Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень её разработанности
Изучение частоты встречаемости инфекционных заболеваний, вызванных ассоциациями грамотрицательных и грамположительных бактерий, является весьма своевременным. Изменение этиологического спектра возбудителей многие исследователи связывают как с особенностями симбиотических взаимоотношений между бактериями, так и снижением иммунной реактивности организма в условиях ухудшения экологии и селективного воздействия антибактериальных препаратов (Proca Е. et al. Clinical comment on management of urosepsis in a general urological department I E. Proca et al. II Acta. Urol. Belg. 1992.Vol. 60, N 1. P. 41-56; Deal E.N. et al. Predictors of in-hospital mortality for bloodstream infections caused by Enterobacter species or Citrobacter freundii I E.N. Deal et al. II Pharmacother. 2007. N 2. P. 191-199; Smarda J. et al. Occurrence of strains producing specific antibacterial inhibitory agents in five general of Enterobacteriaceae I J. Smarda et al. II Curr. Microbiol. 2007. Vol.54, N2. P.113-118).
В последние годы показана этиологическая роль целого ряда условно-патогенных бактерий в возникновении инфекционного процесса различной локализации (Chang En-Pen et al. Clinical characteristics and predictors of mortality in patients with Enterobacter aero genes bacteremia II En-Pen Chang et al. II J.Microbiol. Immunol. Infect. 2009. Vol.42, P. 329-335; Dezinor O.Y. et al. Neonatal Sepsis and Meningitis in Haiti I O.Y. Dezinor II J.Trop. Pediatr. 2004. Vol. 50, N 1. P. 48-50). Однако в отношении микробных ассоциаций Enterobacter spp. и Staphylococcus aureus данный вопрос недостаточно изучен. Практически отсутствуют сравнительные данные о биологических свойствах сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus.
Как отмечают некоторые исследователи, инициируя патологический процесс, грамположительные кокки определяют условия для возможного развития в патологическом очаге как в особой экологической нише грамотрицательных микроорганизмов с имеющимся высоким персистентным потенциалом, что повышает вероятность развития тяжелого хронического процесса (Карпов И. А., Качанко Е.Ф. Стафилококковая инфекция: клинические аспекты и перспективы / И. А. Карпов, Е.Ф. Качанко // Медицинские новости. 2005. №9. С.53-56).
Актуальность этой проблемы также обусловлена широким распространением лекарственно-устойчивых штаммов в популяциях условно-патогенных бактерий и приспособлением их к внутренней среде организма (Зузова А.П., Козлова С.Н. Антимикробная терапия вентилятор-ассоциированной пневмонии: проблемы роста и распространения резистентных возбудителей/ А.П. Зузова С.Н. Козлова // Consilium medicum. 2006. Т.8,№3. С.26-32).
В настоящее время сложилось устойчивое мнение о том, что формирование популяции полирезистентных штаммов возбудителей станет
основной характеристикой микробной патологии (Yu Wen-Liang et al. Extended-spectrum beta-lactamases in Taiwan: epidemiology, detection, treatment and infection control I Wen-Liang Yu et al. II J. Microbiol. Immunol. Infect. 2006. Vol. 39, P. 264-277; Smarda J. et al. Occurrence of strains producing specific antibacterial inhibitory agents in five genera of Enterobacteriaceae I J. Smarda et al. II Curr. Microbiol. 2007. Vol.54, N.2. P.113-118).
Одновременное присутствие нескольких возбудителей приводит не только к суммированию патогенных свойств, но и вызывает взаимное усиление факторов вирулентности ассоциантов (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова, Л.М. Межбактериальные взаимодействия / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Л.М. Хуснутдинова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. № 4. С. 3-8; Габидуллин З.Г. и соавт. Характеристика свойств, определяющих персистенцию моно- и ассоциированных культур условно-патогенных энтеробактерий / 3. Г. Габидуллин и соавт. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. № 4. С. 62-64). Наряду с этим меняется и ответная реакция хозяина (макропартнера).
В иммунном ответе огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с фагоцитарной активностью макрофагов (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие / И.С. Фрейдлин. Л., 1986. 261с; Долгушин И.И. Андреева, Ю.С. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: метод обнаружения и оценки эффективности управления бактерий / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева / Журн. микробиол. 2009. №2. С. 65-67; Numan J. et al. In vitro phagocytosis of methicillin resistant and methicillin sensitive Staphylococcus aureus by human polymorphonuclear leucocytes I J. Numan et al. I J.Ayub. Med. Coll. Abbottabad. 2009. V.21, N2. P.49-52.).
Основные механизмы, обеспечивающие естественную резистентность макроорганизма, в той или иной степени представлены в литературе (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие /И.С. Фрейдлин. Л., 1986. 261 с; Stevens D.L. Superantigens: their role in infectious diseases I D.L. Stevens II Immunol. Invest. 1997. Vol. 26. P. 275-281.).
В доступной литературе имеется крайне малочисленная информация о биологических особенностях монокультур и сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus и их действии на фагоцитоз и кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов животных (Габрилович И.М., Бозиев В.Б., Габрилович М.И. Гетерогенность антилизоцимной активности в популяциях условно-патогенных энтеробактерий / И.М. Габрилович, В.Б. Бозиев, М.И. Габрилович // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. № 4. С. 32-33; Белобородов В.Б., Митрохин С.Д. Стафилококковые инфекции / В.Б. Белобородов, С.Д. Митрохин // Инфекции и антимикробная терапия. 2003. №1, Т.5. С.22-25; Гончарук Ю.Н. и соавт. Функциональная активность перитонеальных макрофагов мышей, зараженных
грамположительными бактериями / Ю.Н. Гончарук и соавт. // Журн. микробиол. 2006. №1. С. 48-51.).
Цель исследования
Изучить особенности некоторых биологических свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и их влияние на фагоцитоз и кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов мышей.
Задачи исследования
1. Провести сравнительное изучение у монокультур и
сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus
aureus адгезивной, гемолитической (а- и тиолзависимый гемолизин),
лецитиназной, дезоксирибонуклеазной, антилизоцимной,
антиинтерфероновой, антикомплементарной активностей, а также их
термолабильной энтеротоксигенности и вирулентности.
2. Определить спектр лекарственной устойчивости у монокультур и
сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus
aureus.
-
Дать сравнительную характеристику профиля плазмидной дезоксирибонуклеиновой кислоты монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus.
-
Провести сравнительное изучение влияния монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей.
-
Дать сравнительную оценку кислородзависимого метаболизма перитонеальных макрофагов мышей при воздействии монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus.
Методология и методы исследования
Клинический материал был получен из бактериологических лабораторий ГБУЗ Республиканская детская клиническая больница и ГБУЗ Республиканская клиническая больница им. Г.Г.Куватова г.Уфы.
Эксперименты выполнялись на белых мышах-самцах (беспородных и линии СВА) массой 18-20 г и на кроликах массой 2,5-3,0 кг. Животные содержались в условиях вивария ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России в естественном световом режиме на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96). Животные получены из питомника лабораторных животных уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ.
При обследовании 1190 больных было выделено 78 (6,5%) штаммов Enterobacter spp., в том числе 29 (37,2%) штаммов Enterobacter spp. от 445
больных с желудочно-кишечными инфекциями, 23 (29,5%) - от 349 с урологическими заболеваниями и 26 (33,3%) - от 396 с гнойно-воспалительными процессами.
От 987 больных с гнойным воспалением околоносовых пазух, с абсцессами мягких тканей, с трофическими язвами нижних конечностей, с гнойными заболеваниями легких и плевры было выделено 78 (7,9%) штаммов S.aureus.
В качестве проб клинического материала были исследованы раневое отделяемое, моча, кровь, испражнения, мазки из носа и зева, трупный материал, мазок из влагалища, смывы с медицинских инструментов, плевральная жидкость, мокрота.
Кроме того, 10 (2,7%) штаммов Enterobacter spp. и 10 (3,2%) штаммов S.aureus были выделены от 365 и 312 практически здоровых людей соответственно.
В качестве эталонных культур использовали штаммы Enterobacter gergoviae (ГИСК им. Тарасевича №259), Enterobacter cloacae (ГИСК им. Тарасевича №258), Salmonella tuphimurium №415 (несущий плазмиду массой 60 МД), Proteus vulgaris Rts-1 (несущий плазмиду 120 МД), Escherichia coli K12G62RifR (бесплазмидный).
Идентификацию выделенных культур проводили по стандартной схеме («Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования», Приказ МЗ СССР №535 (1985) с использованием тест-систем «Enterotest» (Ьаспета,Чехия) и API (BioMeruiox, Франция).
Изучение клеточной поверхности и морфологических особенностей культур Enterobacter spp. и S.aureus проводили с помощью оптического («Биолам», Россия) и электронного («ШМ-100В», Япония) микроскопов. Адгезивную активность изучали в реакции гемагглютинации с эритроцитами птиц (Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дисс... д-рамед.наук/З.Г. Габидуллин. Саратов, 1989. 45с.) и 1(0) группы крови системы АВО (Брилис В.И. Методика определения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Лаб. дело. 1986. № 4. С. 210-212. Продукцию а- и тиолзависимого гемолизина определяли по рекомендациям З.Г. Габидуллина (Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дисс... д-ра мед.наук / З.Г. Габидуллин. Саратов, 1989. 45с.) и Albesa J. et al. (Albesa J. A tiol-activated hemolysin in gram-negative bacteria I J. Albesa, L.J. Barberis, M.C. Pajaro II Can. J. Microbiol. 1985. Vol.3 l.P.297-300. Определение лецитиназной активности проводили на желточном агаре Чистовича Ю.Н. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования: руководство для врачей / под ред. М.О. Берге. Москва: 1982. 462 с), антилизоцимную активность (АЛА) определяли по методу Бухарина О.В. и др. (Бухарин О.В. Метод определения антилизоцимной активности
микроорганизмов I О.В. Бухарин, А.П. Усвяцов, Н.В. Малышкин, Н.В. Намуева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1984. № 2. С. 27-28), антиинтерфероновую активность (АИА) - по методу Соколова Ю.В. (Персистенция микроорганизмов / под ред. О.В. Бухарина. Куйбышев, 1990. С. 83-93.), антикомплементарную активность (АКА) - по методу Бухарина О.В. (Бухарин О.В. Изучение антикомплементарной активности стафилококков / О.В. Бухарин, Ю.А. Брудастов, Д.Т. Дерябин // Клин. лаб. диагн. 1992. № 11. С. 68-70.), ДНК-азную активность - по Jeffries CD. et al. (Jeffries CD. Rapid method for determining the activity of microorganisms on nuclear acids I CD. Jeffries, D.F. Holtman, D.G. Gus II J. Bacteriol. 957. Vol. 73, N 4. P. 590-591). Устойчивость бактерий к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с помощью бумажных дисков, пропитанных противомикробными препаратами, согласно Инструкции МЗ СССР от 1986 года, утвержденной Управлением по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники (Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / под редакцией проф. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987, с.341- 343.). Вирулентность оценивалась по способности вызывать гибель при «интраназальном заражении» белых мышей (Войно-Ясенецкая М.К. Опыт изучения дизентерийной инфекции у лабораторных животных / М.К. Войно-Ясенецкая // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1957. № 4. С. 65-69), токсигенность - в тесте «отек лапки» (Вартанян Ю.П. и соавт. Отек лап белых мышей - тест для оценки активности энтеротоксинов / Ю.П. Вартанян и соавт. // Бюлл. эксп. биол. и медицины. 1978. № 2. С. 150-152) и модели «лигированная петля тонкого кишечника кролика» (Gianella R. А. Suckling mouse model for detection of heat-stable Escherichia coli enterotoxin: characteristics of the model I R. A. Gianella II Infect. Immun. 1976. Vol. 14. P. 95-99.). Выделение плазмидной ДНК бактерий проводили по методу Kado СТ., Liu S.T. (Kado СТ., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids I C.T. Kado, S.T. Liu II J. Bacteriol. 1981. Vol. 145. P. 1365-1373.).
В качестве объекта для экспериментальных исследований на животных были выбраны штамм Е.cloacae ГНИИСК №258 (патент РФ №2164946) и клинический штамм S.aureus, обладающий факторами патогенности.
Экспериментальные исследования проводились на 80 мышах-самцах линии СВА массой 16-18г - 20 животных в контрольной и по 20 животных в экспериментальных группах:
- I экспериментальная группа: моделирование экспериментальной
моноинфекции осуществляли внутрибрюшинным введением центрифугата
суточной бульонной культуры Е. cloacae в дозе LD5o, содержащей ЛТ-
энтеротоксин, - 5-10 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин);
- II экспериментальная группа: моделирование экспериментальной
моноинфекции осуществляли внутрибрюшинным введением центрифугата
суточной бульонной культуры S.aureus в дозе LD5o - 5-10 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин);
- Ill экспериментальная группа: моделирование экспериментальной
микстинфекции осуществляли внутрибрюшинным введением центрифугата
суточной бульонной культуры Е.cloacae и S.aureus в дозе LD5o- 5-10 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин);
- контрольная группа: внутрибрюшинное введение 0,9% раствора
NaCl. Оценку всех тестируемых параметров проводили на 1, 3, 5 и 15 сутки.
В качестве объекта исследования in vitro были использованы перитонеальные макрофаги белых мышей линии СВА, которые получали промыванием брюшной полости охлажденной средой 199 с гепарином в концентрации 10 ед/мл. Клетки после отмывания доводили до концентрации 106 кл/мл средой 199, содержащей 200 мг/л L-глютамина. Полученные суспензии клеток фильтровали через слой капроновой сетки, отмывали средой 199 посредством центрифугирования в течение 10 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспензировали в охлажденной среде 199 и определяли число клеток в камере Горяева. С помощью 0,1% раствора трипанового синего подсчитывали количество живых клеток. Полученные клеточные взвеси разводили средой 199 и использовали для постановки реакций. Все манипуляции проводили при температуре тающего льда.
Для изучения функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей проводили: 1) оценку способности ПМф поглощать частицы полистирольного латекса (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие / И.С. Фрейдлин. Ленинград, 1986. 261 с); 2) изучение НСТ-редуцирующей активности ПМф по спонтанному и индуцированному тестам (Маянский А.Н. и соавт. Характеристика функциональной активности нейтрофилов крови человека с помощью реакции восстановления нитросинего тетразолия / А.Н. Маянский и соавт. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1977. № 6. С. 108-110); 3) изучение уровня суммарного свечения лизосом в цитоплазме перитонеальных макрофагов мышей (Зеленин А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой/А.В. Зеленин. Москва: Наука, 1971. 231 с).
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования, при консультативном участии специалистов в области математического анализа, с использованием программ: BIOSTATISTICA, STATISTICA v.7.0, Microsoft Excel 2000.
Для анализа соответствия распределения количественных переменных закону нормального распределения нами применен критерий Шапиро-Уилка (W). При значениях р<0,05 мы отвергали нулевую гипотезу и принимали альтернативную об отличии от нормального распределения исследуемой переменной. Для описания нормально распределенных количественных
переменных использовали показатели: среднее значение признака (М), стандартное отклонение (5), стандартную ошибку среднего (т). Для сравнения категориальных переменных проводился анализ таблиц сопряженности с использованием критерия %2, для множественных сравнений использовался параметрический одно факторный дисперсионный анализ с последующим сравнением в группах по критерию Ньюмена-Кейлса.
Статистически достоверными считалось различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95% (р<0,05) (Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных: применение пакета прикладных программ Statistica / О.Ю. Реброва. Москва: Медицина, 2002.312 с).
Результаты работы были представлены на Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ «Вопросы теоретической и практической медицины» (г.Уфа, 2010, 2011); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (г.Москва, 2012); обсуждены на совместном заседании кафедр общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин, эпидемиологии, биологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов с участием ведущих научных сотрудников уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ.
Автор лично участвовал в проведении экспериментов, статистической обработке, интерпретации полученных данных и подготовке диссертационной работы в журнальных статьях и тезисах конференций.
Положения, выносимые на защиту
-
У сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus более выражена способность к адгезии, продукции гемолизинов, лецитиназы, дезоксирибонуклеазы, термо лабильного энтеротоксина, персистентные свойства и вирулентность, чем у монокультур.
-
При совместном культивировании бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus происходит увеличение количества клонов, несущих плазмиду массой 60 МД, детерминирующих продукцию термолабильного энтеротоксина по сравнению с их монокультурами.
3. Сокультивируемые вариации бактерий рода Enterobacter и
Staphylococcus aureus чаще подавляют фагоцитоз, образование активных
форм кислорода и лизосомальную активность макрофагов, чем их
монокультуры.
Научная новизна
С помощью электронного микроскопа («JEM-100В», Япония) впервые обнаружены контакты между клетками сокультивируемых бактерий Enterobacter spp. и S.aureus.
Впервые приведена характеристика данных об адгезивной,
гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной,
антиинтерфероновой, антикомплементарной активностях и ЛТ-энтеротоксигенности и вирулентности у сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter spp. и S.aureus.
Показано расширение спектра антибиотикоустойчивости у сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus по сравнению с их монокультурами.
Впервые была проведена оценка функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей при экспериментальных моно- и микстинфекциях, вызванных бактериями E.cloacae и S.aureus.
При воздействии на перитонеальные макрофаги E.cloacae и S.aureus по сравнению с их монокультурами установлено преимущественное подавление фагоцитоза, продукции кислородных радикалов макрофагами и их лизосомальной активности.
Теоретическая и практическая значимость работы
Данные о повышении у сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S. aureus адгезивной, гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активностей, ЛТ-энтеротоксигенности и вирулентности расширяют представление о роли ассоциаций этих бактерий в этиологии инфекционных заболеваний человека.
Результаты о распространенности и выраженности факторов патогенности, персистенции, вирулентности и энтеротоксигенности у сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus могут быть использованы при прогнозировании течения инфекционно-воспалительных заболеваний.
Данные об изменениях в иммунной системе могут быть использованы при расшифровке механизмов развития и конкретной оценке иммунологических нарушений, вызываемых ассоциацией бактерий Enterobacter spp. и S.aureus. Результаты работы расширяют экспериментальную базу для изучения патологических процессов при микстинфекциях.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования используются в бактериологических лабораториях ГБУЗ Республиканская детская клиническая больница и ГБУЗ Республиканская клиническая больница имени Г.Г.Куватова г.Уфы.
Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии; детских инфекционных болезней и общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Публикации
Соискатель имеет 5 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 5 научных работ общим объёмом 1,97 печатных листов, в том
числе 5 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах, иллюстрирована 21 таблицей и 19 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 59 отечественный и 151 иностранный источник.
