Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Иммунодоминантные антигены грамнегативных бактерий и биологическая целесообразность их фазовых вариаций ... 10
1.1. Поверхностные структуры и иммунодоминантные антигены грамнегативных бактерий 10
1.2. Иммунодоминантные антигены бактерий рода Francisella 25
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Штаммы 39
2.2. Питательные среды и реактивы 39
2.3. Методы выделения препаратов ЛПС и получение бактериальных лизатов 40
2.4. Получение иммунных сывороток и методы их характеристики (РПГА, РТПГА и истощение антигенными препаратами) 40
2.5. ПААГ электрофорез и иммуноблоттинг препаратов ЛПС и лизатов бактерий .\ 42
2.6. Реакция лейкоцитолиза 42
^ 2.7. Изучение фазовых вариаций in vivo 42
2.8 Использование дот-иммуноанализа (дот-блот) для выявления специфических антител против бактерий рода Francisella 43
ГЛАВА 3. Изучение иммунодоминантных антигенов бактерий рода Francisella 45
3.1. Получение коллекции иммунных сывороток против бактерий рода Francisella 45
3.2. Сравнительный анализ антигенов, представляемых живыми и убитыми бактериями вида F.tularensis в организме кролика 48
3.3. Иммунодоминантные антигены F.philomiragia 54
ГЛАВА 4. Изучение возможности антигенных вариаций лис f. tularensis в организме лабораторных животных 58
4.1. Изучение возможности антигенных вариаций ЛПС F.tularensis на модели коллекции капсулодефицитных ЛПС-дефектных мутантов 58
4.2. Изучение возможности антигенных фазовых вариаций ЛПС
F.tularensis в организме кролика, иммунизированного вакцинным и вирулентным штаммами туляремийного микроба 61
ГЛАВА 5. Изучение возможности антигенных фазовых вариаций лпс f. tularensis при инфекционном и вакцинальном процессах у человека 68
5.1, Изучение возможности антигенных фазовых вариаций ЛПС F.tularensis у больных туляремией людей 68
5.2. Изучение возможности антигенных фазовых вариаций ЛПС F.tularensis у людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной 73
ГЛАВА 6. Применение дот-иммуноанализа для выявления специфических антител против франциселл с использованием в качестве антигенных Препаратов лпс 76
Заключение 80
Выводы 91
Список использованной литературы
- Поверхностные структуры и иммунодоминантные антигены грамнегативных бактерий
- Методы выделения препаратов ЛПС и получение бактериальных лизатов
- Получение коллекции иммунных сывороток против бактерий рода Francisella
- Изучение возможности антигенных вариаций ЛПС F.tularensis на модели коллекции капсулодефицитных ЛПС-дефектных мутантов
Введение к работе
Антигены патогенных бактерий вызывают особый интерес исследователей в связи с их важной ролью в патогенезе и иммуногенезе инфекционного процесса. Изучение иммунодоминантных антигенов микробов, индуцирующих в организме хозяина наиболее выраженный специфический антительный ответ, имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как диагностика многих инфекционных заболеваний базируется на выявлении этих антигенов или антител к ним.
Возбудитель туляремии - Francisella tularensis - имеет длительную
историю исследований, в процессе которых его основные специфические
антигены идентифицированы, а их: химическая структура расшифрована
(36, 73, 171, 175, 184). Вместе с тем, как отмечено в последнем аналитическом обзоре литературы по проблеме «туляремия» (98), наши представления о факторах патогенности и иммуногенности туляремийного микроба и механизмах их реализации в условиях in vivo весьма ограничены. Еще в большей степени это относится к новым франциселлам - F.tularensis subsp. novicida(-like) и F.philomiragia, основные антигенные детерминанты которых изучены крайне недостаточно. Например, показано, что антигенная структура франциселл представлена специфическими эпитопами липополисахарида (ЛПС) (27), а также антигенами белковой природы различной специфичности (48). При этом остается невыясненным, является ли ЛПС иммунодоминантным антигеном этих бактерий и какова его диагностическая ценность для методов их детекции, которые на сегодняшний день практически отсутствуют. В то же время возможная этиологическая роль франциселл в инфекционной патологии человека (32, 119, 188) требует углубленного изучения их биологических особенностей.
В отличие от малоизученных новых франциселл, антигенная структура туляремийного микроба известна. Так, установлено, что ЛПС F.tularensis, представляемый в условиях in vivo живыми бактериями, является
5 иммунодоминантным антигеном, вызывая выраженный специфический антительный ответ макроорганизма (98, 187). В противоположность этому, препараты ЛПС, выделенные из клеток, биологически инертны и вызывают слабый гуморальный ответ хозяина (103, 123, 157). Последнее свидетельствует в пользу того, что данные, полученные при изучении свойств антигенов in vitro, не всегда соответствуют тем процессам, которые имеют место in vivo. В этой связи остается открытым вопрос о том, с помощью каких механизмов инертный ЛПС туляремийного микроба реализует свой потенциал в организме хозяина. Одним из таких механизмов может быть способность этого бактериального биополимера к обратимым модификациям (фазовым вариациям). Согласно современным представлениям, термин «фазовые вариации» обозначает обратимые изменения (модификацию) поверхностных структур бактерий, которые наиболее часто сопровождаются изменением антигенной специфичности микроорганизма (антигенные фазовые вариации) (44, І28, 152, 170).
В настоящее время, очевидно, что динамика и исход инфекционного процесса во многом зависят от способности патогена к адаптации в ответ на изменения условий обитания, в частности, при попадании из внешней среды или от переносчика в организм чувствительного хозяина (7, 128, 170). Более того, существенное значение для взаимоотношений паразит-хозяин имеют также видовые особенности макроорганизма, которые, в свою очередь, могут определять стратегию возбудителя.
Туляремийный микроб в этом отношении является наиболее сложной моделью для изучения, так как имеет очень широкий круг хозяев, отличающихся по своей чувствительности к инфекции (36). В то же время возможность фазовых вариаций поверхностных структур F.tularensis и влияние на этот процесс видовой принадлежности хозяина не исследованы. Имеется лишь одно сообщение, демонстрирующее в модельных экспериментах на макрофагах крыс изменение антигенных эпитопов ЛПС мутантного вакцинного
штамма F.tularensis (92). Однако, насколько этот феномен характерен для других хозяев, и, в частности, человека, и имеет ли он вообще место при туляремийной инфекции или вакцинальном процессе остается неизвестным.
Таким образом, анализ данных литературы позволил выявить круг вопросов, нуждающихся в проведении специальных исследований, и сформулировать цель настоящей работы.
Цель исследования:
Исследование специфических иммунодоминантных антигенов липополисахаридной природы у бактерий рода Francisella и изучение возможности их фазовых вариаций в условиях in vivo.
Задачи исследования.
Получение коллекции иммунных сывороток людей и кроликов против различных представителей рода Francisella - F.tularensis (включая штаммы F.tularensis subsp. novicida и F.tularensis subsp. novicida-like) и F.philomiragia.
Выявление и изучение специфичности иммунодоминантных антигенов франциселл, определяющих антительный ответ кроликов на введение им живых и убитых бактерий.
Изучение возможности фазовых вариаций ЛПС F.tularensis при инфекционном и вакцинальном процессах у лабораторных животных.
Изучение феномена фазовых вариаций ЛПС F.tularensis при туляремийной инфекции и иммунизации человека живой туляремийной вакциной.
Использование препаратов ЛПС бактерий рода Francisella в дот-иммуноанализе для детекции специфических антител в сыворотках различных хозяев.
Научная новизна и теоретическая ценность работы.
В результате проведенных исследований получены новые данные об иммунодоминантных антигенах франциселл. Для всех изученных представителей рода Francisella - F.tularensis, включая F.tularensis subsp.
7 novicida(-like), и F.philomiragia - специфичными иммунодоминантными антигенами являются ЛПС, тогда как большинство антигенов белковой природы имеют перекрестные общеродовые детерминанты. Обнаружено, что только живые бактерии индуцируют в организме хозяина - человека или кролика - выраженный антительный ответ против специфических эпитопов ЛПС. В противоположность этому, при иммунизации кроликов убитыми бактериями, ЛПС вызывает более слабый иммунный ответ. Впервые выявлено, что специфические иммунодоминантяые антигены нового представителя рода Francisella - F.philomiragia - представлены двумя иммунологически различными формами липоолигосахарида (ЛОС) и низкомолекулярным антигеном с белковым компонентом.
Впервые установлено, что в сыворотках больных туляремией людей
содержатся два самостоятельных типа антител с различной специфичностью -
против антигенных эпитопов ЛПС F.tularensis и против эпитопов ЛПС F.
novicida. Доказано, что данные антитела не являются
перекрестнореагирующими, а появление в процессе туляремийной инфекции
человека «противоновицидных» иммуноглобулинов обусловлено
модификацией эпитопов ЛПС возбудителя туляремии (антигенные фазовые вариации). В то же время при иммунизации человека живой туляремийной вакциной феномен антигенных вариаций ЛПС F.tularensis, как правило, не регистрируется. Однако, в исключительных случаях, при наличии у человека выраженных поствакцинальных реакций, ЛПС вакцинного штамма F.tularensis может подвергаться модификации.
Практическая ценность работы.
Получена коллекция иммунных сывороток человека и кролика против различных представителей рода Francisella, которая может быть в дальнейшем использована при изучении антигенной структуры разных видов франциселл. Предложено использование в качестве антигенных образцов очищенных
препаратов ЛПС различных франциселл в дот-иммуноанализе, что позволяет повысить специфичность метода по сравнению с применением бактериальных препаратов. Рассмотрены Ученым Советом РостНИПЧИ и утверждены директором института методические рекомендации по использованию препаратов ЛПС F.tularensis для выявления специфических противотуляремийных антител методом дот-блота (протокол № 11 от 30.11.2000г.). Полученные в процессе выполнения исследования данные используются при чтении лекций на курсах специализации врачей-бактериологов в РостНИПЧИ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Для представителей вида F.tularensis, включая F.tularensis subsp. novicida(-iike), ЛПС является иммунодоминантным антигеном, на О-полисахариде которого локализованы высокоспецифичные эпитопы. Большинство иммунореактивных белков франциселл характеризуются наличием перекрестнореагирующих общеродовых антигенных детерминант.
Иммунодоминантные специфические антигены F.philomiragia значительно отличаются от F.tularensis и представлены двумя иммунохимически различными липоол иго сахаридами и низкомолекулярным протеинсодержащим антигеном.
При туляремийной инфекции у человека, обусловленной природными вирулентными штаммами, происходит модификация ЛПС возбудителя туляремии с формированием антигенных детерминант, присущих ЛПС F.tularensis subsp. novicida. В то же время при иммунизации человека и кролика живой туляремийной вакциной феномен антигенных вариаций ЛПС F.tularensis, как правило, не регистрируется.
Применение ЛПС в качестве антигенного образца по сравнению с бактериальными препаратами позволяет повысить специфичность метода дот-иммуноанализа и использовать его при детекции специфических антител против франциселл в сыворотках человека и животных.
9 Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на научных конференциях РостНИПЧИ и конкурсах молодых ученых РостНИГТЧИ (1998, 1999, 2000, 2001, 2003), а также были представлены на III й IV международных конференциях по туляремии (Швеция, 2000; Великобритания, 2003), на научных конференциях «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.» (Киров, 1998), «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.» (Екатеринбург, 1999), на VIII съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения.» (Омск, 2003), а также на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - 21 век» (Саратов, 2004).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 4 работы в центральной печати и 4 - в зарубежных изданиях.
Ученым советом РостНИПЧИ утверждены методические рекомендации по использованию препаратов ЛПС FranciseMa tularensis для выявления специфических противотуляремийных антител методом дот-блота (Протокол №11 от 30.11.2000).
Структура диссертации.
Работа изложена на 112 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 193 источника, в том числе 79 отечественных. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 5 таблицами.
Поверхностные структуры и иммунодоминантные антигены грамнегативных бактерий
Бактериальные антигены, вызывающие развитие в макроорганизме специфических иммунных реакций, представляют собой различные по химической природе вещества (30, 45). Как установлено, антигенными свойствами могут обладать многие компоненты бактериальной клетки -жгутики, капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, составляющие цитоплазмы, а также токсины и ферменты, секретируемые микробом во внешнюю среду (21). Известно, что на первом этапе инфекционного процесса ключевым моментом активации защитных сил хозяина является контакт иммунокомпетентных клеток макроорганизма с поверхностными структурами возбудителя, поэтому именно они содержат, как правило, наибольшее количество высокоспецифических антигенных детерминант. Поскольку химическое строение антигенов у грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов существенно различается, мы позволим себе более подробно остановиться на природе и специфичности антигенов грамнегативных бактерий, к которым относится объект нашего исследования -бактерии рода Francisella.
Поверхностные структуры микроорганизмов представлены внешней мембраной клеточной стенки и дополнительными образованиями, окружающими микробную клетку, которые обозначаются разными авторами как капсула, слизистый слой, оболочка или капсулоподобное вещество. Столь разнообразная терминология обусловлена тем, что до настоящего времени нет четкого определения понятия этих внеклеточных структур. По мнению некоторых исследователей, капсулу или слизистый слой формируют органические полимеры, локализующиеся с наружной стороны клеточной стенки в виде рыхлого, более или менее аморфного слоя (55). Капсула имеет ограниченную толщину и четко выявляется при микроскопии с негативным окрашиванием, однако часто эти экзополимеры образуют значительно более обширные скопления (55). Для некоторых бактерий синтез капсульного вещества не является постоянным свойством. Так, у отдельных видов бруцелл капсулоподобный слой образуется только при определенных условиях выращивания (143). Зависимость образования капсулы от условий обитания демонстрирует и возбудитель чумы - Yersinia pestis, который продуцирует максимальное количество капсульного вещества только при температуре тела теплокровных животных (26). у ілЛ/л \р\ "- Q"- АА1- --- ід ;:-..А:,:, t, \
Химический состав капсулоподобных структур бактерий весьма разнообразен и, в зависимости от видовой принадлежности, может включать полипептиды, различные полисахариды и свободно-секретируемые молекулы липополисахарида (ЛПС). В частности, установлено, что капсульное вещество Y.pestis представлено, главным образом, полипептидами 17 кДа белка, обозначаемого как фракция I (Fr I) (26). Для микробов Neisseria meningitidis серогруппы В характерна полисахаридная капсула из гомополимера а-2,8 связанной N ацетил нейраминовой кислоты (149). Слизистое вещество Pseudomonas aeruginosa содержит сложный полисахарид, являющийся полимером альгиновых кислот (16). У некоторых бактерий в состав капсульного вещества могут входить свободно-секретируемые молекулы липополисахарида (18,.109).
В отличие от капсульной субстанции, такая структура, как клеточная стенка, является обязательной для преобладающего большинства бактерий. Ее строение достаточно хорошо изучено и имеет общие черты для грамнегативных бактерий. Она включает в себя два слоя: пептидогликан и наружную мембрану, которые соединены липопротеинами. Пептидогликановый слой, или муреин, грамотрицательных бактерий характеризуется низким содержанием аминокислот и отсутствием тейхоевой кислоты, а основная функция этого слоя заключается в обеспечении ригидности бактериальной клетки. Функции наружной мембраны грамнегативных бактерий более многочисленны: поддержание постоянства внутренней среды бактерий, защита от внешних воздействий, рецепция, транспорт питательных веществ и выделение метаболитов (21, 30). Кроме того, она может принимать участие в реализации иммуногенных и токсических свойств бактерий. Во многом последнее определяется присутствием в составе наружной мембраны липополисахарида -уникального класса биополимеров, свойственного только грамнегативным бактериям.
В зависимости от строения выделяют несколько типов ЛПС. Полная молекула ЛПС (S-хемотип) содержит гидрофобную часть (липид А), к которой через олигосахарид (кор) присоединяется О-полисахаридная цепь (22). Подобный тип ЛПС синтезируют многие бактерии, образующие колонии гладкой (S) формы - Escherichia spp, Salmonella spp, Pseudomonas spp, Brucella abortus, Brucella melitensis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis и другие (87, 111, 154). Напротив, микроорганизмы, формирующие, как правило, колонии шероховатой (R) формы, продуцируют липоолигосахариды (ЛОС), для которых типичным является либо полное отсутствие полисахаридной цепи (R-хемотип), либо ее присутствие в очень незначительных количествах (SR-хемотшт) (118). Такие известные патогены, как Y.pestis, Brucella ovis и Brucella canis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis., Haemophilus influenzae и другие -синтезируют липоолигосахариды. (87, 111, 118).
Методы выделения препаратов ЛПС и получение бактериальных лизатов
Для решения поставленных задач были использованы экспериментально полученные иммунные сыворотки кроликов против живых и убитых 0,5% формалином бактерий F.tularensis 503 subsp. holarctica, F.tularensis 15 НИИЭГ subsp. holarctica, F.novicida Utah 112, F. novicida-like D 9876, F. philomiragia F 9693. Схемы иммунизации животных представлены в главе 3.
Коллекция противотуляремийных сывороток человека включала 5 сывороток от больных туляремией людей (14-28 день заболевания) и 16 - от людей, вакцинированных живой туляремийной вакциной (21 день).
Характеристика этих сывороток подробно описана в главе 5. В качестве контрольных использовали нормальные (неиммунные) сыворотки человека и кролика.
В работе были использованы также гетерологичные сыворотки - сыворотка человека, больного хроническим бруцеллезом и экспериментально полученные кроличьи иммунные сыворотки против В. abortus, V. cholerae 0139 и J. enterocolitica (39 сероваров), любезно предоставленные нам к.м.н. Б.Л. Мазрухо (лаборатория микробиологии холеры РостНИПЧИ) и к.м.н. Л.М.Смоликовой (МЖК РостНИПЧИ). Все сыворотки перед использованием были инактивировы при 56С 30 минут и адсорбированы контрольными эритроцитами барана.
Реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакцию торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), реакцию нейтрализации антител (РНАт) проводили микрометодом согласно Приказу №125 МЗ РФ (1999) (46). В связи с тем, что в настоящее время отсутствуют коммерческие антигенные диагыостикумы для детекции бактерий рода Francisella, для проведения серологических реакций при исследовании сывороток против франциселл были использованы экспериментальные антигенные эритроцитарные диагиостикумы на основе ЛПС F.tularensis 503, F.novicida Utah 112, F.novicida-like D9876 и F.philomiragia F9693, полученные и предоставленные нам к.б.н. Н.Н Оноприенко (38). Кроме того, при изучении противотуляремийных сывороток человека и кролика использовали коммерческий туляремийный антигенный эритроцитарный диагностикум, произведенный ЗАО «Финист», НИИЭМ им. Гамалеи, г. Москва.
Истощение иммунных сывороток проводили препаратами ЛПС, выделенными из бактерий исходных штаммов F.tularensis 503 subsp. holarctica, F. novicida Utah 112 и авирулентного капсулодефицитного мутанта F.tularensis 543 cap" subsp. mediaasiatica с R-хемотипом ЛПС. Для этого к 1мл сыворотки добавляли 10 мг препарата и инкубировали 1 час при температуре 37С. Затем пробы центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин для осаждения комплексов антиген-антитело и проводили определение титра антител с антигенными диагностикумами на основе ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida.
Разделение антигенных препаратов ЛПС (50 мкг/лунка) и бактериальных лизатов (5 10 м.кл./лунка) осуществляли в ДСН-электорофорезе в 15% ПААГ (10 мА, 2 часа) (126) с последующим электропереносом на нитроцеллюлозу (Serva) (1,5 часа 55 мА) (177). Для обработки иммуноблотов использовали экспериментальные иммунные сыворотки кроликов против различных видов франциселл и противотуляремийные сыворотки человека (см. п. 2.4.). Антиген-активные зоны выявляли коныогатом белка А с пероксидазой хрена (Sigma). Субстрат - 3,3-диаминобензидина 4-гидрохлоридом (ДАБ) (Serva).
Для оценки противотуляремийного клеточного иммунитета у вакцинированных людей применяли реакцию лейкоцитолиза, регламентированную Приказом № 125 (1999) (46). В качестве антигена использовали суспензию бактерий F.tularensis 15 НИИЭГ (10ІОм.кл./мл), убитых нагреванием при 70С в течение 1 часа.
С целью исследования фазовых вариаций ЛПС F.tularensis in vivo животных разных групп чувствительности (беспородные белые мыши, морские свинки, крысы) заражали внутрибрюшинно авирулентными ЛПС-дефектным и мутантами F.tularensis (106 м.кл ./животное). На 3-7 сутки выживших животных хлороформировали и для получения роста культуры производили посевы из печени и селезенки на плотную питательную среду Т.
Получение коллекции иммунных сывороток против бактерий рода Francisella
Как отмечалось нами ранее, характерной особенностью иммунодоминантных антигенов бактерий является их способность вызывать наиболее выраженный специфический гуморальный ответ хозяина. В этой связи целью первого этапа исследования явилось получение и характеристика коллекции иммунных сывороток животных и человека против разных штаммов франциселл.
Схемы иммунизации кроликов были подобраны экспериментально и зависели от используемого штамма. Группу кроликов (4 шт.) подкожно иммунизировали живыми бактериями вакцинного штамма F.tularensis 15 НИИЭГ с интервалом в 1 день четырьмя циклами (5 109м.кл.); вирулентный штамм F.tularensis 503 вводили животным подкожно однократно (5 106м.кл.). Для стандартизации популяции штаммов по признаку вирулентности и иммуногенности культуры предварительно были проинкубированы в нормальной сыворотке человека (24ч. 37С) (40). Получение сывороток против других франциселл, для которых оптимальные схемы иммунизации в настоящее время не разработаны, проводили по схеме, используемой нами для вакцинного штамма F.tularensis.
Сыворотки против убитых 0,5% формалином франциселл были получены от животных, иммунизированных внутривенно бактериями в течение 6 дней ежедневно (5 109м.кл.). Забор крови для получения сывороток проводили на 21 день после последнего цикла иммунизации. Для нивелирования индивидуальных особенностей животных сыворотки против одного вида бактерий, полученные от 4 кроликов, объединяли (объединенные сыворотки).
Определение титров специфических антител в иммунных сыворотках в / системе реакций РПГА (РТПГА) выполняли с помощью коммерческого (.(..-: /. ,, 46 - :"! туляремийного эритроцитарного антигенного диагностикума, а также экспериментальных антигенных эритроцитарных диагностикумов, разработанных на основе очищенных препаратов ЛПС франциселл и любезно предоставленных нам Н.Н. Оноприенко (38). -U -J - И
Результаты изучения иммунных сывороток представлены в таблице 1. Специфичность реакции во всех случаях подтверждена РТПГА.
Таблица 1. Титры специфичесішх анти-ЛПС-антител в объединенных сыворотках кроликов, иммунизированных живыми и убитыми бактериями рода Franci sella.
Иммунные сыворотки кроликов против штаммов Препарат дляиммунизации Диагностикумы на основе препаратов ЛПС Титры антител в РИГА F.tularensis 503 Живые бактерии F.tularensis 1:5000 Убитые бактерии 1:320 F.tularensis 15 Живые бактерии F.tularensis 1:2500 Убитые бактерии 1:80 F.novicida Utah 112 Живые бактерии F.novicida 1:2500 Убитые бактерии 1:160 F.novicida-like Живые бактерии F.novicida-Hke 1:5000 Убитые бактерии 1:320 F.philomiragia Живые бактерии F.philomiragia 1:640 Убитые бактерии 1:320
Примечание: - при исследовании противотуляремииных сывороток кроликов представлены данные определения титров реакции с помощью двух эритроцитарных диагностикумов - коммерческого и экспериментального.
Исследование сывороток против F.tularensis с помощью двух антигенных диагностикумов - коммерческого и экспериментального — показало полное совпадение результатов, что свидетельствует в пользу формирования у хозяина специфического гуморального ответа за счет индукции анти-ЛПС- антител. Установлено, что титры антител против специфических антигенных эпитопов ЛПС в сыворотках кроликов, иммунизированных живыми бактериями, были достоверно выше (в 8 и более раз), чем подобные показатели в сыворотках против убитых микроорганизмов. Исключением явились сыворотки против F.philomiragia, которые характеризовались относительно невысокими титрами антител против ЛПС, а разница между ними в сыворотках к убитым и живым бактериям была минимальной. Данный феномен может быть обусловлен как своеобразным строением ЛПС F.philomiragia, так и возможными особенностями антительного ответа хозяина на этот микроорганизм.
Учитывая, что только иммунизация живыми бактериями F.tularensis обеспечивает их эффективную защиту животных против возбудителя (25), выявленная нами четкая разница в титрах анти-ЛПС-иммуноглобулинов в сыворотках против живых и убитых бактерий может свидетельствовать в пользу участия ЛПС туляремийного микроба в индукции протективного иммунитета.
Несомненный интерес, на наш взгляд, представляло исследование противотуляремийных сывороток людей как наиболее значимых с медицинской точки зрения. В этой связи нами были изучены 5 сывороток от больных туляремией людей (14-28 сутки заболевания), а также 16 сывороток от людей, первичновакцинированных (5 сывороток) или ревакцинированных (11 сывороток) живой туляремийной вакциной в различные сроки.
Исследование противотуляремийных сывороток от больных людей в РПГА (РТПГА) показало, что они содержат в высоких титрах специфические иммуноглобулины к ЛПС F.tularensis (1:2560 - 1:10240). В противоположность этому, все сыворотки от ревакцинированных людей характеризовались низкими титрами антител к ЛПС туляремийного микроба (1:20 — 1:160). Сыворотки от первично вакцинированных людей имели более высокие титры реакции (1:320 -1:1280) Для выяснения наличия протективного противотуляремийного иммунитета у ревакцинированных людей, имеющих столь низкие титры специфических антител, нами были поставлены дополнительные эксперименты по оценке напряженности клеточного иммунитета с помощью реакции лейкоцитолиза. Неожиданным оказался тот факт, что только первично вакцинированные люди имели четкую клеточную реакцию на антигены возбудителя туляремии (индекс лейкоцитолиза - 30-60%), тогда как у ревакцинированных мы получили отрицательные результаты (индекс лейкоцитолиза - менее 15%). Последнее в совокупности с низкими титрами специфических антител у ревакцинированных людей диктует целесообразность проведения специальных исследований по влиянию ревакцинации на напряженность противотуляремийного иммунитета у человека.
Таким образом, получена и охарактеризована коллекция сывороток против бактерий рода Francisella, необходимая для дальнейшей работы. Анализ сывороток показал, что у разных хозяев - больных туляремией людей и кроликов, инфицированных живыми бактериями, именно антигенные эпитопы ЛПС вызывают выраженный специфический антительный ответ. В то же время использование в РПГА диагностикумов на основе препаратов ЛПС не позволяет определить весь спектр антигенов микробной клетки, индуцирующих in vivo образование иммуноглобулинов. Поэтому следующий этап работы включал выявление и сравнительное изучение других иммунодоминантных антигенов франциселл с помощью методов иммуноанализа.
Изучение возможности антигенных вариаций ЛПС F.tularensis на модели коллекции капсулодефицитных ЛПС-дефектных мутантов
С целью оценки диагностической ценности дот-блота при обнаружении противотуляремийных антител в сыворотках людей и кроликов в качестве антигенных препаратов были изучены: суспензия бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ, убитых формалином, и очищенные препараты ЛПС, выделенные из природных вирулентных штаммов F. tularensis трех основных подвидов. Использование дот-блота при изучении сывороток больных туляремией людей и кроликов, инфицированных F. tularensis, позволило выявить в них антитела, взаимодействующие как с бактериями возбудителя туляремии, так и с чистыми препаратами S-ЛПС (рис.13). При этом наиболее четкие положительные результаты были получены именно с препаратами ЛПС, тогда как микробные клетки в некоторых случаях давали слабое неспецифическое окрашивание пятен в контрольных образцах с иммуноглобулинами сывороток здоровых людей и кроликов. Наличие подобных неспецифических реакций затрудняет интерпретацию получаемых результатов. В то же время при использовании очищенных препаратов ЛПС неспецифического взаимодействия с нормальными сыворотками не выявлено.
Результаты дот-блоттинга убитых 0,5% формалином бактерий F.tularensis 15 НИИЭГ (1) и препарата ЛПС F.tularensis 503 (2), обработанных сыворотками больных туляремией людей (А,Б,В), нормальной сывороткой человека (контроль) (Г), сывороткой кролика, иммунизированного живыми бактериями F.tularensis 15 НИИЭГ (Д), и нормальной сывороткой кролика (кролика) (Е).
При выяснении оптимальных параметров по антигенной нагрузке установлено, что нанесение на нитроцеллюлозу препарата ЛПС в дозе 5-10мкг на пятно позволяет визуализировать комплекс антиген-антитело при исследовании противотуляремиЙных сывороток с титрами в РПГА не менее 1:160. Однако в этих случаях интенсивность окраски пятен была менее выраженной по сравнению с сыворотками людей, содержащих антитела в титрах 1:1280-1:10240.
Как известно, одной из важнейших характеристик диагностических методов является их специфичность. В этой связи наличие у туляремийного микроба общих антигенов с другими грамнегативными микроорганизмами (В.abortus, V.cholerae, Y.enterocolitica) (5), а также с близкородственными франциселлами (32, 49) может оказывать влияние на результаты серодиагностики и служить причиной так называемых перекрестных иммунологических реакций.
Изучение с помощью дот-блота взаимодействия бактерий и препаратов S-ЛПС возбудителя туляремии с гетерологичными сыворотками человека и кролика против бруцелл, иерсиний и холерных вибрионов показало отсутствие у них регистрируемых перекрестных реакций.
Результаты дот-блота препаратов ЛПС и убитых 0,5% формалином или кипячением микробов F.tularensis, F. novicida, F. novlcida-like и F. philorairagia, обработанных сыворотками кроликов против этих бактерий, представлены на рисунке 14 .
Как установлено, препараты ЛПС франциселл не вступали в реакцию с иммуноглобулинами сывороток против близкородственных микробов (F.tularensis, F.novicida, F.novicida-like и F.philomiragia), что подтверждает высокую антигенную специфичность предлагаемого диагностического препарата (ЛПС). В то же время препараты бактерий франциселл давали слабое взаимодействии с антителами гетерологичных сывороток, а также с контрольными иммуноглобулинами неиммунных сывороток человека и кролика.
