Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Материалы и методы
1.1. Материалы
1.2. Методы
1.2.1. Исследование культурально-биохимических свойств бактерий .Bacillus
1.2.2. Исследование культурально-биохимических свойств микроорганизмов
1.2.3. Определение устойчивости бактерий к действию биологических жидкостей
1.2.4. Методы изучения безопасности
1.2.4.1. Изучение безвредности
1.2.4.1.1. Изучение вирулентности
1.2.4.1.2. Изучение токсичности
1.2.4.1.3. Изучение токсигенности
1.2.4.2. Изучение острой и хронической токсичности
1.2.5. Определение антагонистической активности
1.2.6. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника крыс или мышей
1.2.7. Оценка персистирования штаммов рода Bacillus в желудочно-кишечном тракте мышей
1.2.8. Изучение влияния препарата Ирилис на физиологические показатели периферической крови животных
1.2.9. Методы статистической обработки результатов исследований
ГЛАВА 2. Доклинические исследования препарата ирилис
2.1 Изучение кулыуральных, биохимических и морфологических свойств бактерий рода Bacillus
2.2 Изучение безопасности штаммов
2.3 Изучение биологических свойств штаммов пробиотиков в опытах in vitro
ГЛАВА 3. Клинические исследования препарата ирилис
3.1. Изучение лечебной эффективности Ирилиса при миксоматозе кроликов
3.2. Исследования влияния Ирилиса на рост и сохранность молодняка кроликов
Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы
- Исследование культурально-биохимических свойств бактерий .Bacillus
- Метод определения адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника крыс или мышей
- Изучение кулыуральных, биохимических и морфологических свойств бактерий рода Bacillus
- Изучение лечебной эффективности Ирилиса при миксоматозе кроликов
Введение к работе
Актуальность темы
Согласно данным Департамента ветеринарии РФ, патология ЖКТ инфекционной этиологии, в общей структуре заболеваний молодняка животных составляет до 75% (26; 29).
Особенности этиологии и патогенеза инфекционных желудочно-кишечных заболеваний молодняка неонатального возраста связаны со структурными, количественными и качественными нарушениями в микробиоценозе кишечника, снижением активности колострального иммунитета, низкой естественной резистентностью, повышенной восприимчивостью новорожденных к бактерийным и вирусным антигенам, поступающим пероральным путем (27; 28; 60).
Особенно остро эта проблема стоит в одной из приоритетных областей пушного животноводства - кролиководческой отрасли. По данным НИИ Пушного звероводства и кролиководства, до 50% новорожденных крольчат подвержены различным инфекционным заболеваниям. Падеж молодняка наблюдается в первые 20 дней жизни, в основном, от острых кишечных инфекций и пневмонии различной этиологии (45; 47; 55).
Использование антибиотиков для профилактики желудочно-кишечных болезней, ассоциированных с дисбиотическими явлениями в микробиоценозе кишечника животных, проблему усугубило. Негативные последствия фармакологического прессинга выразились в нарастании быстрыми темпами множественной лекарственной резистентности условно патогенных микроорганизмов, адаптации бактерий к несвойственным им экологическим нишам, появлении и циркуляции в хозяйствах высоко вирулентных штаммов эшерихий, сальмонелл, стафилококков, иерсиний, кампилобактерий и др. микроорганизмов (9; 28; 70; 76).
С 2007 г в странах Евросоюза вводится полный запрет на использование пищевых антибиотиков ветеринарного назначения (89). Вышеизложенное заставляет исследователей пересмотреть многие методологические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями, которых являются условно патогенная бактериальная микрофлора.
Недостаточная эффективность традиционных мероприятий, направленная на повышение сохранности молодняка, обусловливает необходимость применения принципиально новых эффективных препаратов (5; 18; 64).
Наиболее полно этим требованиям отвечают пробиотики - препараты, содержащие живые микроорганизмы. Аспекты использования пробиотиков в ветеринарии затрагивают широкий круг проблем, который включает коррекцию кишечного биоценоза, иммунной, гормональной и ферментной систем животных (4; 12; 15; 77; 79; 84; 102).
В последние годы в ветеринарной практике в качестве препаратов-пробиотиков для терапии и профилактики желудочно-кишечных и других инфекций находят широкое применение бактерии рода Bacillus (32; 34; 35; 37; 38; 40; 44; 52; 83). В странах Евросоюза активно используются препараты Paciflor СЮ, основу которого составляет штамм В. cereus АТСС 1489; Toyocerin (В. сег-eus var toyoi NCIMB-40112/CNCM-1012); BioPlus 2В (Я subtilis DSM 5750 и В. licheniformis DSM 5749) и некоторые другие (61; 62; 83; 89; 115). Следует отметить, что только японский препарат Toyocerin с успехом применяется при лечении заболеваний кроликов (89,122).
В ветеринарную практику Российской Федерации внедрены несколько бациллярных пробиотических препаратов: Споровит, Ветом-4, СЛ-бактерин, Спо-ролакт, Ветбактерин, Субтилис, Биоплюс 2Б (1; 15; 35; 37; 38; 39; 40). Но ни один из перечисленных пробиотиков не применяется в кролиководстве. В последнее время российскими учеными разработан новый ветеринарный препарат Ирилис, включающий штаммы В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336 и обладающий рядом преимуществ перед отечественными и зарубежными аналогами (32). Однако этот препарат также не испытывался в кролиководстве.
Использование бациллярных препаратов в ветеринарии делает необходимым тщательное изучение безопасности применяемых культур. В тоже время, практически отсутствуют данные об изучении патогенности используемых штаммов пробиотиков (31).
Кроме того, также требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств штаммов, обеспечивающих лечебную эффективность препаратов (82; 83; 91).
7 Цели и задачи исследований
Целью исследования явилось изучение биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис (Я subtilis ВКПМ2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336) in vitro и in vivo и внедрение его в систему лечебно-профилактических мероприятий при выращивании кроликов.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
Сравнительное исследование пробиотических культур, входящих в перспективный ветеринарный препарат Ирилис и коммерческий пробиотик Paciflor СЮ, по физиолого-биологическим характеристикам.
Изучение безопасности штаммов исследуемых пробиотиков.
Сравнительное исследование колонизационной активности (антагонизма, адгезивных свойств и персистирования в желудочно-кишечном тракте) штаммов, входящих в Ирилис и Paciflor СЮ.
Проведение клинических испытаний и оценка лечебной и профилактической эффективности ветеринарного пробиотика Ирилис.
Научная новизна
Впервые при сравнительном изучении биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис выявлено его преимущество перед коммерческим ветеринарным препаратом Paciflor СЮ и доказана его безопасность для использования в ветеринарной практике.
Впервые продемонстрировано преимущество пробиотического препарата Ирилис перед коммерческим ветеринарным препаратом Paciflor СЮ по антагонистической активности в отношении клинических штаммов УПБ, выделенных от больных кроликов.
Впервые доказана терапевтическая эффективность перспективного пробиотика Ирилис на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов, позволившая значительно снизить падеж животных в различных возрастных группах, а также увеличить привес животных.
Практическая значимость
Показана высокая лечебно-профилактическая эффективность перспективного препарата Ирилис на поголовье кроликов в хозяйстве, длительно неблагополучном по многим инфекционным и инвазионным заболеваниям.
Изучено влияние пробиотика на рост, развитие и сохранность молодняка кроликов. Полученные данные подтверждены актами, утвержденными руководителями хозяйств. Разработаны наставления по применению ветеринарного пробиотического препарата Ирилис в кролиководческих хозяйствах.
Положения, выносимые на защиту
При разработке новых пробиотических препаратов ветеринарного назначения на основе спорообразующих бактерий необходимо проведение доклинических испытаний штаммов, входящих в пробиотики для ветеринарной практики.
Сравнительные исследования нового ветеринарного пробиотика Ирилис с коммерческим препаратом Paciflor СЮ выявили преимущество первого по показателю безопасности и специфической активности.
Экспериментально-клиническое изучение перспективного пробиотика Ирилис свидетельствует об его высоком лечебно-профилактическом потенциале.
Апробация результатов диссертации
Основные результаты диссертационной работы доложены и представлены в материалах научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н. Новгород 2006 г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва 2006 г.), на заседании кафедры микробиологии РУДН (2006,2007).
9 Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России, и в материалах всероссийских конференций.
Объем и структура работы
Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 92 страницах текста компьютерной верстки и иллюстрирована 24 таблицами и 12 рисунками. Список литературы представлен 126 источниками (59 отечественными и 67 зарубежными).
Исследование культурально-биохимических свойств бактерий .Bacillus
По данным НИИ Пушного звероводства и кролиководства до 50% новорожденных крольчат подвержены различным инфекционным заболеваниям. В структуре заболеваний кроликов 7- 10-недельного возраста наиболее частыми являются желудочно-кишечные заболевания, и в первую очередь - энтероколит (слизистая энтеропатия или слизистый энтерит), характеризующийся высокой смертностью, подострым течением, анорексией, полидиспепсией, пониженной температурой тела, скоплением газов в кишечнике и слизистыми или дегтеобразными фекалиями. Этиология этого заболевания до сих пор окончательно не установлена, хотя ранее выдвигались версии как инфекционного (вирусного и бактериального), так и незаразного генеза энтероколита кроликов. В настоящее время большинство исследователей склонны считать слизистый энтероколит полиэтиологическим заболеванием, на возникновение и развитие которого оказывают влияние такие факторы, как рацион кормления, состав кишечной флоры и физиологическое состояние пищеварительной системы после перехода от материнского молока к основному рациону. Но основным патологическим механизмом является размножение грамотрицательных микроорганизмов и продукция ими токсинов на фоне снижения уровня рН в кишечнике, что вызывает гиперплазию бокаловидных клеток ЖКТ и клинические проявления болезни. При этом основными бактериальными патогенами являются такие микроорганизмы, как энтеропатогенные штаммы кишечной палочки (Е. coli), синегнойная палочка (P. aeruginosa) и в значительно меньшей степени клостридии (С. welchii, С. perfringens) (45; 47; 55; 60).
Анализ данных динамики смертности при этой нозологии показывает, что критическим периодом являются первые дни болезни, поэтому терапевтические мероприятия необходимо начинать как можно раньше, а лучше всего, руководствоваться тактикой предотвращения заболевания (18; 21; 29; 36; 45).
В условиях промышленного выращивания молодняка кроликов большой процент заболеваний приходится на различные респираторные заболевания, среди которых наиболее распространена бронхопневмония. Бронхопневмония реги 21 стрируется в различных регионах страны и по удельному весу занимает второе место после желудочно-кишечных заболеваний, достигая 20-30% от всей патологии в кролиководческих хозяйствах. В результате заболевания снижается среднесуточный прирост живой массы, поэтому лечение и профилактика брон- хопневмонии является вопросом первостепенной важности, который требует своевременного и грамотного решения (45; 47; 57).
Согласно наиболее распространенным мнениям исследователей, бронхопневмония - это полиэтиологическое заболевание, проявляющееся воспалением бронхов и долей лёгкого с накоплением в альвеолах экссудата и клеток десква-мированного эпителия. Патологический процесс начинается с появления в легких и легочной паренхиме серозного экссудата, что соответствует картине катарального воспаления лёгких у взрослых животных, но так как первично поражаются бронхи и процесс быстро распространяется по бронхиальному дереву, то такое заболевание, отмечающееся преимущественно у молодняка, принято называть бронхопневмонией (19; 29; 45; 47).
При бронхопневмонии кроликов патологические процессы развиваются не только в органах дыхания, но и во всем организме. Нарушаются все виды обмена веществ, нарушаются функции всех жизненно важных органов и систем, то есть развивается комплекс расстройств (45; 47).
Несмотря на разногласия исследователей по вопросу этиологии заболевания, очевидно значение бактериальной флоры в развитии патологического процесса при бронхопневмонии. Если анализировать данные из хозяйств, то можно отметить, что наиболее часто из патологических очагов выделяются следующие возбудители: Staphylococcus spp., Streptococcus spp, Diplococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Bacteroides, Bordetella, Pasteurella, Chlamydia spp. При этом зачастую выявляется комплекс возбудителей. Аналогичные данные приводят зарубежные исследователи (96; 101; 108; 110; 122).
Лечение больных животных с диагнозом "бронхопневмония" проводится во многих случаях лишь с использованием средств антимикробной терапии без учета анамнеза и выделения больных в отдельные группы в зависимости от течения заболевания и его тяжести. Отсутствует корректный подбор схемы лечения, антибиотика, средств заместительной терапии, что в сочетании с непра 22 вильно организованными условиями содержания и кормления приводит к несостоятельности проводимых мероприятий (2; 18; 41).
Наибольшую опасность для поголовья кроликов в целом представляют вирусные заболевания, наиболее тяжелым из которых является миксоматоз. Это заболевание может принимать размеры панзоотии, т. е. распространяться на территории всей страны, нескольких стран или материков. Широкому распространению миксоматоза способствует чрезвычайно высокая его контагиозность, и возможность передачи вируса через летающих кровососущих насекомых. Болезнь наносит значительный экономический ущерб кролиководческим хозяйствам разных форм собственности. Появившись в стаде (на ферме) впервые, это заболевание протекают очень тяжело, вызывая гибель до 99,5% поголовья животных (16; 29; 45).
Исследователи считают, что на фоне относительного благополучия по миксоматозу в России в 2005 году началась новая волна этого заболевания (55). Болезнь получила широкое распространение. По данным эпизоотологических исследований, болезнь регистрировалась в Новгородской, Ивановской, Тверской, Московской, Белгородской и Воронежской областях РФ. Причем выявлена циркуляция высоковирулентного вируса, так как инкубационный период при постановке биопробы длился лишь три дня, что характерно для высоковирулентных штаммов возбудителя (55).
В результате анализа сложившейся ситуации исследователи пришли к выводу, что болезнь проявилась среди кроликов с недостаточно напряженным иммунитетом к возбудителю миксоматоза. В группе риска заражения оказался молодняк, имевший низкий уровень колостральных антител, тогда как подсосные крольчата до 45-дневного возраста и ревакцинированные кроликоматки не заболевали (45).
Метод определения адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника крыс или мышей
Со времени открытия способности определенных микробных культур ин-гибировать рост и развитие других микроорганизмов, виднейшие естествоиспытатели (Л. Пастер, И.Мечников, Н.Гамалея, Л.Перетц и др.) работали над проблемой практического использования феномена микробного антагонизма. Широкое признание и отражение в трудах многих биологов и врачей нашли идеи И.И.Мечникова, предложившего использовать для борьбы с инфекционными и другими заболеваниями, вызванными патогенными и условно патогенными микроорганизмами, штаммы живых микробных культур-антагонистов. Как известно, крупнейшие научно-практические разработки, основанные на идее использования микробов-антагонистов, получили повсеместное признание. С успехом применяются биопрепараты, созданные из культур лактобактерий, кишечных палочек, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий, аэрококков и
Однако разнообразие форм проявлений дисбиозов, а также ограниченность спектра специфической активности существующих пробиотиков диктуют необходимость разработки новых биопрепаратов.
Одной из наиболее перспективных групп бактерий, на основе которых можно создавать принципиально новые биопрепараты, являются бактерии рода Bacillus. Для лечения и профилактики острых инфекционных заболеваний у животных российскими учеными создан перспективный ветеринарный пробиотик Ирилис (31; 32). Он представляет собой ассоциацию живых микробных культур B.subtilis ВКПМ 2335 (07) и B.licheniformis ВКПМ 2336 (09). Однако этот препарат не испытывался в кролиководстве.
Сравнительное исследование пробиотических культур В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336 и штамма В. cereus АТСС 1489 (составляю-щего основу коммерческого пробиотика Paciflor СЮ), показало, что все культуры обладают типичными биохимическими характеристиками. Отмечено, что культуры, входящие в Ирилис, существенно различались своими физиолого-биохимическими характеристиками. В. subtilis ВКПМ 2335, в отличие от Я licheniformis ВКПМ 2336, не проявил способности к росту в анаэробных условиях, что является одним из показателей различной адаптационной возможности культур в разных отделах ЖКТ. Различаются они и по другим свойствам, среди которых - ферментация углеводов, продукция аргининдегидролазы и пр. В отличие от штамма В. cereus АТСС 1489 штаммы ВКПМ 2335 и ВКПМ 2336 характеризуются отсутствием гемолитической активности, не проявляют вирулентность, токсичность и токсигенность. Культуры не продуцируют ферменты, способные обусловливать патогенные свойства препарата (лецитиназа, гиалуро-нидаза).
Важным этапом работы было исследование безвредности, токсичности, токсигенности, вирулентности, острой и хронической токсичности штаммов-продуцентов. Проведенные исследования на животных показали, что штаммы B.subtilis ВКПМ 2335 и B.licheniformis ВКПМ 2336, в отличие от штамма В.сегеш АТСС 1489, не токсичны, не токсигенны, не вирулентны, что свидетельствует об их безвредности. Помимо этого, изучение влияния Ирилис на морфологический состав и свойства крови показало, что препарат не влияет на состав и свойства крови животных. Пробиотик не оказывал побочного действия на организм, не вызывал осложнений и аллергических реакций, хорошо переносился животными. Следовательно, длительное пероральное введение изучаемых пробиотических штаммов рода Bacillus, входящих в Ирилис, является безопасным, поскольку не приводит к развитию токсических или инфекционных осложнений.
При изучении "острой" и "хронической" токсичности выявлено, что животные всех групп (кроме мышей, которым вводили В. cereus АТСС 1489) во время периода наблюдения были здоровы, активны, их поведенческие реакции не были нарушены, масса тела не снижалась, не выявлены побочные эффекты или осложнения, связанные с введением культур. Не было отмечено каких-либо патологических изменений при макро- и микроскопическом изучении ЦНС и внутренних органов животных. В то же время при исследовании «острой» токсичности в группе животных, которым вводили в/б культуры В. cereus АТСС 1489 в дозе ІхІО9 КОЕ/0,5мл, отмечалась тотальная гибель. Гибель 50% мышей имела место при введении В. cereus АТСС 1489 в дозе 0,5x109 КОЕ/0,5 мл. У выживших животных объективно отмечались: снижение массы тела, вялость, диарея. При макроскопическом исследовании выявлены: неравномерное полнокровие внутренних органов и резкое полнокровие печени, кровоизлияния, признаки шоковых реакций в селезенке, ишемия коры почек, эмфизематозные изменения легких. На 7-е сутки интенсивность указанных изменений значительно снижалась.
Сплено- и гепатомегалия - характерные признаки инфекционного процесса. В исследовании «хронической» токсичности не обнаружено микроскопических изменений морфологии селезенки и печени у животных, получавших исследуемые штаммы. Селезеночный индекс мышей, которым вводили изучаемые штаммы, не отличался от показателей животных контрольной группы /р 0,05/.
При бактериологическом исследовании крови и внутренних органов животных установлено отсутствие диссеминации этих культур, т. е. изучаемые штаммы являются неинвазивными.
Следует отметить, что штамм В. cereus АТСС 1489, в отличие от штаммов В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336, характеризуется гемолитической активностью, а исследования, проведенные Научным Комитетом по питанию животных при Европейской Комиссии (SKAN), выявили у данного штамма способность к продукции энтеротоксинов НЫ и Nhe (2003). Таким образом, штамм В. cereus АТСС 1489, входящий в коммерческий препарат Paciflor СЮ, обладает выраженными вирулентными свойствами.
Следующим этапом нашей работы было изучение чувствительности штаммов бактерий рода Bacillus к действию желудочного сока и желчи. Показано, что наиболее чувствительным к желчи и желудочному соку из исследуемых культур оказался штамм В. cereus АТСС 1489.
Важнейшей характеристикой колонизационной активности пробиотиче-ских штаммов является изучение антагонизма и адгезии. В проведенном сравнительном изучении антагонистической активности (АА) Ирилиса и Paciflor СЮ особое внимание было уделено изучению воздействия этих биопрепаратов на культуры, выделенные от больных кроликов, и тест-штаммы, используемые при контроле пробиотиков.
Изучение кулыуральных, биохимических и морфологических свойств бактерий рода Bacillus
Бактериологическое исследование показало, что Ирилис не только не оказывал отрицательного влияния на облигатных представителей кишечной микрофлоры, но и способствовал нарастанию их количества. После проведенного лечения возрастало количество бифидо- и лактобактерий (с 104 до 106КОЕ/г). Применение Ирилиса способствовало элиминации УПБ из легких, а обсеменен-ность фекалий энтеробактериями и кокками под воздействием препарата снижалась в 2-3 раза.
В контрольных группах выявлена тенденция к ухудшению бактериологических показателей: понижение количества бифидо- и лактофлоры, уровень УПБ оставался без изменения, а в некоторых случаях зарегистрирован рост бактерий (например, количество стафилококков, Proteus mirabilis увеличилось на два порядка). Выявлено усиление контаминации УПБ в легких, являющейся причиной пневмонии.
Таким образом, проведенные испытания перспективного ветеринарного про-биотика Ирилис показали высокую терапевтическую эффективность и возможность его применения в ветеринарной практике для лечения секундарных инфекций.
На втором этапе исследования изучали влияние пробиотика Ирилис на сохранность, рост и развитие молодняка кроликов в хозяйстве, длительно неблагополучном по многим инфекционным заболеваниям бактериальной и вирусной этиологии, в зимнее время. Испытания профилактической эффективности Ирилиса проведены на 239 особях молодняка кроликов обоего пола пород «Серебристый», «Черно-бурый» и «Белый великан» в возрасте до 120 дней и на 36 самках в возрасте до 2 лет.
Для проведения опыта по возрастному принципу методом случайной выборки было сформировано: 1-я и 2-я основные и 1-я и 2-я контрольные группы животных. Условия содержания групп были идентичны. С целью изучения опо 80 средованного влияния препарата на организм новорожденных, самки 1 основной группы получали Ирилис per os, в дозе 5x10 КОЕ/мл, в течение 7 суток. Вторую основную группу составил молодняк кроликов в возрасте после отъема, получавший препарат per os, в дозе 1x109 КОЕ/мл, в течение того же времени. Самки и молодняк аналогично сформированных контрольных групп во время проведения эксперимента ежедневно получали ЗФР в том же объеме. Длительность наблюдения в 1 опытной и 1 контрольной группах составила 120 сут; в 2 опытной и 2 контрольной - 90 суток. Профилактическая эффективность оценивалась по результатам сохранности, коррекции микробиоценоза и данным предубойного взвешивания.
Полученные данные свидетельствовали, что использование препарата Ирилис в процессе выращивания молодняка кроликов оказывает положительное действие на организм животных, обеспечивая сохранность поголовья выживших животных и больший прирост живой массы по сравнению с контролем. В контрольных группах выявлена высокая летальность (47,2% и 62,2%), тогда как в опытных группах она была более чем вдвое ниже (17,9% и 29,6%). При проведении патологоанатомического исследования кроликов контрольных групп обнаружены эмфизематозные изменения в легких, выявлена гнойная очаговая пневмония.
Бактериологическое исследование показало, что Ирилис оказывал корректирующее действие на кишечную микрофлору и способствовал увеличению количества бифидо- и лактобактерий (с 104 до 106КОЕ/г). Наиболее выраженное влияние Ирилиса выявлено при оценке обсемененности легких условно патогенными бактериями, которые не были обнаружены у кроликов 2 опытной группы. Обсемененность фекалий УПБ под воздействием препарата снизилась от 2 до 5 lg. Во 2 контрольной группе выявлена тенденция к ухудшению бактериологических показателей: понижение количества бифидо и лактофлоры, уровень УПБ оставался без изменения, а в некоторых случаях зарегистрирован рост стафилококков (на 2 lg). Выявлено усиление контаминации УПБ в легких, являющейся причиной пневмонии.
Изучение влияния перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис на сохранность, рост и развитие молодняка кроликов в хозяйстве, длительно не 81 благополучном по инфекционным заболеваниям, показало возможность применения препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний кроликов и при этом значительно снизить риск инфицирования молодняка кроликов УПМ.
Ирилис в ветеринарной практике для лечения секундарных инфекций при миксоматозе кроликов рекомендуется назначать per os в дозе 5х109 КОЕ /мл в течение 14 дней.
В хозяйствах, длительно неблагополучных по инфекционным заболеваниям бактериальной и вирусной этиологии для сохранности, роста и развития молодняка кроликов лактирующим самкам следует назначать Ирилис per os в дозе 5x109 КОЕ/мл, в течение 7 суток, молодняку кроликов в возрасте после отъема препарат- в дозе 1хЮ9КОЕ/мл в те же сроки.
Изучение лечебной эффективности Ирилиса при миксоматозе кроликов
Изучение персистирования штаммов .Bacillus и споровых пробиотиков проводили на мышах линии "ЫасК\ массой 14-16 г. В каждой группе было по 10 животных. Суточную культуру после роста на скошенной агаризованной среде Гаузе №2, смывали ЗФР и доводили до концентрации 2х109 КОЕ/мл. Пробиотик растворяли ЗФР из расчета 0,5 мл на дозу. По 0,5 мл суспензии культуры вводили через зонд per os однократно. Контрольным животным вводили 0,5 мл ЗФР. Мыши находились в отдельных клетках с сетчатым полом, чтобы исключить копрофагию.
Свежий кал взвешивали и гомогенизировали в ЗФР, затем путем последовательных десятикратных разведений высевали на агаризованную среду Гаузе №2. Посевы инкубировали при температуре 37 С в течение 48 ч. Выросшие колонии идентифицировали на основании морфологии колоний и микроскопической оценки размера и формы спор.
Изучение влияния препарата Ирилис на морфологический состав и свойства крови было проведено на 15 кроликах массой 2-2,5 кг. Было создано 3 группы животных - 2 опытных и 1 контрольная, по 5 голов в каждой. Кроликам I опытной группы перорально вводили Ирилис по 1 дозе в течение 10 дней ежедневно, а кроликам II опытной группы - в той же дозе в течение 30 дней ежедневно, после чего брали кровь на исследование. У кроликов контрольной группы, которым никаких препаратов не вводили, брали кровь на исследование на 10 и 30 дни с начала постановки опыта.
У кроликов как опытных, так и контрольной групп по общепринятым методикам определяли скорость оседания эритроцитов, лейкоцитарную формулу, содержание гемоглобина, общего белка, общего билирубина, подсчитывали количество эритроцитов.
За животными ежедневно вели клинические наблюдения и учитывали общее состояние, активность поедания корма, измеряли температуру, пульс и дыхание.
Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики. Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием непарного /-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р 0,05. Результаты в таблицах и на рисунках представлены в виде средней арифметической, ее стандартной ошибки (М±т) и коэффициента корреляции (г).
В структуре заболеваний человека и животных инфекции вирусной или смешанной (бактериально-вирусной) этиологии составляют значительную часть. В настоящее время для профилактики и лечения кишечных инфекций, вызываемых патогенными и условно патогенными бактериями, широко применяют про-биотики - биопрепараты на основе живых микробных культур, представителей нормальной микрофлоры кишечника. Наиболее эффективными среди пробио-титков являются препрараты на основе аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus, поскольку они характеризуются выраженной антагонистической активностью, которая проявляется к более широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, чем у других представителей нормофлоры желудочно-кишечного тракта. Однако среди известных пробиотиков нет высокоэффективных средств, характеризующихся выраженной антивирусной активностью. В настоящее время для лечения вирусных инфекций применяют препараты интерферона, которые являются дорогостоящими и неэффективными при пероральном введении. Для профилактики вирусных инфекций широко используют специфическую вакцинацию, однако для лечения эти препараты не применяются.
Поэтому создание высокоэффективных препаратов, характеризующихся как антибактериальными, так и антивирусными свойствами, является одной из важнейших проблем современной ветеринарной медицины, поскольку известно, что вирусные инфекции осложняются, как правило, бактериальными и наоборот. Наиболее перспективными для создания биопрепаратов с антибактериальными и антивирусными свойствами являются бактерии рода Bacillus. При отборе пробиотических штаммов основное внимание уделяют спектру и выраженности их антагонистической активности, и технологичности при производстве препаратов. Подобная характеристика является недостаточной, т.к. она не раскрывает механизм действия пробиотика, его взаимодействие с макроорганизмом и другими видами бактерий. Требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств, обеспечивающих безопасность и лечебную эффективность препарата.
