Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности биологии candida SP. (обзор литературы) 12
1.1. Хронобиологические особенности грибов 12
1.2. Морфофункциональные, цито- и патогенетические особенности Сandida sp 24
1.3. Механизмы адаптации Сandida sp. в системе ассоциативного симбио-за 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 48
2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе 48
2.2. Методы выделения и идентификации культур Candida sp 49
2.3. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов 54
2.4. Метод изучения влияния температуры на биологические свойства Candida sp 59
2.5. Метод изучения регулирующего влияния флуконазола на биологические свойства дрожжевых грибов .59
2.6. Методы изучения регулирующего влияния экзометаболитов микросимбионтов на биологические свойства Candida sp.. 61
2.7. Метод определения «свой - чужой» на модели микросимбиоценоза кишечника человека 63
2.8. Методы статистической обработки полученных результатов 65
ГЛАВА 3. Хронобиологические особенности эталонных штаммов грибов рода candidа 68
3.1. Хронобиологические особенности C. albicans 24433 69
3.2. Хронобиологические особенности C. non-albicans 73
3.3. Сравнительная характеристика амплитудно-фазовых показателей суточных ритмов биологических свойств Candida sp 78
ГЛАВА 4. Хронобиологические особенности candida sp.,выделенные из биотопов здорового и больного кан дидозом человека 83
4.1. Адгезивная активность Candida sp. в течение суток 84
4.2. Пролиферативная активность Candida sp. в течение суток 92
4.3. Морфологическая активность Candida sp. в течение суток 100
4.4. Фосфолипазная активность Candida sp. в течение суток 108
4.5. Протеазная активность Candida sp. в течение суток 116
4.6. Каталазная активность Candida sp. в течение суток 124
4.7. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств изолятов Candida sp. 131
4.8. Модификационная изменчивость Candida sp. в зависимости от условий существования .136
ГЛАВА 5. Механизмы формирования временной организации биологических свойств candida sp. в условиях ассоциативного симбиоза 146
5.1. Факторы - регуляторы биоритмов физиологических функций Candida sp. при их адаптации к условиям организма здоровых людей 147
5.2. Факторы - регуляторы биоритмов физиологических функций Candida spp. при их адаптации к условиям больного кандидоза человека 161
5.3. Сочетанное влияние флуконазола и бактериальных метаболитов на временную организацию биологических свойств клинических изолятов C. albi-cans 169
ГЛАВА 6. Регулирующее действие бактериальных метаболитов на хроноинфраструктуру клинических изо-лятов candida SP .177
6.1. Влияние бактериальных метаболитов на хронопоказатели биологической активности клинических изолятов Candida sp., выделенных из кишечника здоровых людей .178
6.2.Влияние бактериальных метаболитов на хронопоказатели биологических свойств клинических изолятов Candida sp., выделенных из кишечника больных острым кандидозом .187
6.3. Хронобиологические критерии диагностики «свой - чужой» в микросим биоценозах 197
Заключение .217
Выводы 233
Список использованных источников
- Морфофункциональные, цито- и патогенетические особенности Сandida sp
- Метод изучения регулирующего влияния флуконазола на биологические свойства дрожжевых грибов
- Сравнительная характеристика амплитудно-фазовых показателей суточных ритмов биологических свойств Candida sp
- Фосфолипазная активность Candida sp. в течение суток
Введение к работе
Актуальность проблемы
Грибы рода Candida уникальные микроорганизмы, обладающие колоссальным адаптивнымпотенциалом и широко распространены в природе (Масю-кова С.А. соавт., 2004; Короткова Т.Н., 2006). В организме человека Candidasp. входят в состав различных микросимбиоценозов и часто инициируют развитие оппортунистических инфекций, особенно у пациентов с иммунодефицитными состояниями.Колонизацияслизистых оболочек организма человека микромице-тами является результатом симбиотических отношений с макроорганизмом и микросимбионтами в условиях ассоциативного симбиоза (Бухарин О.В., 2007). Включение в этот симбиоз Candidasp. возможно благодаря различным адаптивным механизмамгрибов, проявляющих пластичность физиологических функций в различных условиях окружающей среды.
В настоящее время изучение механизмов адаптации является проблемой современной биологии и медицины, тесно связанной с вопросами биоритмологии, так как ритмы охватывают все проявления живого - от деятельности субклеточных структур и отдельных клеток до сложных форм поведения организма и экологической системы, символизируя саму жизнь (Арушанян Э.Б., 2000). Автономный самоподдерживающий процесс периодического чередования состояний клетки и колебаний интенсивности физиологических процессов с одной стороны, достаточно стабилен и по возможности независим от многочисленных случайных воздействий, за счет своей внутренней синхронизации, с другой, лабилен, постоянно подстраивается к новой среде обитания (Шмальгау-зенИ.И., 1983;Губин Д.Г.,2000).
Сведения о факторах адгезии и инвазии С. аІЬісатнє дают полной информации о биологии грибоврода Candida. Противоречивы данные о патогенном потенциале и его реализации у С. поп-albicans. (Васильева Н.В. с соавт., 2002;Карпунина Т.И. с соавт., 2006; Горбасенко Н.В., 2006). Поэтому использование хронобиологического метода, как методического приема, на наш
взгляд,открывает новые перспективы при изyчeниифизиoлoгииCandidasp.
В источниках литературы отсутствуют сведения о суточной динамике ростовых и патогенных свойствах грибов рода Candida, не сформировано представление об их временной организации. Открытым остается вопрос регуляции биологических свойств микромицетов. Не изучена временная организация микросимбионтов при формировании бактериально - грибковых микросимбиоце-нозов.
Поэтому, комплексныйподход с позиции микробиологии и хронобиологии позволяет оценить резерв саморегуляции микроорганизма и открывает возможности управлять их жизнеспособностью и прогнозировать устойчивость к используемым средствам.
Цель и задачи исследования
Цель исследования - изучить особенности временной организации биологических свойств грибов рода Candida и их регуляцию под действием факторов различной природы Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Сформировать представление о временной организации биологической активности эталонных штаммов и клинических изолятов грибов рода Candida, выделенных из различных биотопов здоровых и больных кандидозом людей.
-
Изучить влияние абиотических и биотических факторов на формирование хроноинфраструктуры физиологической активности Candidasp. в исследованиях invitro и выявить условия, приводящие к десинхронозу биологической активностигрибов.
-
Охарактеризовать роль бактерий, представителей доминантной и ассоциативной микробиоты, в регуляции временной организации биологических свойств клинических изолятов Candidasp. в бактериально - грибковых ассоциациях.
-
Выявить ритмометрические критерии, позволяющие оценивать феномен микробного распознавания «свой - чужой» при формировании микросим-биоценозов.
Новизна исследования
Впервые проведены фундаментальные многофакторные исследования и представлен комплексный анализ хроноинфраструктуры биологических свойств (пролиферативной, адгезивной, морфологической, фосфолипазной, протеазной, каталазной активности)уэталонных штаммов и клинических изолятовСапсіісіазр.
Доказано, что временные ряды изучаемых свойств уэталонных штаммов -объективная индивидуальная характеристикавида (патент РФ на изобретение № 2319747 от 20.03.2008 года «Способ выявления Candidaalbicans по биоритмам»).
Экспериментально установлено, что временная организация физиологической активностиклинических изолятов Candidasp., полученных из кишечника, зева и влагалища, не зависит от вида гриба и биотопа. Выявлены универсальные ритмометрические характеристики (вклад ритма и амплитудно - фазовая стабильность), различающие штаммы, полученные от здоровых людей от изолятов, выделенных от больных пациентов.
Впервые выявлены факторы, формирующие последовательность и согласованность проявления биологических свойств клинических изолятов грибов рода Candida во времени. Под действием температуры 37 С или метаболитов дисбиотической кишечной микрофлоры эталонные штаммы Candidasp. приобрели временную организацию физиологических функций характерную для изолятов, выделенных от здоровых людей. Сочетанное воздействие субфунгиоста-тических концентраций флуконазола и метаболитов, представителей нормоф-лоры биотопа, приводило к формированию хроноинфраструктуры биологической aKTHBHOCTnCandidasp., характерной для культур, высеваемых при кандидо-зе.
Выявлена однотипная реакция С. albicans на воздействие регуляторных факторов (микросимбионты, флуконазол и их сочетание), проявляющаяся в виде десинхроноза биоритмов физиологических функций грибов, как свидетель-
ствоистощения адаптивных возможностей микромицетов к изменяющимся условиям среды.
При изучении іпупгомеханизмов формирования микросимбиоценоза установлено, что временная организация биологических свойств Candidasp., выделенных из биотопов Candida- носителей стабильна и независима отвоздействия метаболитов бактерий. Лабильность биоритмов физиологической активности выявлена у грибов, полученных из клинического материала больных людей.
Хронобиологический подход позволил дифференцировать invitro«CBOH» и «чужие» микро симбионты при формировании бактериально-грибковых ассоциаций на модели микросимбиоценоза дистального отдела толстого кишечника. Амплитудно - фазовая характеристика и среднесуточные значения биологической активности являлись маркерами оппозитных (усиление/подавление) взаимодействий в условиях микросимбиоценоза.
Научно-практическая значимость
Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению биологических свойств грибов рода Candida. Совокупность полученных данных о суточной динамикеростовых и патогенных характеристик микромицетов позволяют сформировать представление об их временной орга-низации.Изученные ритмичные процессы, их лабильность под влиянием факторов различной природы, последовательность и согласованность проявления в течение суток расширяют теоретические представления о биологии патогенных дрожжей и их способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.
Результаты работы можно использовать для решения фундаментальных вопросов современной микробиологии - изучения механизмов биорегуляции в микросимбиоценозах макроорганизма. Хронобиологический подход раскрывает механизмы формирования микробиоценозов на основе феномена распознавания «свой-чужой» в бактериально - грибковых ассоциациях.
Практическое значение исследований определяется разработкой нового подхода к изучению биологических CBoficTBCandidasp., в том числе С. поп - albicans, позволяющего выявлять периоды высокой экспрессии физиологических
свойств в течение суток.Предложенный метод может быть использован в работе научно-исследовательских и практических лабораторий, а также в учебно-педагогическом процессекафедры микробиологии(акт внедрения результатов диссертационной работы № 01/04 от 07.02.2013 г.).
Положения, выносимые на защиту:
1. Хроноинфраструктура, отражающая распределение биологических свойств
клинических изолятов Candidasp. в течение суток, имеет отличия по вкладу ритма у грибов, выделенных от здоровых (циркадианный) и больных (ульт-радианный) и изменяется, приобретая ритм, отражающий видовую специфичность грибов при культивировании их вне организма.
2. Временная организация биологических свойств Candidasp. формируется под
действием факторов биотической и абиотической природы, являясь информативными универсальным критерием физиологической адаптациигрибов.
3. Хронобиологический подход является «инструментом» для изучения меха-
низма микробного распознавания «свой - чужой», основанного на изменении амплитудно-фазовой характеристики физиологической активности микросимбионтов в паре «доминант - ассоциант» в бактериально - грибковых ассоциациях.
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V;VII Всероссийских конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006; 2012);Всероссийских научно-практических конференциях «Оппортунистические микозы. Кандидозы» (Тюмень, 2006; 2011);V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва; 2007); научной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН «Медицинская академическая наука - здоровью населения Урала» (Челябинск; 2008); I Междисциплинарном микологическом форуме (Москва; 2009); заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009; XVIII Международной
научной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь; 2010); Все-
российских научно-практических конференции с международным участием по медицинской микологии (Санкт-Петербург, 2008; 2009; 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 43 научные работы, из них 16 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент на изобрете-ния,опубликовано 1 учебное пособие.
Объем и структура диссертационной работы
Морфофункциональные, цито- и патогенетические особенности Сandida sp
Представления об оппортунистических микозах как моноинфекции в
настоящее время являются несостоятельными. Сandida sp. в одиночку не способны вызвать поражения. Проявление у Candida sp. агрессивных свойств связано не только с угнетением защитных сил макроорганизма, но и явлениями паразитоценоза (ассоциации патогенных бактерий, грибов и вирусов) (Хмельницкий О.К. с соавт., 1998; 2000; 2002).
Микроорганизмы, в отличие от высших организмов, ограничены в выборе своего микроокружения. Но они реализуют потенциальную возможность включать специальные реакции в ответ на изменения окружающей среды, что обеспечивает им выживание и конкурентоспособность.
Сandida sp. - компонент микробиоты, симбионтной для человека (Агапов С. А., 2009). Частота выделения грибов у людей в ротовой полости – 1,9-41,0%, желудочно-кишечном тракте – 65,0-80,0%, влагалище – 2,5-68,0% (Бурова С. А. с соавт., 1997; Прилепская В. Н. с соавт, 1997; Антонов В.Б., 2001; Коноплева В.И., 2002; Кузьмин В.Н., 2008).
По современным представлениям, основным биотопом для Сandida sp. является кишечник (Златкина А.Р. с соавт., 2001). Весьма важная роль в ограничении роста популяции Candida sp. у здорового человека принадлежит бактериям – кишечным симбионтам рода Bifidumbacterium, Bacteroides, Lacobacterium, Еscherichia (Рrescott R.J. et al., 1992; Перунова Н.Б., 2003; Бухарин О.В., 2005). В зеве здорового человека Candida sp. чаще формирует микробиоценозы с бактериями рода Staphylococcus (30%), Streptococcus (35%), Protei (20%), Neisseria (10%) (Соколова Т.В. с соавт., 2007). Влагалище следует рассматривать как экологическую нишу, в которой Candida sp. встречается в ассоциациях с лактобациллами (палочка Додерлейна) и коринебакте-риями (дифтероиды) (Башмакова М.А. с соавт., 1997; Кулаков В.И., 2009).
В микросимбиоценозах между разными видами складываются сложные и неоднозначные антагонистические или синергические отношения (Иванова Е.В., 2008; 2010), базирующиеся на различных каналах связи между микросимбионтами, включающими: клеточные взаимодействия, такие как адгезия, коагрегация, рецепторные распознавания (Kolenbrander P.E., 2000; Palmer R.J. et al., 2001, 2006; Kolenbrander P.E. et al., 2002), генетический обмен (Li Y. et al., 2001) и выработку сигнальных метаболитов (Кrisanaprakornkit S. et al., 2000; Fong K.P. et al., 2001; Burgess N.A. et al., 2002), которые являются ингибиторами или стимуляторами роста (Гребенев А. Л. с соавт., 1994; Петров Л.Н. с соавт., 2006; Вахитов Т.Я., 2007; Иванова В.В., 2007) и существенно влияют на характер инфекционного процесса (Величко Е.В. с соавт., 1986; Долгушина В.Ф. с соавт., 2004; Karagozov I. et al., 2004; Zhou X. et al., 2004; Mijac V.D. et al., 2006).
Одним из механизмов выживания микроорганизмов в популяции может служить их «социальное поведение» («quorum sensing», QS) (Гинцбург А.Л. с соавт., 2004; Чернуха М.Ю. с соавт., 2006). Аутоиндукторами QS-регуляции признаны химические молекулы (олигопептиды, гомосеринлакто-ны и др.). С помощью них осуществляется передача информации между отдельными клетками микроорганизмов, принадлежащих к одному или к разным видам, родам или даже семействам (Николаев Ю.А., 2011; Greenberg E. et al., 1996). Показано, что у симбиотических грамотрицательных бактерий под контролем QS-системы, включающей два белка, гомологичных Lux R и Lux I-белкам Vibrio fischeri, рецепторному белку, и гомосеринлактону, находятся следующие функции: синтез факторов вирулентности (токсина А, эла-стаза, экзопротеаза и др.) и биосинтез фенозиновых антибиотиков у псевдомонад (Хмель И.А., 2006; Miller M., Bassler B., 2001). Установлено, что формирование псевдомицелия у грибов ингибируется сигнальными молекулами QS-системы (3-оксо-С12 –ацил-гомосерин-лактоном), вырабатываемым P. аe-ruginosa (Пинегина О.Н., 2008).
В микросимбиоценозах в ходе эволюции сложилось подвижное равновесие между доминантными микробами, определяющими колонизационную резистентность организма хозяина и ассоциативными микроорганизмами (Бухарин О.В. с соавт., 2006).
На сегодняшний день достигнуты определенные успехи ученых в изучении особенностей биологических свойств микроорганизмов в паре «доминант - ассоциант» (Перунова Н.Б., 2011; Анзабаева Л.М, 2012). Установлено, что экзометаболиты микросимбионтов, обладая плейотропным действием, осуществляют регуляторную функцию: в высоких концентрациях угнетают размножение условно-патогенных микроорганизмов, а в субингибиторных – модифицируют их персистентные свойства (антилизоцимную активность и биопленкобразование).
Анализ данных литературы показал, что представители доминантной микробиоты биотопа проявляют микробный антагонизм относительно условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов (Парфенов А.И. с со-авт., 1998). Ряд авторов указывает, что данная функция реализуется путем конкуренции за питательные вещества и локусы адгезии (Бондаренко А.В. с соавт., 1998; Яхонтова О.М. с соавт., 2002; Циммерман Я.С., 2008). По мнению В. С. Бондаренко (2007) при нормобиоценозе биотопа за счет продукции лизоцима, органических кислот и метаболитов аутохтонной микробиоты биотопа снижается кислотность среды, что также угнетает развитие микро-мицетов.
Метод изучения регулирующего влияния флуконазола на биологические свойства дрожжевых грибов
При данной конечной концентрации фильтрат стабильно сохранял свое влияние на исследуемые культуры грибов. 2) контроль № 1 - в 0,8 мл бульона Шедлер-бульона вносили 0,1 мл сте рильного супернатанта бактерий (контроль, т.е. супернатанты тех штаммов, которые предварительно соинкубировали с физ. раствором) и 0,1 мл взвеси грибов (3 ед. по Мак-Фарланду). Общий объем составлял 1 мл. 3) контроль № 2 - 0,1 мл взвеси дрожжевых культур в 0,9 мл бульона, не содержащего экзометаболитов воздействующих культур. Использовали для определения исходного уровня биологических свойств исследуемых штаммов, в отношении которых изучали динамику биологических свойств. 4) контроль № 3 - проверка стерильности питательного бульона (1 мл). 5) контроль № 4 - 0,1 мл фильтрата бактерий (супернатанты тех штаммов, которые предварительно соинкубировали с метаболитами грибов) вносили в 0,9 мл бульона Шедлер-бульона для контроля активности фильтрата воздействующих культур в отношении исследуемого свойства. 6) контроль № 5 - 0,1 мл стерильного супернатанта бактерий (контроль, т.е. супернатанты тех штаммов, которые предварительно соинкубировали с физ. раствором) вносили в 0,9 мл бульона Шедлер-бульона для контроля активности фильтрата воздействующих культур в отношении исследуемого свойства. Посевы выращивали в течение 24- 48 ч при 37 С.
Статистическая обработка результатов Методы описательной статистики. Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов проводили с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2010. Определяли М – среднее арифметическое, – среднеквадратичное отклонение, m – средняя ошибка среднего арифметического, при этом данные представлялись по форме М±m или М±.
Методы сравнительной статистики. При соответствии сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по 2) использовали t – критерий Стьюдента. В других случаях достоверность различия сравниваемых вы-65 борок определяли непараметрическим методом статистической обработки: критерий Уилкоксона (W) применяли для связанных выборок (до и после воздействия), критерий Манна-Уитни (Т) - для несвязанных выборок (опыт -котроль, музейные и госпитальные культуры). Анализируемые различия считали достоверными при р 0,05.
Методы корреляционного анализа. В настоящем исследовании для установления связи между параметрами использовали корреляционный анализ по Спирмену (метод ранговой корреляции), относящийся к категории непараметрических, что позволяет отказаться от предварительной оценки нормальности распределения сравниваемых признаков (Гланц С, 1999).
Методы статистического анализа в хронобиологических исследованиях. Хронодизайн исследований подразумевал получение по каждой оцениваемой функции 6-ти измерений в сутки с 3-5-ти кратным повторением условий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности р 0,05 (Nelson W. et al, 1979). Поиск достоверных ритмов проведен линейно по периоду с шагом поиска 1 час в спектральном диапазоне 8-24 ч., где было выявлено два основных спектральных компонента с периодами Т=12 часов и Т=24 часа. Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с Т=8, Т=12 и Т=24 часа: мезор (М) - среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (А) - расстояние от экстремума до мезора и акрофаза (ф) - момент времени ожидаемого экстремума функции. При этом значение изучаемой функции (у) в момент времени t определяется формулой у (t) = М+ACos (ot+ф) + s(t), где s(t) - остаточная погрешность (остаточная сумма квадратов, которая для данной аппроксимирующей кривой и должна быть наименьшей). Общая вариабельность описываемой функции (Е (у - у)2) может быть подразделена на вариабельность, описываемую моделью, т.е. косинусоидой (модельную сумму квадратов, МСК) и остаточную сумму квадратов (ОСК): I (у - у)2 = Е (у - $ + Е (z- у)2 = ОСК + МСК Значения у являются показателями, рассчитанными по модели наилучшей аппроксимации наблюдаемой функции.
Большое значение в сравнительном анализе выраженности двух ритмов с разными периодами и существенно различающимися мезором и амплитудой имеет показатель процентного вклада ритма (ПВР) в общую вариабельность (ПВР), который расчитывался как: ПВР = МСК / (МСК+ОСК) = R2
При ОСК=0, ПВ=100%, что означает, что функция всецело описывается косинусоидой с заданными параметрами. Чем лучше временной ряд из полученных в эксперименте значений моделируется кривой с соответствующими параметрами, тем выше будет значение ПВР.
Для анализа хронограмм был применен метод группового косинор-анализа, реализованного с использованием программы «Cosinor Ellipse» (Нопин СВ. с соавт., 2006) и в виде прикладной программы «Групповой ко-синор анализ» (Тимохина Т.Х. с соавт., 2009). Математический аппарат, лежащий в основе программ, основан на методе наименьших квадратов (Кати-нас Г.С., 1989), обеспечивающий забор данных в автоматическом режиме из заданной области документа MS Excel. Затем происходит аппроксимация с периодом T и расчет коэффициента корреляции, после чего период увеличивается на dT (задается вручную перед началом расчетов) и вновь проводится аппроксимация с расчетом коэффициента корреляции. Следующим этапом вычислений для моделей с наибольшим коэффициентом корреляции является расчет основных параметров ритма, таких как амплитуда, акрофаза и их погрешности. Последним этапом происходит построение доверительного эллипса в полярной системе координат. Полуоси эллипса численно равны значениям погрешностей амплитуды и акрофазы. Координаты центра эллипса определяются расстоянием от центра координатной системы, которое численно равно значению акрофазы, а так же углом, соответствующим значению амплитуды.
Сравнительная характеристика амплитудно-фазовых показателей суточных ритмов биологических свойств Candida sp
Среднесуточные значения у всех штаммов, независимо от биотопа выделения и вида гриба, имели сходные значения. Обращает на себя внимание тот факт, что мезор ферментативной активности культур из исследуемого материала больных пациентов выше, чем у культур от здоровых людей в 1,7-2 раза (р 0,05). Максимальные значения активности фермента Candida sp. регистрировались в ночное и дневное время (рис. 34; 35). мг/мин мл
Суточная динамика активности протеазы клинических изолятов C. non - albicans из биотопов больных кандидозом людей
Примечание: по оси абсцисс - время суток, часы; по оси ординат – активность протеазы, мг/минмл.
Критерий Манна-Уитни выявил достоверность данных различий -Т=28,0 и Т=30,0; р 0,05; при сравнении C. albicans 192 и 147, 463; Т=34,0 и Т=26,0; р 0,05; - C. albicans 597 и 641; 644; Т=35,0; Т=35,0 и Т=36,0; р 0,05; -C. albicans 98 и 160; 162 и 169 соответственно; Т=36,0 и Т=32,0; р 0,05; при сравнении C. tropicalis 23 и 412, 655; Т=28,0 и Т=22,0; при р 0,05; между культурами С. krusei 22, 53 и 784. У грибов вида C. albicans снижалась амплитуда колебаний функции от 3 раз (биотоп зев) до 9 раз (биотоп кишечник). У грибов видов C. tropicalis и C. krusei значения амплитуды не зависели от патогенности штамма.
Согласно результатам корреляционного анализа, у C. albicans, полученных из биотопов здоровых людей, в период максимальной активности фермента наблюдался минимум пролиферации и максимум адгезии, морфогенеза и активности фосфолипазы. У изолятов C. tropicalis 412, 655 и C. kresei 22 и 53 выявлена достоверная прямая корреляция между протеазной и фосфоли-пазной активностью и обратная с показателями морфогенеза.
При кандидозе у грибов рода Candida установлена прямая корреляционная связь между всеми изучаемыми свойствами (табл. 42).
Сопоставление полученных экспериментальных данных эталонных штаммов с клиническими изолятами выявило следующие закономерности. Во – первых, у эталонных штаммов и изолятов, выделенных из исследуемого материала здоровых людей C. albicans, С. tropicalis и C. кrusei, обнаружена идентичность ритмометрических показателей протеазной активности (вклад ритма, мезор, акрофаза).
Во-вторых, хроноинфраструктура протеазной активности грибов всех видов, выделенных из биотопов больного человека, достоверно отличалась от эталонного штамма по вкладу ритма, акрофазе и высоким значениям ме-123 зора. Данный факт подтверждался непараметрическим методом статистической обработки (табл. 43).
При исследовании суточной динамики каталазной активности Candida sp. из всех биотопов здоровых людей установлено, что грибы имели досто-уточный ритм и аналогичный профиль ритма (рис. 36 - 38). мкмоль/мин млмоль/мин мл
Суточная динамика активности каталазы клинических изолятов С. albicans из зева здоровых людей Примечание: по оси абсцисс - время суток, часы; по оси ординат - активность каталазы, мкмоль/мин. Суточная динамика активности каталазы клинических изоля-тов C. tropicalis, полученных от здоровых людей
Примечание: по оси абсцисс - время суток, часы; по оси ординат – активность каталазы, мкмоль/мин. мкмоль/мин мл
Суточная динамика активности каталазы клинических изоля-тов C. krusei, полученных от здоровых людей Примечание: по оси абсцисс - время суток, часы; по оси ординат – активность каталазы, мкмоль/мин.
Дрожжи проявляли наибольшую активность каталазы в утренние часы 03.30 - 08.11 и минимальную в вечернее и ночное время. Изоляты С. albicans, выделенные из зева пациента, активнее в 1,4-2,6 раз, чем изоляты С.albicans из других биотопов, а также культуры C. tropicalis и C. krusei (табл. 44; 45).
Ритмометрические параметры активности каталазы изолятов С. аlbicans, выделенных из биотопов здоровых людей Вклад ритма,% МезорМ±т,мкмоль/мин Амплитуда, мкмоль/мин Акрофаза, час
По результатам проведенных исследований, используя популяционный косинор – анализ, установили, что амплитудно-фазовая стабильность биологической активности культур Candida sp., выделенных от здоровых людей, не зависела от биотопа выделения и вида гриба. У грибов рода Candida регистрировались околосуточные биоритмы, что обеспечило их быструю адаптацию к биоритмам человека. Периоды физиологической активности начинались традиционно с прикрепления, затем микроорганизмы увеличивали численность популяции и выделяли ферменты защиты и агрессии. Стадия активности сменялась фазой покоя.
Фосфолипазная активность Candida sp. в течение суток
В ходе проведенного исследования выявили, что продукты жизнедеятельности бактерий, характерные для эубиоза кишечника, снижали мезор пролиферативной, морфологической и фосфолипазной активности Сandida sp. в 3,1 - 4,9 раз (р 0,05), амплитуду активности в 3-4 раза (W=-30,0; р 0,05). Под действием супернатантов микробиоты, характерной для дисбиоза, среднесуточные значения, наоборот, повышались в 1,7 раз (р 0,05), амплитуда повышалась в 3 раза (W=24,0; р 0,05). После инкубирования дрожжей с метаболитами бактерий выявлено также перераспределение ритмов. Суперна-танты L. acidophilus, E. coli «lac +» у C. albicans изменяли вклад ритма морфогенеза и фосфолипазной активности с ультрадианного на околосуточный. У C. tropicalis выявлен циркадианный ритм морфологической трансформации после культивирования с супернатантами E. coli «lac +» и E. coli «lac -» (табл. 81-83).
Более чувствительными к действию продуктов жизнедеятельности бактерий были грибы вида C. krusei. У патогенного штамма выявлено наряду с ультрадианными гармониками достоверные циркадианные вклады ритма пролиферативной, фосфолипазной активности под влиянием В. bifidum, L. acidophilus, E. coli «lac +», E. coli «lac -» и морфогенеза после воздействия метаболитов L. acidophilus, E. coli «lac +».
В ряде экспериментов установлено, что метаболиты доминантной мик-робиоты кишечника - В. bifidum не влияли на фазовую стабильность биологических свойств изучаемых видов дрожжей. Сохранялась последовательность и время проявления максимальной активности функций (рис. 81 - 83). Представители ассоциативной нормобиоты - L. acidophilus, E. coli «lac+», напротив, вызывали изменения временной организации биологических свойств Candida sp. Установлена синхронизация физиологических показателей в очень узком временном периоде и отмечены значительные промежутки времени отсутствия активности.
Особенно сильное воздействие на микромицеты оказывали супернатан-ты E. coli «lac +». Они преобразовывали временную организацию C. albicans, C. tropicalis в последовательность, типичную для эталонных, непатогенных штаммов.
Влияние метаболитов бактерий (S. aureus и E. coli «lac-»), характерных для дисбиоза кишечника, отражалось в синхронизации во времени у патогенных культур C. albicans и C. tropicalis активности пролиферации и фосфоли-пазы (r = 0,64; r = 0,57; р 0,05 и r = 0,69; r = 0,62; р 0,05 соответственно), у C. krusei - факторов патогенности (морфогенеза, фосфолипазы – r = 0,59; r = 0, 46; р 0,05) (табл. 84 – 86). Продукты жизнедеятельности E. coli «lac-» вызывали у C. albicans противофазность показателей морфогенеза (смещение максимальной активности с дневного времени на ночные часы).
Таким образом, биологические ритмы являются одним из наиболее общих свойств биологических систем и выражают их существование во времени. Коэффициент корреляции (r) между показателями биологической активности C. albicans под воздействием метаболитов микросимбионтов Показатель Пролиферация Морфогенез Фосфолипаза пролиферация - 0,30 0,66 морфогенез 0,30 - 0,19 фосфолипаза 0,66 0,19 пролиферация - 0,47 0,64 морфогенез 0,47 - 0,65 фосфолипаза 0,64 0,65 пролиферация - 0,78 0,70 морфогенез 0,78 - 0,55 фосфолипаза 0,70 0,55 пролиферация - 0,28 0,64 морфогенез 0,28 - 0,18 фосфолипаза 0,64 0,18 пролиферация - 0,23 0,57 морфогенез 0,23 - 0,88 фосфолипаза 0,57 0,88 Примечание: р 0,05.
Коэффициент корреляции (r) между показателями биологической активности C. tropicalis под воздействием метаболитов микросимбионтов Показатель Пролиферация Морфогенез Фосфолипаза пролиферация - 0,12 0,26 морфогенез 0,12 - 0,78 фосфолипаза 0,26 0,78 пролиферация - 0,67 0,56 морфогенез 0,67 - 0,89 фосфолипаза 0,56 0,89 пролиферация - 0,56 0,56 морфогенез 0,67 - 0,69 фосфолипаза 0,56 0,69 пролиферация - 0,44 0,69 морфогенез 0,44 - 0,34 фосфолипаза 0,69 0,34 пролиферация - 0,09 0,62 морфогенез 0,09 - 0,23 фосфолипаза 0,62 0,23 Примечание: р 0,05.
Коэффициент корреляции (r) между показателями биологической активности C. krusei под воздействием метаболитов микросимбионтов
Влияние экзометаболитов бактерий на временную организацию биологических свойств Сandida sp. определяли после предварительного соинкуби-рования микросимбионтов, характерных для эубиоза и дисбиоза дистального отдела толстого кишечника с супернатантами грибов. Анализ полученного материала выявил способность микроорганизмов в ответ на воздействие метаболитов грибов более выраженно изменять хроноинфраструктуру Сandida sp. Изучение ритмометрических показателей, таких как мезор и амплитуда, показало усиленное ингибирование активности пролиферации, морфогенеза и фосфолипазы у всех видов патогенов под влиянием метаболитов нормальной микробиоты кишечника.
Установлено снижение среднесуточных значений пролиферативной активности у C. albicans в 5,1 раза (W= - 26,0; р 0,05), морфогенеза в 17,1 (W= -18,0; р 0,05), амплитуда уменьшалась в 7,3 раз (табл. 87-89).
