Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Бактерии рода Pseudomonas - антагонисты фитопатогенных грибов и бактерий 12
1.2. Бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений 16
1.3. Колонизация ризосферы растений бактериями-антагонистами рода Pseudomonas 25
1.4. Применение биопрепаратов на основе псевдомонад для защиты растений от болезней29
2. Объекты и методы исследований 35
2.1. Объекты исследований 35
2.2. Скрининг штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов среди бактерий рода Pseudomonas 36
2.3. Изучение фенотипических характеристик выделенных культур 38
2.4. Определение у штаммов псевдомонад способности к синтезу индолил-3-уксусной кислоты и цитокининоподобных веществ 39
2.5. Определение нитрогеназной активности штаммов псевдомонад 39
2.6. Определение у штаммов псевдомонад способности к разложению соединений фосфора 40
2.7. Изучение влияния железа на антифунгальную активность штаммов псевдомонад 40
2.8. Исследование хитинолитической активности штаммов псевдомонад 41
2.9. Изучение антагонистического воздействия штаммов псевдомонад на развитие грибных фитопатогенов 41
2.10. Изучение ростстимулирующей активности штаммов псевдомонад 42
2.11. Изучение оптимальных способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов рода Pseudomonas 43
2.12. Исследование эффективности применения штаммов бактерий рода Pseudomonas против корневых гнилей пшеницы в лабораторных экспериментах 45
2.13. Оценка эффективности применения штаммов бактерий рода Pseudomonas против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях полевого эксперимента 47
2.14. Оценка эффективности применения штаммов бактерий рода Pseudomonas против твердой головни пшеницы в условиях закрытого и открытого грунтов 48
2.15. Оценка эффективности применения штаммов бактерий рода Pseudomonas в качестве агентов биологического контроля заболеваний овощных культур в лабораторно-вегетационных опытах 49
2.16. Характеристика агроклиматических условий вегетационных сезонов 52
2.17. Получение стрептомицинрезистентной модификации штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 54
2.18. Изучение способности к колонизации корней растений у стрептомицинрезистентного штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 56
2.19. Математическая и статистическая обработка результатов 59
3. Скрининг и изучение новых штаммов pgpr pseudomonas 60
3.1. Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов рода Pseudomonas 60
3.2. Характеристика выделенных культур по наличию свойств, положительно влияющих на растение 72
3.2.1. Фитогормоны, синтезируемые штаммами псевдомонад 72
3.2.2. Нитрогеназная активность штаммов псевдомонад 73
3.2.3. Исследование у штаммов псевдомонад способности к разложению фосфатов 74
3.3. Особенности антагонистического действия штаммов псевдомонад на фитопатогенные грибы 76
3.4. Изучение ростстимулирующей активности штаммов псевдомонад 87
3.5. Изучение оптимальных способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов 91
4. Оценка эффективности применения выделенных штаммов рода pseudomonas для защиты растений от болезней и повышения урожайности сельскохозяйственных культур 101
4.1. Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза, твердой головни в условиях вегетационных и полевых опытов 101
4.2. Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад в качестве агентов биологического контроля заболеваний овощных культур 119
5. Изучение колонизирующей способности штамма pseudomonas aureofaciens иб 51str 124
6. Результаты производственных испытаний биопрепарата «елена» 131
Выводы 134
Литература 136
Приложение 155
- Бактерии рода Pseudomonas - антагонисты фитопатогенных грибов и бактерий
- Изучение оптимальных способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов рода Pseudomonas
- Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов рода Pseudomonas
- Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза, твердой головни в условиях вегетационных и полевых опытов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бактерии p.Pseudomonas относятся к числу наиболее перспективных агентов биологического контроля заболеваний сельскохозяйственных растений. Среди представителей этой группы микроорганизмов встречаются не только антагонисты почвенных фитопатогенов [99,101,158], многие штаммы псевдомонад активно способствуют улучшению роста и развития растений [49,131,137]. По данным ряда исследователей известно, что, являясь типичными представителями ризосферы растений и обладая высокой скоростью роста, интродуцированные псевдомонады успешно колонизируют ризосферу растения-хозяина [70,86,93].
Возможность применения в сельском хозяйстве биологических средств защиты растений, в том числе и на основе бактерий p.Pseudomonas, изучается на протяжении десятков лет. Но только в последнее время, когда был накоплен колоссальный исследовательский материал по успешному применению бактерий-антагонистов в сельскохозяйственной практике, начались действительно широкомасштабные разработки технологий получения биопрепаратов различного назначения на основе микроорганизмов [28,41,59,63].
На данный момент в России зарегистрировано всего три биопрепарата на основе живых клеток штаммов бактерий p. Pseudomonas, используемых в качестве средств биологической защиты растений, («Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. 2003 год»): планриз (на основе штамма P.fluorescens АР-33), псевдобактерин-2 (на основе штамма P.aureofaciens BS 1393) и бинорам (на основе группы штаммов P.fluorescens 7Г, 7Г2К, 17-2). Ненасыщенность отечественного рынка биологическими средствами борьбы с инфекциями растений очевидна. Подобная ситуация объясняется видимо теми
трудностями, с которыми сталкиваются исследователи на долгом пути создания нового биопрепарата. Это и отсутствие корреляции между опытами in vitro и in vivo, и непостоянство защитного действия препаратов на основе микроорганизмов, а также сложности, связанные с технологией производства и консервацией биологических средств защиты растений.
Цель исследования. Выделение новых штаммов микроорганизмов р. Pseudomonas, проявляющих антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам, и их изучение с точки зрения возможности применения для защиты сельскохозяйственных растений от болезней.
Задачи исследования.
1. Выделить из природных и техногенных местообитаний новые
штаммы бактерий-антагонистов p. Pseudomonas.
2. Охарактеризовать выделенные штаммы по видовой принадлежности,
спектру антагонистической активности, механизмам взаимодействия
штаммов псевдомонад с грибными фитопатогенами и растениями.
3. Разработать оптимальные условия хранения в лабораторных
условиях штаммов-антагонистов с целью поддержания в течение
длительного времени антагонистических свойств культур.
4. Оценить эффективность применения изучаемых штаммов
псевдомонад для улучшения развития сельскохозяйственных растений и
защиты их от болезней.
5. Изучить в лабораторных и полевых условиях приживаемость и
динамику развития популяции штаммов-антагонистов, интродуцированных в
ризосферу сельскохозяйственных растений.
Научная новизна. Выделена и идентифицирована группа новых штаммов p. Pseudomonas, проявляющих антагонистическую активность в отношении широкого спектра фитопатогенных грибов: Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Pseudomonas aureofaciens ИБ 6, Pseudomonas putida ИБ 56, Pseudomonas putida ИБ 17, Pseudomonas sp-ИБ 182.
Показано, что выделенные штаммы псевдомонад продуцируют фитогормоны, а штамм Pseudomonas sp. ИБ 182 обладает хитинолитической и нитрогеназной активностью.
При изучении механизмов антагонистических взаимоотношений штаммов псевдомонад и фитопатогенных грибов было обнаружено, что под воздействием антибиотических веществ, синтезируемых штаммами-антагонистами, наблюдается задержка прорастания спор фитопатогенов, а формирующийся мицелий имеет выраженные морфологические нарушения.
В качестве метода консервации культур штаммов-антагонистов предложен способ хранения на каолине. Показано, что в смеси каолин - КЖ в соотношении 7:3 в течение 3 месяцев сохраняется высокий титр культуры P.aureofaciens ИБ 51 без утраты антагонистической активности. Данный срок хранения является вполне достаточным с точки зрения использования биологического препарата в течение одного полевого сезона.
Практическая значимость. Разработан новый биопрепарат «Елена» на основе штамма бактерий P.aureofaciens ИБ 51 для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов. Проведен комплекс испытаний в условиях открытого и закрытого грунтов, подтвердивших эффективность нового биопрепарата. В настоящее время биопрепарат «Елена» находится на стадии регистрации в Госхимкомиссии Российской Федерации.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской конференции «Почва, жизнь, благосостояние» (Пенза, 2000), на VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001), на XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), на I и II Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), на «I конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН
РБ» (Уфа, 2002), на II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ и РБ, д.с.-х.н., профессора Ю.А.Усманова «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (Уфа, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 3 патента Российской Федерации.
Бактерии рода Pseudomonas - антагонисты фитопатогенных грибов и бактерий
Известно, что бактерии p.Pseudomonas обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировать развитие почвенных фитопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений. К настоящему времени в литературе описано множество штаммов псевдомонад, обладающих антагонистическими свойствами в отношении широкого круга фитопатогенных грибов и бактерий.
В публикациях, посвященных использованию бактерий p.Pseudomonas для защиты злаковых культур от болезней, фигурируют различные виды псевдомонад. Из посевов пшеницы были выделены бактерии p. Pseudomonas, обладающие антагонистическим действием в отношении гриба Gaeumannomyces graminis [154,158]. Показано, что вследствие обработки семенного материала пшеницы культурами псевдомонад растения на ранних фазах развития были заражены незначительно, что способствовало повышению урожая (по сухому веществу) в среднем на 61% [158]. В мелкоделяночных опытах штаммы P. cepacia обеспечивали защиту пшеницы от фузариоза и повышали урожайность на 80% по сравнению с контролем [4]. Канадскими исследователями ризосферные бактерии P.cepacia и P. putida были использованы в качестве агентов биологической защиты растений озимой пшеницы против поражения грибом Rhizoctonia solani. В вариантах с использованием штаммов ризобактерий биомасса растений заметно возрастала по сравнению с контролем, а масса сухих корней увеличивалась на 92-128% [137].
Подавляющее большинство штаммов, антагонистически активных по отношению к возбудителям корневых гнилей злаковых культур, относится к флуоресцирующим видам бактерий p. Pseudomonas, а также к нефлуоресцирующим сапрофитным видам P. cepacia и Pseudomonas sp.[22].
В литературе имеются данные о высокой биологической эффективности почвенных флуоресцирующих бактерий p.Pseudomonas также против других возбудителей заболеваний злаковых и травянистых растений: септориоза и листовой ржавчины пшеницы [146], ржавчины и увядания сафлора [116,152]. Изолят P.fluorescens, выделенный из ризосферы рапса озимого, обладал антагонистическими свойствами против патогенных и сапрофитных для рапса и льна грибов. Он был способен защитить прорастающие растения от инфекции Phoma lingam, Fusarium avenaceum [129].
Исследована антагонистическая активность штаммов псевдомонад, выделенных из ризосферы огурца, по отношению к Pythium ultimum, вызывающего выпревание всходов, а также влияние бактерий на рост рассады. Некоторые изоляты имели положительное влияние на рост растений огурца и 8% выделенных изолятов подавляли развитие патогенеза [131,145].
В вегетационных и полевых мелкоделяночных опытах изучена возможность использования обработки посевного материала ризосферными бактериями из группы флуоресцирующих Pseudomonas для предпосевной защиты свеклы от болезней. Показано, что штамм ML5 P.fluorescens-putida и штамм R20 P.putida подавляли заселение перикарпа семян сахарной свеклы патогеном Pythium ultimum. Штамм R20 тормозил мицелиальный рост гриба в тканях семян, а штамм ML5 препятствовал как мицелиальному росту, так и прорастанию спор. Активность штаммов ML5 и R20 была сопоставима с активностью фунгицидов, подавляющих выпревание всходов сахарной свеклы в условиях теплицы [99,143]. В другой работе, также посвященной способам биологической борьбы против болезней сахарной свеклы, выявлено, что псевдомонады, используемые для дражирования семян, сохраняли антагонистические свойства в течение нескольких месяцев [102].
В вегетационных опытах изучено действие изолятов P.fluorescens и Р. putida на Plasmodiophora brassicae, Rhizoctonia solani и Tilletia caries. Бактериальным препаратом обрабатывали посевной материал, корни растений или лунки для их посадки. Из 141 изолята, испытанного против Plasmodiophora brassicae на капусте китайской, 19 существенно подавляли развитие патогена. На кормовых бобах только 1 из 44 изолятов подавлял фитопатогенный гриб Rhizoctonia solani и приводил к увеличению сырой биомассы растений; из 5 изолятов, испытанных на озимой пшенице, только один мог снижать пораженность растений Tilletia caries [101].
Сначала в опытах in vitro, а затем в условиях теплицы исследована активность штаммов P.fluorescens в отношении Rhizoctonia solani, а также возбудителя корневой и стеблевой гнили арахиса (Sclerotium rolfsii) [92,141]. Растения арахиса, инокулированные P. fluorescens перед заражением Rhizoctonia solani, поражались заболеванием в два раза слабее, чем контрольные. 99% растений арахиса были защищены от инфекции Sclerotium rolfsii, если их подвергали бактеризации (10 КОЕ/мл). Под влиянием бактеризации урожай арахиса возрастал на 59,0%, а высота растения увеличивалась на 25,7%.
Известно, что среди бактерий p. Pseudomonas достаточно часто встречаются антагонисты, эффективные против бактериальных поражений растений. Так, например, предпосевная обработка клубней картофеля, инфицированных Erwinia carotovora subsp. atroseptica, смесью двух флуоресцирующих псевдомонад снижала зараженность клубней потомства, а также задерживала развитие болезни на материнских клубнях [138]. Эпифитные псевдомонады, выделенные с перца и томата, проявляли антагонизм по отношению к возбудителю бактериозов Erwinia carotovora subsp. carotovora. Изолят P. putida PP22 подавлял рост широкого спектра фитопатогенных бактерий на питательной среде, включая 24 вида возбудителей мокрой гнили (родов Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Cytophaga)[117].
Во многих публикациях отражено [88,108,117], что антагонисты р. Pseudomonas отличаются широким спектром антагонистической активности, и по праву рассматриваются авторами как потенциальные агенты биологической защиты.
Изучение оптимальных способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов рода Pseudomonas
Для определения характера воздействия выделенных изолятов псевдомонад на растения проводили бактеризацию семян сельскохозяйственных культур суспензией клеток штаммов-антагонистов. Наличие ростстимулирующего, ингибирующего либо нейтрального эффекта определяли, сравнивая всхожесть семян растений в контрольном (замачивание семян в дистиллированной воде, либо в стерильной питательной среде Кинг В) и опытных вариантах.
Испытания проводили во влажной камере, а также была поставлена серия вегетационных опытов. Для обработки семян использовали двухсуточную КЖ штаммов псевдомонад, полученную при выращивании на среде Кинг В (титр 1,0-9,1-Ю9 КОЕ/мл).
Для проращивания семян во влажной камере использовали культуры томата, огурца, свеклы, капусты. Замачивание семян проводили, исходя из трех объемов КЖ: 1-10 мл КЖ/г семян (семена полностью погружены в жидкость); П-500 мкл КЖ/г семян 108 КОЕ/г семян; Ш-50 мкл КЖ/г семян-10 КОЕ/г семян. Брали по сто семян на вариант. Обработанные семена раскладывали на увлажненную до полной влагоемкости фильтровальную бумагу в чашки Петри и помещали в термостат при 28С. Определение процента всхожести семян проводили на вторые и четвертые сутки инкубации.
Вегетационные опыты осуществляли с использованием семян клевера, овсяницы, пшеницы и редиса. Предпосевная обработка вышеназванных семян проводилась из расчета —10 КОЕ/г семян. В каждом варианте использовалось по пятьдесят семян, опыт проводили в тройной повторности. После бактеризации растения высаживались в сосуды с почвой (чернозем выщелоченный тяжелосуглинистый). Наблюдение за ростом растений проводили в течение двух недель. Характер воздействия штаммов псевдомонад на растения оценивали, сравнивая процент всхожести семян, а также вес и длину сырой зеленой массы проростков в опытных и контрольном вариантах.
Изучение выживаемости штаммов в условиях жидкой культуры проводили на среде Кинг В. В каждом из вариантов опыта использовалась двухсуточная КЖ в объеме 100 мл. Конические стеклянные колбы объемом 250 мл с КЖ штаммов хранили при разных температурных режимах: в холодильнике (6С), в термостате (26С), а также при комнатной температуре (22С). Численность жизнеспособных клеток определяли путем высева тщательно перемешанного содержимого колб на среду МПА из серийных разведений и подсчета выросших колоний.
Для исследования влияния адсорбирующих материалов на жизнеспособность и антифунгальную активность штаммов псевдомонад в качестве носителей использовали оксид алюминия (глинозем) А1203, оксид магния (жженая магнезия) MgO, а также каолин-глину белого цвета, состоящую из природного глинистого минерала каолинита. Материалы-носители стерилизовали сухим жаром при 180С в течение трех часов. В качестве объекта исследования был выбран штамм P. aureofaciens ИБ 51, который выращивали в жидкой среде Кинг В в течение двух суток. Титр готовой бактериальной суспензии составлял 1,2-101 КОЕ/мл. В стерильные материалы вносили КЖ штамма из расчета 30% и 50% по весу и тщательно перемешивали до получения однородной массы стерильным шпателем. Полученные препараты хранили в холодильнике при 6С. Для контроля стерильности носителей перед началом эксперимента, а также для учета численности жизнеспособных клеток на адсорбентах в течение опыта вносили по 1 г навески препарата в колбы со 100 мл стерильной водопроводной воды, затем содержимое колб перемешивали в течение 40 мин на качалке (п= 100 об/мин) и проводили высев из серийных разведений на МПА.
Для изучения возможности хранения культур на силикагеле за основу был взят метод Перкинса [36]. Объектом исследования послужил штамм Р. putida ИБ 17. Для приготовления бактериальной суспензии культуру выращивали на косяке МПА в течение пяти суток. Пенициллиновый пузырек, на половину заполненный силикагелем КСМГ (ГОСТ 3956-76), стерилизовали сухим жаром при 180С в течение полутора часов и затем вносили 0,5 мл бактериальной суспензии, полученной смывом стерильным обезжиренным молоком с косяка (титр 1,9 109 КОЕ/мл). Содержимое пенициллинового пузырька тщательно перемешивали. Пузырек хранили в закрытом состоянии в холодильнике при 6С. Проверка жизнеспособности клеток штамма на силикагеле осуществлялась путем высева нескольких бусин на свежий косяк МПА. Косяк помещали в термостат при 28С на семь суток. О жизнеспособности культуры судили по колониям бактерий, образующимся на МПА вокруг бусин силикагеля.
Метод хранения микроорганизмов в лиофильно-высушенном состоянии является одним из наиболее оптимальных способов длительной консервации культур в лабораторных условиях. Целью наших исследований было выяснение вопроса о влиянии лиофилизации на антагонистические свойства культур псевдомонад.
Для подготовки культур к лиофилизации их выращивали на агаризованной среде Кинг В сплошным газоном в течение двух суток. Далее клетки суспендировали в среде, содержащей 24%-ный раствор сахарозы, разведенный равным объемом стерильной среды Кинг В. В каждую ампулу наливали по 400 мкл суспензии бактерий. Лиофилизацию проводили в течение двадцати часов на лиофильной сушилке «Иней 3-2». Восстановление культур из лиофилизированного состояния и проверку жизнеспособности бактерий проводили в соответствии с рекомендациями, описанными в «Методах общей бактериологии» [34].
Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов рода Pseudomonas
Возможно, это связано со временем, которое необходимо для накопления в среде достаточного количества продуктов метаболизма антигрибного действия. В пользу данной версии говорит то, что по истечении 24 часов уже наблюдались явные отличия в развитии темно-окрашенных грибов на контроле и под воздействием антагонистов, т.е., можно предположить, что как раз к этому времени начинается продуцирование в среду продуктов метаболизма бактерий, обладающих фунгистатическим действием.
Опыт, в котором питательная среда сначала насыщается метаболитами штаммов-антагонистов, исключая контаминацию последними субстрата, а затем на эту же самую среду высевается суспензия спор фитопатогена, показал следующее. Даже по истечении четырех суток конидии Bipolaris sorokiniana, высеянные на среду, содержащую бактериальные метаболиты Р. aureofaciens ИБ 51, не проросли, тогда как на контрольных чашках и на чашках, где выращивали P. denitrificans 20, уже через 6 часов, можно было говорить о массовом прорастании спор, а через сутки наблюдали сплошной рост гриба.
Что касается микромицетов Fusarium oxysporum и Fusarium culmorum, то эти патогены оказались более устойчивыми к действию метаболитов, вырабатываемых штаммом P. aureofaciens ИБ 51. Через 48 часов часть спор Fusarium oxysporum и Fusarium culmorum все-таки образовали ростковые трубки, но растущие гифы характеризовались морфологическими изменениями, выразившимися в усилении ветвления мицелия. Задержка прорастания спор и задержка формирования мицелия данных патогенов под воздействием веществ, секретируемых в среду P. aureofaciens ИБ 51, в конечном итоге привела к тому, что даже через семь суток ни тот, ни другой гриб так и не сформировали полноценный газон, а остались на уровне зачаточных микроколоний.
Поставленный эксперимент доказывает, что, при условии, когда у бактерий достаточно времени для синтеза антибиотических веществ (как в случае выращивания на целлофане), развитие гриба можно контролировать на уровне прорастания спор. При совместном же культивировании к тому времени, когда в среду начинает поступать достаточное количество антигрибных метаболитов, патоген успевает уже достаточно развиться, и эффективность воздействия антагонистов резко снижается.
Таким образом, анализ данных, полученных при снятии спектра антагонистической активности штаммов псевдомонад, показал, что выделенные изоляты активно подавляют развитие широкого круга фитопатогенных грибов, в числе которых основные возбудители корневых гнилей злаковых культур - Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium avenaceum, Bipolaris sorokiniana.
При изучении влияния, которое оказывают метаболиты штаммов псевдомонад на грибы, было отмечено, что наблюдается сильная задержка прорастания спор фитопатогенов, а формирующийся мицелий микромицетов отличается ярко выраженными морфологическими изменениями. Так, под воздействием метаболитов штаммов-антагонистов происходит замедление развития ростковых трубок на 66,5-97,4%. Нарушение нормального роста гиф гриба приводит, в свою очередь, к формированию излишне разветвленного, часто септированного мицелия.
Для того чтобы определить, чем обусловлен антагонизм выделенных нами штаммов псевдомонад по отношению к фитопатогенным грибам, были проведены следующие исследования. Хорошо известно, что одним из основных механизмов биологического контроля, используемых псевдомонадами, является их способность к образованию сидерофоров -пигментов, обладающих сродством к трехвалентному железу [90, 98, 119, 155 и др.]. В условиях избытка железа антифунгальные свойства сидерофорпродуцирующих культур снижаются. Для того чтобы выяснить, обусловлен ли антагонизм выделенных нами штаммов псевдомонад по отношению к фитопатогенным грибам конкуренцией за железо, необходимо было проверить антифунгальные свойства культур в условиях избытка данного макроэлемента.
На чашках со средой Кинг В в присутствии железа было отмечено изменение внешнего вида колоний бактерий: колонии штаммов P.putida ИБ 56, P.putida ИБ 17, Pseudomonas sp. ИБ 182 приобрели коричневую окраску; для колоний штаммов P. aureofaciens ИБ 51 и P. aureofaciens ИБ 6 наблюдали увеличение интенсивности оранжевой пигментации. Внесение в среду железа подавляло синтез желто-зеленых флуоресцирующих пигментов псевдомонад.
В целом, проведенные нами исследования показали (табл.16), что антагонистическая активность выделенных штаммов не лимитируется присутствием железа в среде, т.е., по-видимому, антифунгальные свойства культур определяются синтезом не сидерофоров, а веществ другой природы.
Известно, что у некоторых штаммов бактерий-антагонистов способность подавлять рост и развитие грибов-фитопатогенов, связана с синтезом хитиназ [13,48]. Для бактерий p. Pseudomonas наличие хитинолитической активности является достаточно редким свойством [83]. Среди исследуемых штаммов псевдомонад способность к продуцированию хитинолитических ферментов была обнаружена только у штамма бактерий Pseudomonas sp. ИБ 182. Хитинолитическая активность данной культуры составила 5,75 мм/мм. На данном этапе исследований роль хитиназы,
Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза, твердой головни в условиях вегетационных и полевых опытов
Использование псевдомонад для защиты зерновых культур от болезней вызывает у исследователей значительный интерес. Выявлено, что штаммы-антагонисты p. Pseudomonas могут быть использованы против возбудителей корневых гнилей пшеницы [158] и ячменя [22], фузариоза пшеницы [4], септориоза и листовой ржавчины пшеницы [146], против поражения растений озимой пшеницы грибом Rhizoctonia solani [137] и т.д. В опытах in vitro мы показали, что новые штаммы псевдомонад P. aureofaciens ИБ 51, Р. aureofaciens ИБ 6, P. putida ИБ 56, P. putida ИБ 17, Pseudomonas sp. 182 являются антагонистами возбудителей альтернариоза и корневых гнилей пшеницы. Задачей дальнейших исследований было определить, сохраняется ли у выделенных штаммов псевдомонад антагонизм в отношении данных фитопатогенов в условиях in vivo.
По результатам лабораторных экспериментов на яровой пшенице было установлено, что в случае естественной инфекционной нагрузки на семенах исследуемые штаммы псевдомонад способствовали снижению распространения гельминтоспориозной корневой гнили в среднем на 60,3-87,3%. Наряду с этим отмечено также, что бактеризация семян пшеницы штаммами P. aureofaciens ИБ 51, P. aureofaciens ИБ 6, Pseudomonas sp. 182 привела к снижению распространения грибов p. Alternaria на 54,7%; 53,5%; 51,4% соответственно (табл. 24).
Используемые в данном модельном эксперименте в качестве аналогов биологические препараты планриз и фитоспорин продемонстрировали высокую биологическую эффективность по отношению к возбудителю корневых гнилей пшеницы Bipolaris sorokiniana (71,4% и 55,6% соответственно), но оказались малоэффективными против альтернариоза проростков. Таким образом, очевидно, что новые штаммы псевдомонад в условиях естественного инфекционного фона заражения не уступают известным биологическим препаратам в эффективности воздействия на фитопатогены.
Для химического фунгицида Дивиденд отмечена 100% эффективность по подавлению развития корневых гнилей, а также наибольшая биологическая эффективность в подавлении распространения альтернариоза семян-74,1 %.
Статистическая обработка данных, характеризующих процент непроросших семян, а также процент ненормально развивающихся проростков, не выявила достоверных отличий ни в одном из вариантов по отношению к контролю (даже обработка Дивидендом не повлияла на всхожесть семян). По-видимому, всхожесть в данном случае никак не зависела от инфекционной нагрузки на зерне, а являлась характеристикой данного посевного материала.
Несмотря на высокую эффективность химического фунгицида по сравнению с биологическими средствами защиты против болезней пшеницы было отмечено, что биопрепарат планриз, а также штаммы псевдомонад Р. aureofaciens ИБ 51, P. aureofaciens ИБ 6, Pseudomonas sp. 182 способствовали увеличению длины проростков пшеницы по сравнению с контролем в среднем на 9-18,8%, тогда как Дивиденд не оказывал ростстимулирующего воздействия на молодое растение.
Последующий опыт с дополнительным заражением посевного материала фитопатогенами показал, что только один из исследуемых штаммов P. aureofaciens ИБ 6 успешно справлялся с присутствием на зернах повышенной инфекционной нагрузки, в том числе полностью подавлял распространение фузариозной корневой гнили (табл.25). Вообще, при дополнительной инфекционной нагрузке эффективность от применения фунгицидов как биологической, так и химической природы либо снизилась, либо полностью отсутствовала. Так, хотя штаммы P. aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas sp. 182 характеризовались 100% эффективностью в отношении фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum, их биологическая эффективность в отношении других фитопатогенов, присутствующих на зернах, не была подтверждена статистически.
Было отмечено также, что в опыте с дополнительным инфицированием посевного материала исследуемые псевдомонады не смогли проявить свои ростстимулирующие свойства, отмеченные в предыдущем эксперименте. Только для штамма P. aureofaciens ИБ 51 выявлено статистически подтвержденное превышение длины проростков над контролем, в среднем, на 13,8%.
На следующем этапе изучался вопрос об эффективности применения бинарных смесей штаммов-псевдомонад для защиты пшеницы от болезней. В предыдущих экспериментах наибольшей биологической эффективностью в борьбе против корневых гнилей и альтернариоза пшеницы при разных уровнях инфекционной нагрузки характеризовался штамм P. aureofaciens ИБ 6, поэтому он и был выбран в качестве постоянного компонента бактериальных смесей, а варианты обработок были составлены за счет добавления к нему других штаммов-антагонистов.
