструкции углеводородов на
нефтезагрязненных почвах 53
III. Результаты исследований и их обсуждение 55
3.1 Изучение влияния нефтепродуктов на физико-химические свойства и фитотоксичность почв 55
3.2 Изучение динамики численности различных групп микроорганизмов при загрязнении почвы нефтепродуктами 59
3.3 Выделение из нефтезагрязненной почвы бактериальных штаммов деструкторов нефти 68
3.4 Изучение морфологических, культуральных и физиолого биохимических особенностей выделенных из загрязненной почвы
бактерий, способных к трансформации нефтепродуктов 70
3.4.1 Идентификация выделенных углеводородокисляющих бак
терий 70
3.4.2 Изучение роста и развития выделенных бактерий на питательных средах с различными источниками углерода и азота 73
3.4.3 Изучение способности выделенных бактерий к росту на средах с различными концентрациями нефтепродуктов
3.5 Исследование изменения фитотоксичности почвы, загрязненной нефтепродуктами, при дополнительном внесении углеводородо-кисляющих бактерий рода Pseudomonas 78
3.6 Определение изменения численности различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной почве при внесении бактерий рода Pseudomonas в качестве агента биодеградации нефти
3.7 Изучение степени биодеградации нефтепродуктов в почве под действием микробных препаратов на основе углеводородокисляю-щих бактерий рода Pseudomonas (полевой опыт) 89
3.8 Сравнительные испытания биопрепарата «Псевдомин» и других микробных биопрепаратов при их воздействии на застарелое нефтяное загрязнение почвы (лабораторный опыт) 98
Выводы 111
Литература
- Влияние нефтяного загрязнения на свойства почвы и почвенную биоту
- Методика выделения из почвы штаммов микроорганизмов, способных к разложению нефтепродуктов
- Выделение из нефтезагрязненной почвы бактериальных штаммов деструкторов нефти
- Изучение степени биодеградации нефтепродуктов в почве под действием микробных препаратов на основе углеводородокисляю-щих бактерий рода Pseudomonas (полевой опыт)
Введение к работе
з
Актуальность проблемы. В настоящее время добыча нефти и производство нефтепродуктов играют в нашей жизни огромную роль. Но чем больше масштабы производства, тем больше и масштабы нефтяного загрязнения окружающей среды. Нефть и нефтепродукты признаны приоритетными загрязнителями планеты (Израэль, Ровин-ский. 1986). В первую очередь процесс добычи нефти отражается на загрязнении почвы. Это приводит к отторжению земель из сельскохозяйственного использования, в связи с чем проблема рекультивации нефтезагрязненных почв становится весьма актуальна.
Определяющую роль в процессах самоочищения почв от нефти играют микро-организмы (Гусев, Коронелли, 1981; Славнина, Середина, 1992). Большинство известных биотехнологических способов очистки основано на использовании чистых и смешанных культур микроорганизмов в сочетании с различными веществами или приемами, стимулирующими их активность (Исмаилов, 1985; Rosenberg, 1985). Эти способы зарекомендовали себя как эффективные и наиболее естественные средства охраны природной среды. Микроорганизмы, используемые в препаратах для ускорения биоремедиации нефтезагрязненных почв, обладают значительно большей эффективностью, чем природные формы, благодаря направленному отбору (Гузев и др., 1989; Квасников, Клюшникова, 1981). Знания по физиологии и экологии нефтеокис-ляющих микроорганизмов и условиях их успешной интродукции в природные экосистемы необходимы для развития экологической биотехнологии в нашей стране. Недостаток отечественных биопрепаратов-деструкторов нефти неизбежно приведет к заполнению национального рынка импортными аналогами, зачастую худшего качества, и как следствие, поставит Россию в необратимую зависимость от импорта (Кирее-ва, Новоселова, 1996).
ІІе.іь работы — выделить из почвы эффективные штаммы микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов и разработать с их использованием способ биоремедиации нефтезагрязненной почвы. Задачи исследования
получить методами аналитической селекции и выделить в чистой культуре перспективные штаммы-микроорганизмов>дсхрукхоро& нефти;
USrl IРАГЪНАЯ НАУЧі-МЯ БИБЛИОТЕКА ГАэск. сельскокоз академии им. К. АЛ^ji&p&ea.,
инв. mJr-j..'
1 идентифицировать выделенные микроорганизмы, выявить их углеводородокис-ляющую способность и оптимизировать условия роста для получения микробной биомассы;
разработать технологию приготовления и применения новою микробного препарата на основе наиболее активного выделенного штамма для биоремедиации неф-гезагрязненных почв; изучить его эффективность в условиях реального нефтяного загрязнения;
исследовать эффективность нового микробного биопрепарата в сравнении с другими аналогичными препаратами для рекультивации почв, загрязненных нефтепродуктами.
Научная новизна. Впервые из нефтезагрязиенной почвы выделены бактериальные штаммы, способные к росту на средах с высокими концеїпрациями нефтепродуктов (свыше 10% от объема среды), использующие углеводороды, входящие н смета» дизельного топлива, сырой нефти и мазута и качестве единственных источников углерода. Полученные культуры идентифицированы и отнесены к роду I'seiklonumas виду pulitla (st. 91-96 и st. 9:1V). Показано, что при внесении выделенных штаммов в почву, загрязненную нефтепродуктами, существенно снижается фитотоксичность почвы, а численность и соотношение отдельных групп микроорганизмов приближаются к соответствующим показателям незагрязненной почвы.
Выявлено, что при биоремедиации нефтезагрязненных почв (Сургутский район. Тюменская обл.) с использованием биопрепарата «Псевдомин» на основе одного из выделенных штаммов (Pseudomonas putida St. 91-96) в течение 2,5 месяцев происходит почти полное разложение нефтепродуктов. При совместном использовании с ним минеральных удобрений эффективность достигает 9й, 1%. Микробиологический анализ образцов рекультивируемой почвы выявил высокую активность штамма и способность размножаться в загрязненной почве.
Практическая значимость. На основе выделенного из нефтезагрязиенной почвы штамма бактерий-деструкторов углеводородов нефти разработана технология приготовления нового микробного препарата «Псевдомин» для биоремедиации почв, загрязненных нефтепродуктами и оптимизированы способы его применения совместно с различными мелиорантами. Новый биопрепарат «Псевдомин», пройдя серию полевых н лабораторных испытаний, зарекомендовал себя как хороший деструктор нефти.
з Среди 14 испытанных биопрепаратов, «Псевдомин» по суммарному деградационно-му действию на нефтепродукты в почве явился одним из лучших.
Результаты работы могут быть использованы для дальнейших биотехнологических исследований и при разработке комплексных технологий по восстановлению исфтезагрязненных почв, завершающей стадией которых является микробиологическая. Биопрепарат «Псевдомин» может быть рекомендован для использования в северных нефтедобывающих регионах, где климат характеризуется коротким теплым' периодом, в качестве активного агента биоремедиации нефтезагрязненных почві ускоряющего процесс разложения нефтепродуктов.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции «Тетро-НР'98» (Югославия, Чачак. 1998 г.); на III экологическая конференция студентов и молодых ученых вузов г. Москвы «Охрана окружающей среды на пороге третьего тысячелетия в интересах устойчивого развития» (Москва, апрель, 1999 г.); на III съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000 г.); на Международной конференции «Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия» (Минск, июнь, 2000 г.); на Второй Интернациональной Ирано-Российской конференции «Agriculture and natural resources» (Москва, февраль, 2001г.) п на научной конференции молодых ученых ТСХЛ (Москва, июнь, 2001г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 131 страницах машинописно-I о текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и выводов. 'Экспериментальный материал иллюстрирован 17 рисунками и 19 таблицами в ICKCIO. Список литературы включает 179 наименований, в том числе 58 — на иностранных языках.
Влияние нефтяного загрязнения на свойства почвы и почвенную биоту
Загрязнение нефтью природной среды вызывает резкие ответные реакции во всех компонентах экосистем, в том числе в почве. При попадании нефти и ее спутников в почву происходят глубокие и зачастую необратимые изменения химических, физических, микробиологических свойств почвы, а иногда и существенная перестройка всего почвенного профиля (Ellis, Adams, 1961; Мукатанов, Ривкин, 1980; Солнцева, 1981).
В работах ряда авторов (Исмаилов, 1981; Пиковский, 1993; Amadi et al., 1993; Ильичев и др., 2001) установлено неравномерное распределение нефти по профилю почвы. Так, в пределах промыслов естественные верхние горизонты почв часто отсутствуют и на горизонтах Aj и В сформированы техногенные наносы (Ат), которые содержат максимальное количество нефтепродуктов. Второй уровень накопления нефти - горизонт С на уровне грунтовых вод. Загрязнение этого горизонта происходит как путем вертикальной миграции сверху, так и путем сорбции загрязненных веществ из латеральных водных потоков.
Нефть, попадая в почву, существенным образом меняет ее водно-физические характеристики. Ее тяжелые фракции обладают ярко выраженной гидрофобностью (Халимов и др., 1996), которая передается почвенным частицам, о чем свидетельствует повышение влажности почвы, особенно нижней части пахотного горизонта, не зависимо от агротехнической обработки. Помимо водно-физических свойств изменяются химические свойства почвы (Ильин и др., 1982; Солнцева и др., 1985), что также сказывается на развитии микрофлоры и высших растений. Влияние нефти и нефтепродуктов на высшие растения обусловлено как их непосредственным токсическим действием, так и нарушением водного режима в почве и повреждением корней из-за анаэробных условий (Етеревская, Яранцева, 1976; Гродзинский, 1991). Н. А. Киреева (1996) установила, что под воздействием нефтяного загрязнения снижается содержание белка в зерне, меняется фракционный состав белка в сторону ухудшения качества. Ингибируется активность ферментов (каталазы, протеиназы, амилазы, альдолазы). На высшие растения негативное влияние оказывают также спутники нефти. Так, воды, сопутствующие нефти, часто содержат высокие концентрации солей натрия, которые, попадая в почву, могут накапливаться, достигая токсичных для растений концентраций. Внедрение в ППК натрия вызывает заметное подщелачивание кислых дерново-подзолистых почв. Отмечается, что в почвах, загрязненных нефтью, изменяются окислительно-восстановительные условия, что может приводить к значительным аномалиям в содержании ряда микроэлементов. По данным Д. Г. Звягинцева и др. (1989) после внесения значительных концентраций нефти в почву наблюдается снижение подвижных форм калия и фосфора, что, по-видимому, связано с иммобилизацией этих элементов в биомассе углеводородокисляющих микроорганизмов.
Нефть - сложная смесь алканов (парафиновых или ациклических насыщенных углеводородов), нафтенов и аренов, различной молекулярной массы, а также кислородных, сернистых и азотистых производных углеводородов. Нефти разных месторождений по углеводородному составу неодинаковы. По преобладающему компоненту нефти разделяются на метановые, ароматические, нафтеновые и гибридные. Все углеводороды, входящие в состав нефти, могут быть использованы микроорганизмами, но окисление их происходит с неодинаковой легкостью. В работах ряда авторов (Wang, Bartha, 1990; Song et al., 1990) показано, что по степени деградабельности сырая нефть и продукты ее переработки располагаются в следующем порядке: наиболее биодеградабельна сырая нефть, затем керосин, горючие масла, наименее деградабельным является мазут. Это связано с тем, что содержание в мазуте тяжелых фракций нефти и в частности смолисто-асфальтеновых соединений в несколько раз выше, чем в сырой нефти. Данные соединения при окислении густеют и образуют прочные покровы, которые цементируют и пагубно влияют на водно-физические свойства почвы. Они малодоступны микроорганизмам и утилизируются ими в течение нескольких десятилетий (Пиковский, 1988; Оборин и др., 1988).
Влияние нефти на микроорганизмы почвы в значительной степени определяется ее концентрацией и соотношением в ней легких и тяжелых фракций. Рядом авторов (Солнцева и др., 1985, Звягинцев и др., 1989; Deyo et al, 1993) установлено, что в низких концентрациях нефть оказывает стимулирующее воздействие на почвенную биоту, так как она является энергетическим субстратом для большой группы микроорганизмов. Однако массированное нефтяное загрязнение почвы, возникающее при аварийных разливах, сопровождается острым токсическим действием на живые организмы. Это явление наиболее ярко проявляется сразу после попадания загрязнителя в почву. Токсичность нефти определяется, главным образом, наличием в ней летучих ароматических углеводородов (толуола, ксилола, бензола), нафталинов и некоторых других, растворимых в воде фракций (Fedorak, Westlake, 1981; Cerniglia, 1984; Квасников, Клюшникова, 1981). Период токсикоза является сравнительно непродолжительным. В дальнейшем острое токсическое действие нефти заметно падает, а длительное снижение продуктивности неф-тезагрязненных почв связано с изменением важных свойств почв. Исследования Э.М. Халимова и др. (1996) показали, что легкие компоненты нефти в низких концентрациях практически не влияют на почвенную микробиоту, при более высоких дозах действие их на микроорганизмы, высшие растения и почвенных животных подобно другим токсикантам, а при еще более высоких концентрациях они выступают как основной субстрат для углеводоро-докисляющих микроорганизмов. Гидрофобные свойства почвы при ее загрязнении легкими фракциями нефти практически не изменяются. Тяжелые фракции нетоксичны для гетеротрофных микроорганизмов, но почти и не метаболизируются ими. Они могут утилизироваться лишь микробным сообществом путем сопряженного метаболизма.
Эффект длительного воздействия нефти на почву проявляется в изменении ее микробиологических свойств и комплекса почвенных микроорганизмов. Во всех почвах в большом количестве содержаться микроорганизмы, способные окислять различные углеводороды. Они являются обычными сочленами биоценозов почв (Андрусенко, Рунов, 1973; Суржко и др., 1995; Benka-Cocer, Ekundayo, 1997). Селекционирующее действие нефти на почвенную микробиоту в первую очередь выражается в том, что в загрязненных почвах микроорганизмов, использующих углеводороды, находится значительно больше, чем в почвах без нефти (Квасников, Клюшникова, 1981; Brown-Lewis, 1987). Обнаружено увеличение количества узкоспециализированных форм микроорганизмов: окисляющих газообразные углеводороды, твердые парафины, ароматические углеводороды. Среди них выявлены представители бактериальных родов Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus, Micrococcus, Micromonospora и др. (Fuhs, 1965; Cooney, Summers, 1976; Stetzenbach, Sinclair, 1986; Глазовская, 1988; Ягафарова, Скворцова, 1992; Плотникова и др., 2001), микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium, Trihoderma (Ягафарова и др., 2001) и аспорогенные дрожжи родов Candida, Rhodotorula, Cryptococcus (Шлегель, 1987, Таранова, Жданова, 1996). Нефтеокисляющие микроорганизмы обитают не только в почве, их выделение возможно из воды, нефтеносных пластов, в т.ч. высокотемпературных, где численность термофильных углеводородокисляющих бактерий достигает значительных размеров (Иванова, 1997).
Методика выделения из почвы штаммов микроорганизмов, способных к разложению нефтепродуктов
После анализа изменений физико-химических и биологических свойств почвы, происходящих под влиянием нефтепродуктов, стала очевидна необходимость получения активных штаммов микроорганизмов-деструкторов, способных к эффективной биодеградации компонентов нефти. Углеводородокисляющие микроорганизмы, выделяемые из нефтезагрязнен-ной почвы, благодаря соответствующему отбору, характеризуются способностью к активному размножению и усвоению широкого спектра углеводородов нефти; при этом они не являются чужеродными почвенной микрофлоре. С целью выделения штаммов микроорганизмов, способных эффективно разлагать нефть и нефтепродукты, было отобрано более 200 образцов почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (АЗС и нефтехранилища, г. Москва, Московская область). Получение накопительных и выделение чистых культур биодеградаторов вели на среде следующего состава, г/л: (NH4)2HPO4-3,0; КН2Р04 - 2,0; NaCl - 0,5; MgS04 7Н20 - 0,3; СаС12 6Н20 -0,1; FeCl3 6Н20 - 0,01; специально подготовленный безуглеродный агар (Мишустин, Рунов, 1957) - 20,0; дистиллированная вода - 1000 мл. В качестве источника углерода в среду добавляли от 0,5 до 5% нефтепродукта (дизельное топливо). В простерилизованную в автоклаве (1 атм.) среду МПА в асептических условиях добавлялось стерильное дизельное топливо. Стерилизация нефтепродукта проводилась путем фильтрования через бактериальные фильтры с помощью вакуумного насоса. Контроль проводился чашечным методом (капля нефтепродукта растиралась по поверхности плотной среды МПА). Затем чашки помещались в термостат на 5 суток. Отсутствие роста микроорганизмов на среде фиксировалось визуально. Посев почвенной суспензии проводился на чашки Петри глубинным способом из разведений 10"2 и 10"3. Инкубацию посевов вели при температуре 28С. Учет выросших колоний проводился на 5 сутки. Затем наиболее типичные колонии, имевшие высокую интенсивность роста, многократно пересевались на среду того же состава до получения отдельных клеток. Окончательно чистые культуры высевали на среду МПА.
Кроме «естественно» загрязненных нефтепродуктами почв, представлялось интересным исследовать почву, подвергавшуюся искусственному загрязнению нефтепродуктом в лабораторных условиях, и также выделить из нее активные углеводородокисляющие штаммы. В качестве грунта в опыте использовались дерново-подзолистая среднесуглинистая окультуренная почва в смеси с речным песком в соотношении 1:1 (для улучшения режима аэрации), которая помещалась в стеклянные емкости объемом 500 мл, к которым затем добавляли нефтепродукт. В качестве загрязнителя применялось дизельное топливо в концентрации 5 %. Влажность поддерживалась на уровне примерно 50 % на протяжении всего эксперимента, почва в сосудах неоднократно перемешивалась. Срок эксперимента 13 месяцев. Повторность вариантов 3-х кратная. Для выделения культур микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов производились посевы суспензии загрязненной почвы на среду МПА с добавлением 0,5 % дизельного топлива. Высевы проводились из разведений 10"2, 10"3 и 10"4 глубинным способом. Инкубацию посевов вели при температуре 28С. Учет выросших колоний проводился на 4 сутки. Затем наиболее типичные колонии, имевшие высокую интенсивность роста, многократно пересевались на среду того же состава до получения отдельных клеток. Таким образом был получен ряд чистых культур бактериальных штаммов, способных к кометаболическому разложению углеводородов нефти, т.е. использующих дизельное топливо как дополнительный источник углерода и энергии наряду с легко метаболизируемыми источниками углерода. Затем данные штаммы тестировались на способность усваивать нефтепродукт в качестве единственного энергетического и углеродного субстрата. Микроорганизмы высевались поверхностно (штрихом) на чашки Петри, содержащие безуглеродную среду, г/л: (NH4)2HPO4-3,0; КН2Р04 - 2,0; NaCl - 0,5; MgS04 7Н20 - 0,3; СаСЬ 6Н20 - 0,1; FeCb 6Н20 - 0,01; специально подготовленный безуглеродный агар - 20,0 (Мишустин, Рунов, 1957); дистиллированная вода - 1000 мл. В качестве источника углерода в среду добавляли от 0,5 до 5% нефтепродукта (дизельное топливо). Повторность опыта 5-ти кратная. Инкубация чашек Петри проводилась в термостате при 28С в течение 4-х суток.
Выделение из нефтезагрязненной почвы бактериальных штаммов деструкторов нефти
При внесении в почву сырой нефти - лучшего питательного субстрата для развития углеводородокисляющей микрофлоры - наблюдается наиболее активный рост группы микроорганизмов, усваивающих органический азот, и их общая численность остается высокой до конца эксперимента. Среди микроорганизмов, учитываемых на КАА преобладали актиномицеты (максимальная численность была достигнута на 30 сутки опыта).
Высокая концентрация мазута в начальный период, приводит к некоторому подавлению большей части всех групп микроорганизмов, но с течением времени в обоих типах почв происходит формирование специфического углеводородокисляющего сообщества (бактерии родов Pseudomonas, Mycobacterium, грибы, в основном, родов Mucor, Fuzarium и Aspergillus), что косвенно указывает на протекание в почве процесса кометаболической микробной деструкции мазута. Максимум численности этой группы микроорганизмов наблюдается лишь на 30 сутки, когда формируется комплекс медленно растущих микробов-деструкторов тяжелых фракций нефти.
Для всех вариантов с внесением нефтепродуктов отмечается значительное снижение видового разнообразия микроорганизмов по сравнению с незагрязненной почвой. Так, из сообщества полностью исключаются дрожжи, уменьшается количество видов бацилл - в присутствии высоких доз нефтепродуктов не развиваются обычные почвенные виды В. mycoides, В. megaterium, характерные для незагрязненной почвы. Количество видов грибов, актиномицетов и бактерий, осуществляющих минерализацию крахмала, снижается, а численность гетеротрофов, участвующих в трансформации углеводородов нефти напротив, увеличивается (особенно явно проявляется эта тенденция в дерново-подзолистой почве).
Таким образом, загрязнение почвы нефтепродуктами в заданной концентрации приводит к активизации роста специфических углеводородо-кисляющих микроорганизмов, содержащихся в почве. Однако без добавления искусственно отобранных активных штаммов-деструкторов нефтепродуктов процесс биоремедиации протекает медленно и, если судить по соотношению отдельных групп микроорганизмов, к концу эксперимента замедляется, вследствие расходования доступного энергетического субстрата.
Как правило, штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, способные к эффективному разложению нефтепродуктов в почве, выделяют из самой загрязненной почвы, имеющей контакт с загрязнителем в течение продолжительного времени (Stetzenbach et al., 1993; Лысак, Лапыгина, 1994; Ягафарова, Скворцова, 1996), так как при использовании их в последствии в составе биопрепаратов для биоремедиации почв, очень важно не нарушить принцип нечужеродности этих микроорганизмов природной микрофлоре (Скрябин, Головлева, 1976; Исмаилов, 1985). Благодаря искусственному отбору, эти микроорганизмы обладают более выраженными заданными свойствами, чем природные формы того же вида. После многократных пересевов микробного сообщества нефтезагрязненной почвы на питательные среды, содержащие нефтепродукт в высокой концентрации, и выделения чистых культур микроорганизмов, способных к активному росту при наличии углеводорода в качестве единственного источника углерода и энергии, можно получить штаммы, которые в дальнейшем будут использоваться для биотехнологических целей.
В нашей работе было получено два штамма бактерий-биодеградаторов нефтепродуктов. Оба они были выделены из почвы, загрязненной нефтепродуктами. Первый штамм, с лабораторным номером 91-96, был выделен из дерново-подзолистой почвы, длительное время подвергавшейся нефтяному загрязнению вблизи АЗС. Культура была способна к росту на среде с нефтепродуктом (дизельным топливом) в качестве единственного источника углерода в концентрации 5%. Была выявлена также его способность к соокислению нефтепродукта (наряду с другими источниками углерода) - концентрация дизельного топлива в среде составляла более 10%. На среде с МПА, микроорганизмы образовывали яркий зеленый пигмент (флуоресценция), характерный для многих видов рода Pseudomonas. При микро-скопировании обнаруживались короткие тонкие одиночные палочки, грамот-рицательные, не содержащие спор. На поверхности мясо-пептонного агара микроорганизмы образовывали широкий штрих с матовым блеском; одиночные колонии округлые с выпуклым профилем. На основании анализа морфологических признаков, культура была отнесена к роду Pseudomonas.
Второй штамм - Pseudomonas putida st. 9:IV - был выделен в ходе модельного лабораторного опыта из смеси дерново-подзолистой окультуренной почвы и речного песка, подвергавшейся загрязнению дизельным топливом в течение 13 месяцев. Он, как и первый штамм Pseudomonas putida 91-96, был способен к росту и усвоению нефтепродукта в качестве единственного источника углерода и энергии. На среде МПА была также обнаружена интенсивная флуоресценция. Морфологические признаки культуры были сходны с таковыми штамма 91-96, на основании чего, эта культура также отнесена к роду Pseudomonas. Отличия состояли в несколько меньшей интенсивности роста культуры, более позднем сроке пигментообразования на среде МПА и King В (3 сутки) и большей вязкости колоний, выросших на плотной среде, по сравнению со штаммом Pseudomonas 91-96.
Изучение степени биодеградации нефтепродуктов в почве под действием микробных препаратов на основе углеводородокисляю-щих бактерий рода Pseudomonas (полевой опыт)
Как видно из представленной таблицы 14, общая численность гетеротрофных организмов, в т.ч. вносимых с биопрепаратами, в 1998 году не превышает общий контрольный уровень, что свидетельствует об отсутствии микробного загрязнения почвы. Наблюдается увеличение численности микроорганизмов нефтезагрязненной почвы, при повышении аэрации, которое достигается путем перекопки почвы и внесении минеральных удобрений, что согласуется с большим количеством литературных данных (Алексеева и др., 2000; Cimlla, Ferreira, 1997; Холоденко и др., 1996).
В целом, процесс биоремедиации нефтезагрязненных почв с помощью биопрепарата «Псевдомин» на основе углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas putida, как показывает анализ остаточных количеств нефтепродукта и определение численности микрофлоры, значительно ускоряется и это не приводит к отрицательным последствиям для почвенных условий, так как не нарушается баланс почвенной микрофлоры. Новый микробный препарат можно признать весьма эффективным для биодеградации нефтепродук 98 тов в почве, однако для нас представляло интерес исследовать его эффективность в сравнении с другими аналогичными препаратами.
Сравнительные испытания биопрепарата «Псевдомин» и других микробных биопрепаратов при их воздействии на застарелое нефтяное загрязнение почвы (лабораторный опыт)
В настоящее время наиболее прогрессивной технологией очистки нефтезагрязненных почв считается использование интродуцированных в почву различных углеводородокисляющих микроорганизмов. Многими исследователями разрабатываются способы изготовления биопрепаратов на основе различных микроорганизмов. Предлагаются к использованию достаточно широкий набор препаратов. В России наиболее известными из них является «Путидойл», (Евдокимова и др., 1994), «Деворойл» (Борзенков и др., 1994); «Экойл» (Ермоленко и др., 1994), «Олеоворин» (Щеблыкин и др., 1995); «Нафтокс» (Белонин и др., 1994); «Лестан» (Стабликова и др., 1996); «Биосэт» (Пономарева и др., 1998); «Биодеструктор» (Капотина, Моршако-ва,1998); «Экосорб» (Чугунов и др., 2000) и ряд других. Известны и зарубежные аналоги: «Hydrobac» (Staff, 1982); «Noggies» (Schussler, 1986); «Biocrack» (Kopp-Holtwieshe, 1992) и другие. Нормы расхода препарата и рецептура его применения совместно с минеральными удобрениями обычно содержится в инструкции к препарату и различаются у разных препаратов. Обычно рекомендуют вносить, в зависимости от степени загрязнения и типа препарата, от 1 до 10 кг биопрепарата на гектар почвы в пересчете на сухой вес. Как правило, через 2-3 недели проводят подкормку почвы раствором удобрений с учетом содержания азота и фосфора в конкретной почве. В наших сравнительных испытаниях различных препаратов использовались технологии применения, рекомендованные разработчиками для каждого вида препарата. Некоторые из упомянутых выше биопрепаратов проходили испытания в данном опыте. Объектом исследований являлась нефтезагрязненная почва (подзол иллювиально-железистый), отобранная с места аварийного разлива газоконденсата на Западно-Сургутском месторождении, куст 84 (семилетней давности), обработанная следующими препаратами: 1) Деворойл 1 (п) 8) Деградойлас 9 2) Деворойл 2 (п) 9) Ремедиаст 3) Деворойл (паста) 10) Биопрепарат 999 4) Инипол 11) Биопрепарат 670 5) Фаерзайм 12) Нафтокс 6) Биоприн 13) Нафтокс (жидкий) 7) Деградойлас 81 14) Псевдомин
Целью проведенных исследований являлась оценка способности предложенных биопрепаратов активизировать процесс разложения нефтяных загрязнений в испытуемых образцах почвы в лабораторных условиях.
При рассмотрении полученных экспериментальных данных были использованы следующие критерии оценки способности биопрепарата к деструкции углеводородов нефти: Критерий 1 Установить время, в течение которого достигается 50%-ная эффективность, т.е. провести отбор препаратов, быстро расщепляющих углеводороды нефти; Критерий 2 Оценить эффективность воздействия биопрепаратов при достижении максимального снижения уровня загрязнения за 11 недель. В таблице 15 представлены результаты анализов остаточного содержания нефтепродуктов в образцах почвы. Как видно из таблицы 15, эффективность действия препаратов значительно превышает контрольную степень разложения нефтепродуктов без участия микробных препаратов. Эффективность «Псевдомина» оценивалась в двух вариантах концентраций - 197,2 мг/кг почвы и 552 мг/кг почвы и было установлено, что при «высоком» уровне загрязнения активность микроорганизмов, входящих в состав препарата, низка и обеспечивает снижение
