Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Роль условно-патогенных энтеробактерий в развитии ассоциированных инфекций 23
1.2 Факторы патогенности условно-патогенных энтеробактерий 30
І.З. Антибиотикоустойчивость условно-патогенных энтеробактерий
1.4. Взаимоотношения в системе "хозяин-патоген" и особенности иммунологического ответа 44
1.5. Апоптоз в системе реагирования "патоген-хозяин" 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Микробиологические методы исследования 54
2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 63
2.3. Иммунологические методы исследования 67
2.4. Статистическая обработка результатов 74
ГЛАВА 3. Характеристика морфологических и физиологических особенностей условно-патогенных энтеробактерий (собственные исследования) 75
3.1. Характеристика клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий 75
3.1.1. Морфологические и культуральные свойства и контакты между клетками Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp 76
3.2. Факторы патогенности монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+ Serratia spp., Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter
spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli
3.2.1. Адгезивная активность 99
3.2.2. Гемолитическая активность 104
3.2.3. ДНК-азная активность ПО
3.2.4. Лецитиназная активность 113
3.3. Характеристика персистентных свойств монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций 117
3.3.1. Антилизоцимная активность 118
3.3.2. Антиинтерфероновая активность 121
3.3.3. Антикомплементарная активность 125
3.4. Изучение вирулентности и токсигенности монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (E+C), Enterobacter spp.+Serratia spp.(E+S), Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+E.coli(Ent+E.coli), Citrobacter spp.+E.coli(C+E.coli), Serratia spp.+E.coli (S+E.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+E.coli(Prot+E. coli) 129
3.4.1. Легочная модель 129
3.4.2. Отек лапки 133
3.4.3. Петля тонкого кишечника кролика 138
3.4.4. Кожнонекротическая проба 151
3.4.5. Протистоцидная ативность 161
3.5. Устойчивость бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli к широко применяемым в практике антибиотикам 166
3.6. Профиль плазмидной ДНК монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli 174
3.7. «Островки патогенности» монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli 197
ГЛАВА 4. Взаимоотношения в системе взаимодействия "патоген - хозяин" (собственные исследования 203
4.1. Влияние монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивирумых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов
мышей 205
4.2. Влияние монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов мышей 208
4.3. Сравнительная оценка влияния монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов мышей 211
4.4. Сравнительное изучение влияния монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, на формирование экстрациллюлярных сетей периферической крови 215
4.5. Сравнительное изучение влияния монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, на феномен апоптоза клеток перитонеального экссудата в системе «патоген-хозяин» 217
Заключение 220
Выводы 228
Практические рекомендации 230
Список сокращений 231
Список литературы 2
- Антибиотикоустойчивость условно-патогенных энтеробактерий
- Иммунологические методы исследования
- Характеристика персистентных свойств монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций
- Сравнительное изучение влияния монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, на формирование экстрациллюлярных сетей периферической крови
Антибиотикоустойчивость условно-патогенных энтеробактерий
Патология различных органов и систем человека, вызванная условно-патогенными энтеробактериями является общемедицинской проблемой, поскольку эти микроорганизмы влияют на различные функции организма человека. В процессе филогенетического развития живых организмов, в природе сформировалась микроэкологическая система, характеризующаяся наличием сложного динамического равновесия между гомеостазом макроорганизма и микробными ассоциациями, заселяющими его внешние поверхности и органы, сообщающиеся с внешней средой [266]. Микроорганизмы, формирующие микрофлору хозяина, находятся между собой в разнообразных взаимоотношениях (конкуренции, мутуализма, синергизма, комменсализма, паразитизма и др.). Недостаток или избыток того или иного из этих микроорганизмов, а также изменения окружающей среды служат сигналом для адаптивных, и возможно необратимых изменений, в соответствующем звене микроэкологической системы. Неся в себе элементы саморегуляции, эта система способна противостоять, по крайней мере в известных пределах, изменениям условий среды и колебаниям плотности и состава микробных популяций [53].
В настоящее время нормальную микрофлору рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых всех открытых внешней среде полостей макроорганизма и находящиеся в симбиотических отношениях с организмом хозяина. Нормальная микрофлора включает в себя десятки и сотни разнообразных видов, а их общий численный состав у взрослого человека достигает 1015, что почти на порядок больше числа клеток всех тканей и органов макроорганизма. Базис нормальной микрофлоры человека составляют облигатно и факультативно анаэробные бактерии. Даже на коже в ее глубоких слоях число анаэробов в 3-10 раз превышает число аэробных бактерий. В полости рта, в толстой кишке это соотношение может увеличиваться до 1000:1 и более. Помимо хорошо известных анаэробных бактерий (бифидобактерии, бактероиды, лактобациллы, пептококки и др.) в составе нормальной микрофлоры в последние годы обнаружены многочисленные представители и других факультативно-анаэробных групп микроорганизмов. Следует иметь в виду, что до настоящего времени число рутинно культивируемых анаэробных бактерий, составляющих нормальную микрофлору человека не превышает 7-50% их предполагаемого истинного количества. Подсчитано, что в кишечнике взрослого человека количество микроорганизмов составляет - 1013, в полости рта - Ю10, на коже -1012. Наиболее сложные микробиоценозы у млекопитающих - это микрофлора толстой кишки, ротовой полости и носоглотки, а также - гениталий. Поверхность кожи и пространства носовых ходов формируют более простые микробиоценозы. О чрезвычайной сложности состава микрофлоры человека свидетельствует тот факт, что 1г содержимого слепой кишки содержит порядка двух биллионов микроорганизмов, представителей 17 различных семейств, 45 родов и свыше 400 различных видов микроорганизмов. Количество характеристических (постоянно встречающихся) видов относительно невелико, но численно они всегда представлены в значительном количестве [202].
Микробиоценоз макроорганизма человека включает до 1000 видов бактерий, и в определенной степени представлен бактериями семейства Enterobacteriaceae. Эти микроорганизмы входящие в группу условно-патогенных бактерий весьма разнообразны по особенностям экологии, кругу хозяев, а также патогенности для человека, животных, насекомых, растений [103] и биологическая значимость этих микроорганизмов изучена недостаточно.
Условно-патогенные энтеробактерии, могут быть этиологическими факторами гнойно-септических заболеваний, инфекций мочеполового тракта, острых кишечных заболеваний и причиной внутрибольничных инфекций. Многие условно-патогенные энтеробактерии, способны вызывать заболевания не только при снижении естественной резистентности макроорганизма, но и при отсутствии нозологической специфичности [221]. Установлено, что патогенная и условно-патогенная микрофлора, наиболее часто колонизирующая различные участки тела человека обладает значительным набором ферментативных свойств и полирезистентностью к широкому спектру антибиотиков [164], являясь потенциальным этиологическим фактором развития эндогенных инфекционных заболеваний [137] и микробная флора биоценоза слизистых оболочек организма хозяина претерпевает изменения у лиц, страдающих различными заболеваниями [247].
Анализ особенностей микрофлоры различных участков тела человека, а так же у больных в отделениях интенсивной терапии показал, что у таких больных происходит замещение индигенной микрофлоры на несвойственные в норме энтерококки, стафилококки, грамотрицательные энтеро- и неферментирующие бактерии [44]. Наблюдение за состоянием условно-патогенной микрофлоры в пред- и после операционный период у хирургических больных, позволило выявить уменьшение колонизационной резистентности слизистой оболочки и увеличение частоты выделения ассоциированных вариаций условно-патогенных микроорганизмов, что возможно отражало влияние на общее состояние пациентов [273]. Имеются данные об отрицательном влиянии интоксикации организма, вызванных смешанными инфекциями условно-патогенных бактерий, на состояние общего иммунитета, сердечно-сосудистой системы [120], общего физического развития детей и подростков [217], а также на репродуктивную систему женщин детородного возраста [255]. Условно-патогенные микроорганизмы в виде монокультур или ассоциаций выделяются из мокроты, жидкости, гнойных отделяемых. При этом к числу наиболее часто высеваемых из патологического материала относят бактерии семейства Enterobacteriaceae [2,6,232].
Представители семейства Enterobacteriaceae широко распространены в почве, в воде открытых водоемов [113,153,281]. Некоторые исследователи считают их представителями естественной микрофлоры кишечника человека, т.к. часто обнаруживаются у практически здоровых людей [92,190,209]. Тем не менее, в последние годы участились сообщения, где авторы не сомневаются в этиологии развития гнойно-воспалительных, урологических и кишечных инфекций, вызванных исключительно бактериями семейства Enterobacteriaceae, особенно их ассоциированными антигеннесущими серотипами [86,98,99].
При этом данные ряда исследователей показывают, что по частоте встречаемости бактерии семейства Enterobacteriaceae при ассоциированных инфекционных процессах составляют от 9,3% до 14,5%, от общего числа из всех выделенных условно-патогенных грамотрицательных возбудителей [423]. По мнению же других авторов, высеваемость бактерий семейства Enterobacteriaceae при острых кишечных заболеваниях значительно выше и достигает 19,4-39,0% [153,154,155]. Sedlak J. et Rische H. описали случай вспышки пищевой токсикоинфекции, вызванной бактериями семейства Enterobacteriaceae, еще в первой половине XX века. Plots J. et al. у больных с пищевой токсикоинфекцией выделили ассоциации энтеробактерий. Описан случай вспышки пищевой токсикоинфекции, вызванный исключительно токсигенными ассоциированными культурами Enterobacteriaceae, источником которой явился растительный салат, который удобряли навозом свиней [264].
Иммунологические методы исследования
Патогенность in vivo изучали методом интраназального заражения мышей массой 16-18 г. [89]. Мышам массой 16-18 г под легким эфирным наркозом интраназально вводили 0,05 мл 18-часовой монокультуры или вариации сокультивируемых штаммов (6-8x106) бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus. Часть мышей немедленно забивали, вскрывали грудную клетку, извлекали легкие, а затем растирали в стерильных ступках со стеклянным песком в физиологическом растворе (1 мл) и определяли среднее количество микроорганизмов, попавших при инфицировании легких высевом соответствующих разведений на 2% агар Хоттингера. Культуры бактерий, вызывающие впервые 3-5 часов после заражения гибель 50% и более экспериментальных животных, считали высоковирулентными, в 12-18 часов -средневирулентными, в 36-48 часов - слабовирулентными, а не вызывающие каких-либо изменений в поведении животных - авирулентными.
Определение токсигенности культур проводили на изолированной кишке кролика [199]. Кроликам (1,5-2 кг), предварительно голодавшим в течение 24 часов, под барбитуровым наркозом (тиопентал натрия 10мг/кг веса) послойно вскрывали брюшную полость. На тонкой кишке кролика готовили 5 изолированных участков длиной 12 см с такими же интактными участками, не считая дистального и проксимального отделов, которые не были использованы в исследованиях. После введения монокультур и сокультивируемых штаммов в изолированные петли по 1 мл и контрольных проб, брюшную полость зашивали послойно. Через 16-18 часов животных умерщвляли воздушной эмболией, вскрывали брюшную полость и рассчитывали индекс дилатации отношением объема экссудата к длине изолированной петли (замеряли длину лигированного отрезка и объем жидкости). Положительной считали кишечную реакцию (V/L) при коэффициенте 1,0 и более. Результаты фотографировали цифровой фотокамерой "Canon".
Тест «отек лап» для определения LT-энтеротоксигенности моно-сокультвируемых штаммов бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus - проводили по методике Вартанян Ю.П. с соавт. [83]. Для этого в подушечку задней левой лапы мыши вводили 0,05 мл центрифугат 20-часовой монокультуры или сокультивируемой вариации штаммов Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus. Через 24 часа мышей умерщвляли эфиром, ампутировали задние лапки на уровне голеностопного сустава и взвешивали на торсионных весах. По разнице масс опытной и контрольной лап определяли показатель теста «отек лапки». За положительный результат принимали показатель, равный 65 мг и более. В качестве контроля использовали стерильный бульон Хоттингера и нагретые при 56 и 85С центрифугаты вариаций моно- и сокультивируемых штаммов..
Изучение ST-энтеротоксигенности моно- и сокультивируемых вариаций штаммов бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus проводили на мышах-сосунках [63]. Мышам-сосункам 2-3-дневного возраста, предварительно не кормленным в течение 20 часов, через анальное отверстие вводили 18-48-часовые бульонные культуры моно- и сокультивируемых микроорганизмов, в объеме 0,05-0,1 мл и через 4 часа умерщвляли эфиром, затем вскрывали, взвешивали кишечник и оставшуюся часть тела для последующего вычисления их соотношения по формуле: К = вес кишечника (мг): веса тела (мг), где К-коэффициент, свидетельствующий о накоплении жидкости в просвете кишечника, который должен быть при положительном результате не менее 0,065.
Кожнонекротическая способность бактерий была принята нами в качестве одного из критериев определения вирулентности бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp, Serratia spp., Proteus проводилась по общепринятой методике [108]. Способность давать некроз кожи на кроликах при внутрикожном введении изучалась в сравнении, как у моно-, так и у сокультивируемых энтеробактерий.
Для этого суточные моно- и сокультивируемые культуры УПЭ, с одинаковым количеством микробных клеток (2млрд.микробных тел в 1мл.), изучаемых нами микроорганизмов, на тщательно выстриженную кожу боковой поверхности тела кролика внутрикожно вводили суспензию живой культуры в объеме 0,125 или 0,250 мл. На одном кролике делали не более одной инъекции. Результаты опытов регистрировали через 12, 24, 48, 72 часа путем измерения размеров очага и установление характера воспаления (гнойник, некроз).
Выделение плазмидной ДНК моно- и сокультивируемых микроорганизмов проводили по методу Kado СТ. и Liu S.T. [353]. В 6 мл мясопептонного бульона в течение ночи выращивали монокультуры и сокультивировали штаммы бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus при 28-30C, осаждали центрифугированием в рефрижераторе при 7-8 тыс. обАмин в течение 20 минут. Осадок суспендировали в пробирке Eppendorf, содержащей 40 мкл буфера «ТАЕ» /Трис-7,2г, ЭДТА-1,1г, ледяная уксусная кислота - 2мл, вода дистиллированная -1500 мл/, добавляли 200 мкл лизирующей смеси /Трис - 300 мг, Sds - 3 г, Н20 -100 мл, рН - 12,6/ и прогревали всю смесь на водяной бане при 56С в течение часа. Затем одновременно добавляли 2 объема смеси фенол хлороформа (рН 7,6) и 0,2 объема 5М хлористого натрия и энергично встряхивали для получения равномерной суспензии. Смесь охлаждали и центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 15 минут при 4С. Верхнюю прозрачную водную фазу осторожно отбирали автоматической пипеткой в новые пробирки Eppendorf и добавляли 1\10 объема ЗМ ацетата натрия и 2 объема охлажденного 96 % этанола, осторожно перемешивали и ставили в морозильник на несколько часов. Затем в холоде центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 15 минут. Центрифугат осторожно сливали и ставили пробирки на фильтровальную бумагу вверх дном на 10 минут, к осадку добавляли осторожно холодный 70 % этанол в количестве 500 мкл, вращали пробирки и повторно ставили вверх дном на фильтровальную бумагу. Оставшийся осадок суспендировали в 50 мкл буфера «ТАЕ», где плазмидная ДНК растворялась и была готова к электрофорезу.
Характеристика персистентных свойств монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций
Инфекции, вызванные ассоциациями условно-патогенных энтеробактерий отличаются тем, что выделение микроорганизма из клинического материала подразумевает необходимость дальнейшего изучения биологических свойств культур с целью оценки их потенциальной патогенности.
Предметом исследования явилось обнаружение и их сравнительный анализ свойств, наличие которых коррелирует с патогенностью моно- и ассоциированных культур бактерий на различных этапах их взаимодействия с восприимчивым макроорганизмом и способностью противостоять факторам резистентности организма хозяина (персистенция) [58,63].
Литературные данные свидетельствуют, что применительно к условно-патогенным энтеробактериям и их ассоциированным культурам, являющимся представителями пато- и нормофлоры организма человека, ключевыми свойствами, позволяющими инактивировать факторы естественной противоинфекционной защиты макроорганизма, могут быть их антилизоцимная, антиинтерфероновая и антикомплиментарная активности [73].
3.3.1. Антилизоцимная активность
Для сохранения от бактерицидных факторов сыворотки или фагоцитов микробная клетка располагает средствами дистанционного действия, направленных на инактивацию определенных механизмов иммунного ответа организма. Среди специализированных и наиболее изученных у множества представителей микроорганизмов школой академика Бухарина О.В. в этом отношении является антилизоцимный фактор, который направлен на инактивацию тканевого лизоцима и лизоцима фагоцитов, обеспечивающий выживание возбудителя в макрофаге [56]. Кроме того выделяют антиинтерцидные и антикомплементарные факторы микроорганизмов, которые соответственно обладают инактивирующей активностью против катионных белков лейкоцитов и комплемента организма хозяина [76].
Исходя из этого, мы сочли необходимым провести сравнительное изучение фенотипического признака инактивации лизоцима у монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и у их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (E+C), Enterobacter spp.+Serratia spp.(E+S), Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+E.coli (Ent+E.coli), Citrobacter spp.+E.coli (C+E.coli), Serratia spp.+E.coli (S+E.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+E.coli(Prot+E.coli). Изучение антилизоцимной активности (АЛА) проводили по методу О.В. Бухарина (62). При этом культуры считали высокоактивными при нейтрализации лизоцима в концентрации более 10 мкг/мл, среднеактивными от 5 до 10 мкг/мл и слабоактивными до 5 мкг/мл.
Проведенные исследования показали, что из 50 монокультур Enterobacter spp. 30(60%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 10(33,3%) инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 8(26,6%) в концентрации 5-10 мкг/мл и 12(40%) в концентрации выше 10 мкг/мл; из 50 монокультур Citrobacter spp. - 25(50%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 12(48%) инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 10(40%) в концентрации 5 119
10 мкг/мл и 3(12%) в концентрации более 10 мкг/мл; из 50 штаммов Serratia spp. 26(52%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 10(38,4%) инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 11(42,3%) в концентрации 5-10 мкг/мл и 5(19,2%) в концентрации выше 10 мкг/мл; из 50 монокультур E.coli. 23(46%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 15(65,2%) инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 5(21,7%) в концентрации 5-10 мкг/мл и 3(13,04%) в концентрации выше 10 мкг/мл; из 50 штаммов Proteus spp. 25(50%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 10(40%) штаммов инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 12(48%) в концентрации 5-10 мкг/мл и 3(12%) в концентрации более 10 мкг/мл, соответственно.
В следующей серии опытов нами было проведено изучение антилизоцимной активности при совместном культивировании этих культур в вариациях: Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (E+C), Enterobacter spp.+ Serratia spp.(E+S), Citrobacter spp. + Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp. + E.coli (Ent+E.coli), Citrobacter spp.+E.coli (C+E.coli), Serratia spp.+ E.coli (S+E.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+E.coli(Prot+E.coli). Проведенные исследования показали, что из 10 вариаций совместно культивируемых штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter spp. 8(80%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из которых 1(12,5%) вариация в концентрации до 5 мкг/мл, 1(12,5%) вариация в концентрации 5-10 мкг/мл и 6(75%) вариаций в концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. -9(90%) вариаций инактивировали лизоцим, из которых 1(11,1%) вариация в концентрации до 5 мкг/мл, 2(22,2%) в концентрации 5-10 мкг/мл и 6(66,6%) в концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. 7(70%) инактивировали лизоцим, из которых 1(14,2%) в концентрации до 5 мкг/мл, 3(48,2%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл, 6(60%) вариаций инактивировали лизоцим в концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Enterobacter spp.+E.coli - 7(70%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из которых 1(14,2%) вариация в концентрации до 120 мкг/мл, 4(57,1%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 2(21,5%) вариации в концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Citrobacter spp.+ E.coli 7(70%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из них 1(14,2%) вариация инактивировала лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 4(57,1%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 2(28,5%) вариация в концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Serratia spp.+E.coli 7(70%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из которых 2(28,5%) в концентрации до 5 мкг/мл, 4(57,1%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 1(14,2%) вариация в концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp. 8(80%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из которых 2(25%) вариации инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 2(25%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 4(50%) вариации инактивировали лизоцим в концентрации выше 10 мкг/мл; из вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp. 8(80%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из которых 2(25%) вариации инактивировали лизоцим в концентрации 5-10 мкг/мл и 6(75%) вариаций в концентрации выше 10 мкг/мл; из вариаций Proteus spp.+Serratia spp. 8(80%) инактивировали лизоцим, из которых 4(50%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл, 4(50%) вариаций инактивировали лизоцим в концентрации выше 10 мкг/мл; и из 10 вариаций Proteus spp.+E.coli 7 вариаций были способны инактивировать лизоцим, среди которых 1(14,2%) вариация в концентрации до 5 мкг/мл, 2(21,5%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 4(57,1%)вариации в концентрации выше 10 мкг/мл, соответсвенно.
Таким образом, результаты данного раздела проведенных исследований показывают, что совместно культивируемые штаммы в вариациях: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli , Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, чаще обладалют высокими и средними значениями антилизоцимной активности, чем их монокультуры, что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости и персистентного потенциала бактерий
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., выделенных при ассоциированных гнойно-воспалительных процессах различной локализации. Исследования по изучению антилизоцимной активности монокультур и сокультивируемых условно-патогенных энтеробактерий были проведены совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Изменение биопленкообразования и антилизоцимной активности Citrobacter freundii под действием метаболитов кишечной микробиоты / Н.Б. Перунова, В.Г. Туйгунова, Е.В. Иванова, Ю.З. Габидуллин // Научно-практический журнал «Медицинский вестник Башкортостана, 2013. Т.8., - №4. - С. 61 - 64).
Сравнительное изучение влияния монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli, на формирование экстрациллюлярных сетей периферической крови
Штаммы Citrobacter spp. были чувствительными к азтреонаму, амикацину, ампицилину, имипенаму, карбенициллину, клиндамицину, левомецитину, меропенему, налидиксовой кислоте, неомецину, нетилмецину, олеандомецину, офлоксацину, пиперацилину, рокситромицину, стрептомецину, тобрамицину, цефазолину, цефаклору, цефалексину, цефамандолу, цефиксиму, цефоперазону, цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, цефуроксиму, ципрофлоксацину. Были умеренно чувствительными к азитромицину, канамицину, рифампицину, фуродонину, цефалотину и были не чувствительными к азлоциллину, бензилпнициллину, ванкомицину, гентамицину, доксициклину, кларитромицину, линкомицину, оксациллину, полимексину, ристомицину, сизомицину, тетрациклину, фузидину, цефипиму, эритромицину.
Штаммы Serratia spp. были чувствительными к азлоциллину, азтреонаму, амикацину, гентамицину, имипенаму, канамицину, карбенициллину, меропенему, налидиксовой кислоте, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, рифампицину, стрептомецину, тетрациклину, тобрамицину, фузидину, цефаклору, цефалотину, цефамандолу, цефипиму, цефоперазону, цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлоксацину. Штаммы Serratia spp. были умеренно чувствительными к ванкомицину, доксициклину, клиндамицину, левомецитину, неомецину, сизомицину, фуродонину и были не чувствительными к азитромицину, ампициллину, бензилпенициллину, кларитромицину, линкомицину, оксациллину, олеандомицину, полимиксину, ристомицину, рокситромицину, фурагину, цефазолину, цефалексину, цефиксиму, цефипиму, цефуроксиму, эритромицину.
Исследование антибиотикочувствительности монокультур E.coli показали, что штаммы E.coli были чувствительными к азитрамицину, азлоциллину, ампицилину, бензилпнициллину, ванкомицину, имипенаму карбенициллину, клиндамицину, левомицитину, линкомицину, налидиксовой кислоте, оксациллину, олеандомицину, полимиксину, ристомицину, рокситромицину, сизомицину, стрептомицину, тетрациклину, тобрамицину, фузидину, фурагину, цефаклору, цефалексину, цефамандолу, цефуроксиму,. Были умеренно чувствительны к действию амикацину, гентамицину, доксициклину, канамицину, кларитромицину, цефатоксиму и были не чувствительны к действию азтреонаму, меропенему, неомецину, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, рифампицину, фуродонину, цефазолину, цефалотину, цефиксиму, цефипиму, цефоперазону, цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлоксацину.
Штаммы Proteus spp. были чувствительными к азлоциллину, азтреонаму, амикацину, гентамицину, имипенаму, канамицину, карбенициллину, меропенему, налидиксовой кислоте, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, рифампицину, стрептомецину, тетрациклину, тобрамицину, фузидину, цефаклору, цефалотину, цефамандолу, цефипиму, цефоперазону, цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлоксацину. Штаммы Proteus spp. были умеренно чувствительными к ванкомицину, доксициклину, клиндамицину, левомецитину, неомецину, сизомицину, фуродонину и были не чувствительными к азитромицину, ампициллину, бензилпенициллину, кларитромицину, линкомицину, оксациллину, олеандомицину, полимиксину, ристомицину, рокситромицину, фурагину, цефазолину, цефалексину, цефиксиму, цефуроксиму, эритромицину.
А исследование антибиотикорезистентности вариаций совместно культивируемых штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. в вариациях: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli показало, что происходило расширение спектра резистентности культур к вышеперечисленным антибиотикам, так при вариациях Enterobacter spp.+Citrobacter spp. к 11 антибиотикам: в частности к амикацину, имипенаму, меропенему, нетилмецину, олеандомецину, офлоксацину, цефазолину, цефиксиму, цефотаксиму, цефтазидиму, ципрофлосацину, были умеренно чувствительны к 8 антибактериальным препаратам: в частности к азтреонаму, доксициклину, налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу, цефоперазону и цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам, культуры совместно культивируемых вариаций Enterobacter spp.+Citrobacter spp. были не чувствительными.
При исследовании чувствительности к антибиотикам вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. были чувствительными к 12 из 49 антибиотика, в частности к амикацину, имипенаму, меропенему, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, цефиксиму, цефипиму, цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлосацину; были умеренно чувствительными к азитромицину, азтреонаму, ампициллину, клиндамицину, налидиксовой кислоте, неомецину, рифампицину, стрептомицину, фузидину, цефазолину, цефалотину, цефоперазону и цефуроксиму, к остальным 35 антибиотикам вариации совместно сокультивируемых штаммов Enterobacter spp.+Serratia spp. были не чувствительными.
При исследовании чувствительности вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. были чувствительными к действию 10 из 49 антибактериальных препаратов, в частности к амикацину, гентамицину, имипенаму, мерпенему, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлосацину; были умеренно чувствительными к 9 препаратам - азлоциллину, азтреонаму, карбенициллину, налидиксовой кислоте, олеандомецину, рифампицину, фузидину, цефалотину, цефамандолу, цефотоксиму, а к остальным 30 антибактериальным препаратам были не чувствительными.
Исследование чувствительности к антибиотикам вариаций Enterobacter spp.+E.coli показало, что так же, как и при исследовании других сокультивируемых вариаций изучаемых нами микроорганизмов происходило изменение параметров данного признака: вариации Enterobacter spp.+E.coli были чувствительными к действию 13 из 49 антибактериальных препаратов, в частности в частности к амикацину, ампициллину, гентамицину, имипенаму, мерпенему, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлосацину; были умеренно чувствительными к азлоциллину, азтреонаму, а к остальным 36 антибактериальным препаратам были не чувствительными.
При исследовании чувствительности к антибиотикам вариаций Citrobacter spp.+E.coli - были чувствительными к действию 11 антибиотиков: в частности амикацина, имипенама, меропенема, нетилмецина, олеандомецина, офлоксацина, цефазолина, цефиксима, цефотаксима, цефтазидима, ципрофлосацина, были умеренно чувствительны к действию 8 препаратов: в частности к азтреонаму, доксициклину, налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу, цефоперазону и цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам вариации Citrobacter spp.+E.coli были не чувствительны.
Так исследование вариаций Serratia spp.+E.coli показало, что они были чувствительны к 11 антибиотикам: в частности к амикацину, имипенаму, меропенему, нетилмецину, олеандомецину, офлоксацину, цефазолину, цефиксиму, цефотаксиму, цефтазидиму, ципрофлосацину, были умеренно чувствительны к 8 антибактериальным препаратам: в частности к азтреонаму, доксициклину, налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу, цефоперазону и цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам, вариации Serratia spp.+E.coli были не чувствительными.
