Особенности структурной организации, ионные взаимодействия и физико-химические свойства мембран и планарных биомиметических наносистем Хомутов Геннадий Борисович

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Хомутов Геннадий Борисович. Особенности структурной организации, ионные взаимодействия и физико-химические свойства мембран и планарных биомиметических наносистем : дис. ... д-ра физ.-мат. наук : 03.00.02 Москва, 2006 437 с. РГБ ОД, 71:07-1/154

Содержание к диссертации

Список используемых сокращений 8

Введение. 9

ГЛАВА 1. Связывание ионных компонентов в гетерогенных системах.

Введение 26
Проблемы количественного анализа процессов связывания заряженных компонентов 27
Буферные свойства гомогенных и гетерогенных систем 31

Буферные свойства гомогенной системы 32
Буферные свойства гетерогенной системы 35

Влияние поверхностного электростатического потенциала на буферные свойства поверхности 41
Связь изменений электростатического потенциала и параметров связывания заряженных компонентов в локальной области гетерогенной системы 47
Способ определения величины буферной емкости произвольной локальной области гетерогенной системы 54
Связь буферной емкости и термодинамических характеристик

границы раздела фаз газ-жидкость 60

1.8. Основные результаты и выводы Главы 1 62

ГЛАВА 2. Структурно-функциональные характеристики, поверхностный потенциал, ионные взаимодействия, буферные свойства и протонный транспорт в тилакоидных мембранах хлоропластов.

Введение 64
Структурно-функциональные характеристики тилакоидных мембран хлоропластов и электростатические

эффекты на их поверхности 69

Влияние ионов магния на величину поверхностного потенциала и структурно-функциональные характеристики тилакоидных мембран хлоропластов 72
Влияние ионных детергентов на величину поверхностного

потенциала и структурно-функциональные характеристики
тилакоидных мембран хлоропластов 81

2.3. Структурно-функциональная организация и протонный транспорт

в тилакоидных мембранах хлоропластов 94

2.4. Поверхностный потенциал и буферные свойства тилакоидных

мембран хлоропластов 98

Экспериментальное определение величины буферной емкости наружной поверхности тилакоидной мембраны 106
Фотоиндуцированное поглощение протонов тилакоидами

и фотоиндуцированное изменение величины рН в суспензии
тилакоидных мембран 115

Фотоиндуцированное перераспределение протонов между внешней средой и внутритилакоидным пространством 120
Фотоиндуцированные изменения рН внутритилакоидного пространства и их связь с буферными свойствами тилакоидных

мембран 124

2.9. Основные результаты и выводы Главы 2 131

ГЛАВА 3. Исследование влияния ионного состава водной фазы на структуру и физико-химические свойства ленгмюровских монослоев стеариновой кислоты, стеаратов переходных металлов и соответствующих пленок Ленгмюра-Блоджетт.

Введение 134
Исследование влияния изменений ионного состава водной фазы на форму изотермы сжатия ленгмюровского монослоя стеариновой кислоты на поверхности водной фазы,

содержащей ионы меди(П) 145

3.3. Исследование структуры пленок Ленгмюра-Блоджетт стеарата меди 153

Исследование структуры мультислойных ЛБ пленок стеарата меди методом рентгеновской дифракции 154
Исследование топографии поверхности ЛБ пленок стеарата меди методом СТМ 155

3.4. Исследование влияния изменений ионного состава на спектры ЭПР

водной фазы, содержащей трехвалентные ионы гадолиния 155

3.5. Исследование влияния изменений ионного состава водной фазы
на форму изотермы сжатия ленгмюровского монослоя на
поверхности водной фазы, содержащей трехвалентные

ионы редкоземельных металлов 160

3.6. Исследование структуры и физико-химических свойств пленок
Ленгмюра-Блоджетт стеаратов редкоземельных металлов 172

3.6.1. Исследование топографии поверхности пленок
Ленгмюра-Блоджетт стеаратов редкоземельных
металлов методом сканирующей зондовой микроскопии 172

3.6.2. Исследование структуры мультислойных пленок
Ленгмюра-Блоджетт стеарата гадолиния 186

3.6.2.1. Исследование мультислойных пленок Ленгмюра-Блоджетт
стеарата гадолиния методом ИК спектроскопии 187

3.6.2.2. Исследование структуры мультислойных пленок
Ленгмюра-Блоджетт стеарата гадолиния методом
рентгеновской дифракции 189

3.6.3. Исследование магнитных характеристик мультислойных

пленок Ленгмюра-Блоджетт стеарата гадолиния 204

3.7. Основные результаты и выводы Главы 3 209

ГЛАВА 4. Получение и исследование структуры и физико-химических свойств планарных биомиметических наносистем на основе ленгмюровских монослоев и пленок Ленгмюра-Блоджетт.

Введение 211
Исследование влияния биологически-активных веществ на характеристики изотермы сжатия Ленгмюровского монослоя стеариновой кислоты 213

Исследование влияния клонидина и гуанфацина на характеристики изотермы сжатия ленгмюровского монослоя стеариновой кислоты 214
Исследование влияния аламетицина на характеристики изотермы сжатия ленгмюровского монослоя стеариновой

кислоты 217

4.2.3. Исследование влияния фуросемида и DIDS на

характеристики изотермы сжатия ленгмюровского монослоя
стеариновой кислоты 221

Получение и исследование методом СТМ монослойных пленок Ленгмюра-Блоджетт, содержащих молекулы цитохрома с 226
Получение и исследование супрамолекулярных тонкопленочных структур на основе комплекса полианион/катионы редкоземельного металла/стеариновая кислота 234

4.4.1. Исследование изменений изотерм сжатия ленгмюровского монослоя

на поверхности раствора соли редкоземельного катиона и
полианиона 235

4.4.2. Исследование тонкопленочных структур на основе комплекса
полианион/катионы редкоземельного металла/стеариновая кислота
методом инфракрасной спектроскопии 237

4.4.3. Исследование тонкопленочных структур на основе комплекса

полианион/катионы редкоземельного металла/стеариновая кислота
методом рентгеновской дифракции 239

4.4.4. Исследование тонкопленочных структур на основе комплекса
полианион/катионы редкоземельного металла/стеариновая кислота
методом атомной силовой микроскопии 241

4.5. Основные результаты и выводы Главы 4 243

ГЛАВА 5. Получение и исследование структуры и физико-химических свойств мембранных структур и наносистем на основе полиэлектролитных комплексов.

Введение 245
Получение методом послойной чередующейся адсорбции и исследование тонкопленочных материалов на основе комплексов катионов редкоземельных металлов и полиэлектролитов 248

Получение и исследование планарных комплексов катионов редкоземельных металлов и полиэлектролитов на поверхности твердотельных подложек 251
Получение и исследование комплексов катионов

редкоземельных металлов и полиэлектролитов в составе

коллоидных микрокапсул 255

Получение и исследование иммобилизованных на подложках комплексов полиэлектролитов и амфифильных соединений 266
Получение и исследование ленгмюровских монослоев и пленок Ленгмюра-Блоджетт водонерастворимых амфифильных поликатионов 275
Исследование взаимодействия ДНК с монослоями

амфифильных моно- и поликатионов 281

Исследование изменений изотерм сжатия Ленгмюровских монослоев амфифильных моно- и поликатионов при взаимодействии с ДНК водной фазы 284
Исследование структуры моно- и мультислойных пленок Ленгмюра-Блоджетт на основе комплексов ДНК и амфифильных моно- и поликатионов 287

5.6. Получение и исследование структурно-функциональных
характеристик комплексов тилакоидов и полиэлектролитов 298

Получение комплексов тилакоидов и полиэлектролитов и исследование их морфологии методом сканирующей электронной микроскопии 299
Исследование кинетики светоиндуцированных изменений

сигнала ЭПР Р700 в комплексах тилакоид/полиэлектролит 302

5.6.3. Исследование структуры и электростатических
характеристик тилакоидных мембран в составе

комплекса тилакоид/полиэлектролит 305

5.7. Исследование изменений структуры мембран липосом

при их взаимодействии с полиэлектролитами 310

5.8. Основные результаты и выводы Главы 5 318

ГЛАВА 6. Методическая часть.

Материалы и реактивы 321
Получение тилакоидных мембран хлоропластов 323
Получение липосом 323

6.4. Методы формирования и исследования монослоев
амфифильных соединений на границе раздела фаз газ/водная фаза,

а также получения соответствующих моно- и мультислойных пленок
Ленгмюра-Блоджетт 324

Ленгмюровская ванна 326
Изотермы сжатия монослоя 329
Формирование моно- и мультислойных пленок Ленгмюра-Блоджетт на твердотельных подложках 331

6.5. Формирование тонкопленочных структур методом чередующейся
послойной адсорбции компонентов водной фазы 334

6.5.1. Формирование тонкопленочных структур на поверхности

макроскопических твердотельных подложек 336

6.5.1.1. Формирование комплексов тилакоид/полиэлектролит 336

6.5.2. Формирование тонкопленочных оболочек на поверхности коллоидных
частиц. Полые микрокапсулы 337

6.7. Методы исследования структуры и физико-химических
свойств мембранных и молекулярных планарных структур,
использованные в работе 339

6.7.1. ЭПР-спектроскопия 339

6.7.1.1. Исследование структуры и электростатических свойств

поверхности мембран с использованием спиновых зондов...340

Дифракция рентгеновских лучей 352
Сканирующая зондовая микроскопия 354

Сканирующая туннельная микроскопия 354
Атомно-силовая микроскопия 355

Сканирующая электронная микроскопия 356
ИК-спектроскопия 357

6.8. Потенциометрическое титрование и определение буферной емкости 358

Основные результаты и выводы 360

Литература 364

Список используемых сокращений

АСМ — атомно-силовая микроскопия (атомно-силовой микроскоп)

ВАХ — вольт-амперная характеристика

ВОПГ — высокоориентированный пиролитический графит

ИК — инфракрасный

ЛБ — Ленгмюра-Блоджетт

ОДА — окталециламин

ПАА — полиаллиламин

ПАВ — поверхностно-активное вещество

ПВП - поливинилпиридин

ПСС — полистиролсульфонат

ПЭИ— полиэтиленимин

СТМ — сканирующая туннельная микроскопия (сканирующий туннельный микроскоп)

СЭМ — сканирующая электронная микроскопия

УФ — ультрафиолетовый

ЭПР — электронный парамагнитный резонанс

ФМР — ферромагнитный резонанс

ФСІ — фотосистема 1

ФСП — фотосистема 2

ЦТАБ — цетилтриметиламмоний бромид

Введение к работе

Постановка проблемы, ее актуальность

Изучение физико-химических механизмов процессов структурной организации и трансформации, а также взаимосвязи структуры, свойств и функций в биологических системах на разных уровнях их организации от молекулярного и супрамолекулярного (нано-уровня) до клеточного и более высоких уровней является одной из важнейших проблем современной биологической физики и ряда смежных областей науки. Ее решение важно для понимания фундаментальных механизмов процессов формирования и функционирования биологических систем, а также для разработки эффективных подходов к управлению этими процессами и методов целенаправленного изменения структурно-функциональных характеристик биологических систем, необходимых для успешного решения большого числа практических задач в медицине, биоинженерии, биотехнологии и молекулярной нанотехнологии.

Исследования фундаментальных механизмов функционирования биомембран, принципов структурообразования и физико-химических свойств мембранных систем относятся к важнейшим задачам современной биофизики. Значительный прогресс в последние годы был достигнут в изучении структурной организации и физико-химических свойств мембран большинства биологических и модельных систем, выяснена структура важнейших мембранных макромолекул и надмолекулярных комплексов, обеспечивающих функционирование биомембран и протекание в них процессов электронного и ионного транспорта, преобразования световой энергии и синтеза АТФ [6, 10, 28, 31, 32, 39, 68, 69, 86, 87, 96, 118, 121, 125, 132, 149, 166, 230, 261, 274, 275, 428, 588, 705, 791]. Мембранные системы являются гетерогенными и в определенных условиях неравновесными системами, при этом их гетерогенность обусловлена как наличием пространственно-выделенных компартментов и границ раздела (поверхностей мембран), так и гетерогенной структурой самих мембран, обусловленной их сложным составом и строением. Учитывая характерную толщину (нанометры) и гетерогенность строения биологических мембран они могут рассматриваться как биологические наносистемы. Ключевой проблемой в выяснении механизмов протекания и регуляции различных процессов в мембранах и в построении полной физико-химической картины функционирования мембранных систем становится изучение ультраструктуры и физико-химических свойств локальных областей биомембран и их поверхности, определение локальных концентраций компонентов водной фазы в примембранных областях и их изменений в ходе различных мембранных процессов, исследование механизмов процессов и взаимодействий на границе раздела фаз в сложных многокомпонентных мембранных структурах, поскольку именно физические и химические параметры характерных локальных областей мембранных систем и соответствующие локальные активности реагентов определяют протекание мембранных реакций и функционирование мембранных энергопреобразующих и транспортных систем. Водные суспензии биологических и модельных мембранных структур - существенно гетерогенные системы, в которых концентрации заряженных компонентов (молекул и ионов) могут быть неодинаковы в различных локальных областях вследствие неодинаковой величины электростатического потенциала в равновесии в различных локальных областях суспензии (наличие поверхностных и локальных потенциалов), а также вследствие процессов активного транспорта, нарушающих химическое равновесие между различными локальными областями системы. В биологических и модельных мембранных системах наблюдаются эффекты изменения величины поверхностного потенциала и локальной концентрации протонов в примембранных слоях в ходе процессов энергизации мембран митохондрий [661], тилакоидных мембран хлоропластов [662], мембран бактерий [297] и ионного транспорта [8, 171]. Количественный анализ перераспределения ионов в процессах активного транспорта в мембранных системах требует учета взаимодействия ионов с акцепторными группами мембран и водной фазы в различных локальных областях системы. В связи с этим актуальным является разработка подходов к избирательному исследованию параметров связывания ионных компонентов в локальных областях гетерогенной системы - суспензии мембранных структур. В данной работе такой подход был разработан и использован для количественного описания фотоиндуцированного перераспределения протонов в тилакоидных мембранах хлоропластов.

Электростатические взаимодействия являются физическими взаимодействиями, играющими принципиально-важную роль в процессах с участием ионных компонентов в различных системах, включая биологические и химические системы [429]. Водная фаза всегда содержит ионы. Ионные взаимодействия с участием протонов, гидроксид-анионов и катионов металлов имеют место и играют важную роль в различных системах, включая биологические. Девять металлов (натрий, калий, магний, кальций, марганец, железо, медь, цинк, молибден) являются необходимыми для жизнедеятельности и присутствуют в биологических системах в катионной форме [27, 145, 163, 168, 439, 571, 603]. Большинство остальных металлов, особенно тяжелые металлы, являются абиогенными и зачастую токсичными. В течение уже довольно длительного времени изучение физико-химических механизмов взаимодействия катионов металлов и других ионных компонентов водной фазы с биологическими и модельными мембранными и планарными системами является интенсивно развивающейся областью биофизики мембран и ряда смежных областей. Активно исследуются трансмембранные градиенты концентраций ионов, активный и пассивный транспорт, адсорбция и специфическое связывание, электростатические взаимодействия, окислительно-восстановительные реакции [8, 9, 87, 148, 149]. Взаимодействие ионов с заряженными поверхностями мембранных структур можно в первом приближении рассматривать состоящим из двух частей, представляющих собой дальнодействующее кулоновское электростатическое взаимодействие ионов водной фазы с заряженной поверхностью и короткодействующие силы адсорбции (химическое связывание ионов с поверхностными группами мембраны). Присутствие протонов и катионов металлов в водной фазе влияет на структуру, физико-химические свойства, фазовые состояния мембран, является фактором регуляции различных функционально-важных процессов в биомембранах [132, 241, 309]. К настоящему времени достигнут существенный прогресс в экспериментальном изучении и теоретическом описании процессов с участием ионов, заряженных молекул и коллоидных частиц в системах, имеющих заряженные поверхности, таких как биологические и модельные мембраны [3, 97, 254, 263, 309, 328, 394, 506, 559], ленгмюровские монослои [187, 268, 542], коллоидные [49, 50, 81] и полимерные, в частности, полиэлектролитные системы [49, 333, 814, 815]. Главные нерешенные проблемы в этих областях связаны с тем, что особенности состава и структурной организации таких систем являются важным фактором, определяющим их локальные электростатические характеристики и специфику их ионных взаимодействий, которые, в зависимости от природы взаимодействующих ионных компонентов, могут влиять на результирующую структуру и физико-химические свойства таких систем. В связи с этим, актуальным является исследование взаимосвязи структурной организации, ионных взаимодействий и физико-химических свойств в биологических и модельных мембранах, а также в планарных биомиметических системах.

Существенный интерес представляет изучение особенностей взаимодействия катионов редкоземельных металлов с различными биологическими и модельными системами. Несмотря на то, что лантаноиды являются абиогенными металлами, благодаря своим уникальным оптическим и магнитным свойствам они находят применение в биологии и медицине в качестве диагностических средств: катионы европия успешно используются как флуоресцентные зонды, катионы гадолиния применяют в качестве контрастных агентов при магнитно-резонансных и рентгеновских исследованиях [354, 453]. Лантаноиды известны также как блокаторы механочувствительных каналов, определяющих осмотическую устойчивость клеток и поддержание тонуса стенок кровеносных сосудов [354, 634]. Редкоземельные катионы могут образовывать устойчивые комплексы со многими биогенными молекулярными лигандами и группами, что делает актуальным исследование особенностей структурной организации и свойств биологических и биомиметических систем, содержащих эти катионы.

Ленгмюровские монослои амфифильных молекул на поверхности водной фазы являются планарными макроскопическими объектами, широко-используемыми для экспериментального моделирования поверхности мембран и исследования механизмов процессов на границе раздела фаз в организованных молекулярных системах, в частности, взаимодействия молекулярных поверхностей с ионами и биологически-активными молекулами водной фазы. Несмотря на большое количество работ, посвященных исследованию ленгмюровских монослоев и мультислойных пленок Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) (см., например, [3, 29, 92, 258,

367, 368, 510, 514, 520,557, 632]), нерешенной являлась проблема воспроизводимого получения высокоупорядоченных мультислойных ЛБ пленок, содержащих трехвалентные катионы, в частности, катионы редкоземельных металлов. Решение этой проблемы актуально для создания новых планарных наносистем на основе редкоземельных металлов, обладающих магнитными и оптическими свойствами, интересными с фундаментальной точки зрения и важными для практических применений. Мономолекулярный слой может быть перенесен с поверхности жидкости на различные твердотельные подложки, что открывает возможности для формирования организованных монослойных и мультислойных планарных структур на различных поверхностях [29, 633]. Потенциальные возможности целенаправленно изменять в широких пределах структуру и состав ЛБ пленок и создавать на их основе многокомпонентные упорядоченные планарные функциональные наносистемы, включающие различные структурные и функциональные наноразмерные компоненты, такие, как липиды, ансамбли белков, полимерные комплексы, молекулы ДНК, неорганические молекулярные кластеры, наночастицы, и низкоразмерные наноструктуры, открывают большие перспективы для их использования в нанотехнологических разработках, поскольку планарный характер ЛБ пленок обусловливает их совместимость с современными и будущими планарными технологиями.

Для биологических систем характерны процессы формирования высокоорганизованных молекулярных, сложных супрамолекулярных и бионеорганических структур (в том числе структур нанометровых размеров, т.е. наноструктур), отличающихся структурным совершенством и исключительно высокой функциональной эффективностью. При этом, синтетические процессы формирования этих структур в биологических системах протекают при нормальных условиях и абсолютно экологичны. В связи с этим, актуальным для нанотехнологии является разработка синтетических методов, использующих ионные взаимодействия структурных и функциональных компонентов в водной фазе и на границах раздела фаз, принципы биоминерализации, самосборки и самоорганизации. Также, специфичность и уникальность свойств многих биологических молекул, в частности, биополимеров, делает их перспективными для создания новых высокоорганизованных функциональных гибридных био- органических и био-неорганических наносистем. Биомиметические и гибридные наноматериалы и наносистемы, включающие биологические и синтетические компоненты, представляют большой интерес, поскольку целенаправленное сочетание и определенная пространственная организация на нано-уровне различных по своей природе нано-компонентов открывают широкие возможности для дизайна и получения новых материалов со структурно-функциональными характеристиками, важными для различных практических применений. Особый интерес в этих исследованиях представляет изучение процессов формирования структурно-упорядоченных биомиметических и гибридных молекулярных наносистем, поскольку способствует выяснению физико-химических механизмов процессов самоорганизации и самосборки на нано-уровне в различных системах, включая биологические. Таким образом, исследование взаимосвязи специфических структурных особенностей различных модельных и синтетических биомиметических систем с их физико-химическими свойствами и ионными взаимодействиями, влияющими на структуру таких систем, является актуальным и важным для решения вышеупомянутой фундаментальной проблемы биофизики -выяснению взаимосвязи структуры, свойств и функций в биологических системах.

Важнейшая биологическая молекула - ДНК - и процессы с ее участием являются предметом интенсивных и весьма плодотворных исследований уже на протяжении нескольких десятилетий. Исследование процессов структурообразования, в которых участвуют молекулы нуклеиновых кислот, представляется важным в связи с тем, что эти молекулы помимо биологической функции хранения и передачи наследственной информации обладают уникальной структурой, характеризуются механической прочностью и физико-химической стабильностью, и поэтому являются перспективными для создания на их основе структурных и функциональных элементов новых устройств и наноматериалов для нанобиотехнологии. Изучение процессов формирования супрамолекулярных структур на основе комплексов ДНК с катионными соединениями различной природы актуально в настоящее время с практической точки зрения, поскольку может способствовать разработке новых невирусных химических переносчиков для эффективного направленного транспорта нуклеиновых кислот через биологические мембраны и новых организованных наноструктур, которые могут найти применение в генной терапии, биоинженерии и нанобиотехнологии [54, 491, 601, 827].

В связи с тенденциями развития современной науки и технологий нам представлялось важным и своевременным использование результатов и методов фундаментальных биофизических исследований структурной организации, физико-химических свойств и механизмов функционирования биологических и модельных мембранных и планарных биомиметических систем для разработки эффективных синтетических подходов к получению новых перспективных наноматериалов и организованных функциональных молекулярных и гибридных наноструктур, включающих биологические, амфифильные, полимерные и неорганические компоненты, в том числе наноструктур, характеризующихся рекордными или уникальными структурными и/или функциональными характеристиками. Актуальным направлением исследований, для развития которых использование таких био-физико-химических подходов представляется эффективным, являются работы по созданию новых наноэлектронных систем высокотемпературного одноэлектронного туннельного транспорта [490]. В рамках данной работы такие системы реализовывались с использованием планарных биомиметических систем, организованных по принципу «белок-переносчик в мембране» и представляющих собой пленки Ленгмюра-Блоджетт, содержащие встроенные в структуру пленки упорядоченные ансамбли белков (цитохром с). Другим направлением, представляющим большой интерес как с фундаментальной, так и с практической точки зрения, является получение и исследование физико-химических свойств различных организованных низкоразмерных наноструктур (слоев, в том числе двумерных магнетиков на основе планарных ансамблей катионов редкоземельных металлов, квази-одномерных структур, квантовых точек). Актуальным и практически важным направлением является также получение и исследование организованных наноструктур на основе полимеров, в том числе предельно тонких (мономолекулярных) и мультислойных полимерных и нанокомпозитных пленок и покрытий, в том числе включающих функциональные компоненты различной природы. Разработка эффективных синтетических био-физико-химических подходов, способствующих прогрессу в этих областях, также являлась мотивацией данной работы.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является изучение взаимосвязи структурных характеристик, ионных взаимодействий и физико-химических свойств в биологических мембранах и модельных биомиметических наносистемах.

Для достижения цели в диссертации решались следующие задачи; - построить модель для количественного физико-химического описания связывания ионных компонентов в гетерогенной системе и теоретически обосновать метод избирательного количественного определения параметров связывания ионов в произвольной локальной области гетерогенной системы в условиях быстрого установления ионного равновесия между ее различными областями; - экспериментально разработать метод избирательного определения параметров связывания ионов в локальных областях гетерогенной системы (суспензии мембран) в условиях быстрого установления ионного равновесия между различными ее областями и применить его для количественного исследования локальных буферных свойств поверхности и внутренних областей тилакоидных мембран хлоропластов; экспериментально исследовать фотоиндуцированные изменения локальных концентраций протонов в тилакоидных мембранах хлоропластов и количественно описать фотоиндуцированное поглощение протонов хлоропластами; экспериментально исследовать влияние катионов двух- и трехвалентных металлов (Cu²⁺, Но³⁺, Gd³⁺), одновалентного электролита (NaCl) и ряда биологически-активных соединений на термодинамические характеристики ленгмюровских монослоев на поверхности водной фазы и на структурные характеристики мультислойных пленок Ленгмюра-Блоджетт; разработать экспериментальные методики и получить новые высокоупорядоченные планарные биомиметические наносистемы, включающие биологические, амфифильные, полимерные и неорганические компоненты, в том числе упорядоченные ансамбли белков (цитохром с), двухмерные магнитные системы на основе пленок Ленгмюра-Блоджетт стеарата гадолиния, полиэлектролитные комплексы с катионами редкоземельных металлов (Gd³⁺, Ег³⁺, Tb³⁺, Nd³⁺), амфифильными соединениями, мембранами тилакоидов и липосом; - провести исследование структуры, состава и физико-химических свойств получаемых мембранных структур и тонкопленочных планарных биомиметических наносистем.

В качестве основных объектов исследования в работе выбраны: гетерогенные системы, имеющие поверхности, контактирующие с водной фазой, и взаимодействующие с ионными компонентами водной фазы энергопреобразующие тилакоидные мембраны хлоропластов высших растений, липосомы, ленгмюровские монослои и пленки Ленгмюра-Блоджетт, полиэлектролитные комплексы; в качестве ионных компонентов исследовались протоны, компоненты растворов различных солей катионов металлов (Na⁺, Cu²⁺, Gd³⁺, Но³⁺, Er³"¹", Tb³⁺, Nd³⁺), природные (ДНК) и синтетические полиэлектролиты различного состава. Компонентами биомиметических наносистем были молекулы цитохрома с и ряд лекарственных и биологически-активных соединений.

Методы исследования включали ЭПР-спектроскопию, метод спиновых зондов, дифракцию рентгеновских лучей, электронографию, сканирующую туннельную микроскопию, атомно-силовую микроскопию, сканирующую электронную микроскопию, спектроскопию в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной области, потенциометрическое титрование и электродную рН-метрию, стандартные методики получения ленгмюровских монослоев и ЛБ пленок, метод послойной чередующейся адсорбции противоположно заряженных компонентов водной фазы.

Достоверность полученных результатов исследований и обоснованность научных положений, выводов и рекомендаций работы подтверждается воспроизводимостью результатов экспериментов; согласием полученных экспериментальных данных с результатами теоретических расчетов, а также согласием с существующими теоретическими представлениями и моделями; согласием результатов, полученных независимыми экспериментальными методами, а также согласием полученных результатов с известными литературными данными.

Научная новизна

В диссертационной работе получен ряд новых результатов, имеющих существенное значение для биофизики мембран и устанавливающих связь между особенностями структурной организации, составом, физико-химическими характеристиками и ионными взаимодействиями на границе раздела фаз в мембранах и планарных биомиметических наносистемах. Развитые в работе подходы и полученные результаты способствуют более глубокому пониманию механизмов процессов структурообразования и их регуляции в сложных мембранных системах и планарных биомиметических наносистемах, включающих биологические, амфифильные и полимерные компоненты. Результатом проведенного в диссертационной работе комплексного теоретического и экспериментального исследования физико-химических свойств и структурно-функциональных взаимосвязей в биологических и модельных мембранах, пленках Ленгмюра-Блоджетт и комплексах ДНК явилось формирование нового био-физико-химического подхода к созданию организованных функциональных наносистем.

В работе исследована проблема количественного описания перераспределения ионных компонентов между локальными областями гетерогенных мембранных структур. Впервые предложен физико-химический подход к количественному анализу связывания ионных компонентов в гетерогенных системах, в которых концентрации ионных компонентов различны и параметры, определяющие их связывание, неодинаковы в различных локальных областях системы.

Впервые теоретически и экспериментально разработан подход к избирательному количественному определению параметров связывания ионных компонентов отдельно в произвольной локальной области гетерогенной системы в условиях быстрого установления ионного равновесия между ее различными локальными областями, основанный на измерении изменений концентрации соответствующего заряженного компонента в объемной фазе системы в условиях изменения величины электростатического потенциала в исследуемой локальной области системы. Определены оптимальные условия применения такого метода для получения информации о величине буферной емкости наружной поверхности тилакоидных мембран хлоропластов, которая была нами впервые измерена и составила 80±5 моль/моль Р700 при рН = 8.

Проведено комплексное исследование взаимодействия одно- двух- и трехвалентных катионов металлов и ряда биологически-активных соединений с ленгмюровским монослоем стеариновой кислоты, а также структуры и физико- химических свойств соответствующих моно- и мультислойных пленок Ленгмюра-Блоджетт. Впервые получены мультислойные ЛБ пленки стеарата гадолиния с высокой степенью структурного совершенства, определяемой по параметрам рентгеновской дифракции, и макроскопически планарной поверхностью с неровностями, не превышающими 1 нм на расстояниях ~ 1 |ям. В результате, создан новый квази-двухмерный магнитный материал на основе высокоорганизованных гадолиний-содержащих ЛБ пленок, в котором слои магнитных атомов имеют толщину, соответствующую моноатомному слою.

Впервые получены (с использованием Ленгмюровской технологии) и исследованы супрамолекулярные структуры, обраованные полианионом, катионом редкоземельного металла (Gd³⁺) и анионным поверхностно-активным веществом (стеариновой кислотой). Впервые показана возможность получения методом послойной чередующейся адсорбции противоположно заряженных компонентов новых тонкопленочных комплексов полианионов (полистиролсульфонат, ДНК) и катионов редкоземельных металлов (Gd⁺, Nd³⁺, Er³⁺, Tb³⁺) в виде пленок на твердотельных подложках и коллоидных микрокапсул, исследованы их структура и физико-химические свойства. Впервые получены планарные биомиметические и гибридные наносистемы, включающие амфифильные молекулы, ансамбли белков (цитохром с), планарные полимерные комплексы, молекулы ДНК, в которых обнаружено формирование организованных низкоразмерных наноструктур.

Исследовано формирование комплексов полиэлектролитов с тилакоидньши мембранами хлоропластов, липосомами, ленгмюровскими монослоями. Впервые получены и охарактеризованы новые гибридные супрамолекулярные структуры, включающие биологические компоненты и синтетические полимеры - комплексы, образованные тилакоидньши мембранами хлоропластов и полиэлектролитами. Методом последовательной послойной чередующейся адсорбции противоположно заряженных компонентов впервые получены иммобилизованные комплексы тилакоид/полиэлектролит на поверхности твердотельной подложки. Показано, что в пределах точности эксперимента не наблюдается существенного влияния поликатиона на электронный транспорт в мембранах хлоропластов и на структурные характеристики мембран, что открывает возможности для создания функциональных гибридных систем, включающих биологические фотосинтезирующие органеллы и синтетические полимерные молекулы.

Впервые синтезированы и изучены комплексы ДНК с ленгмюровскими монослоями, образованными молекулами амфифильного водонерастворимого поликатиона (производное поливинилпиридина) на поверхности водного раствора нативной ДНК низкой ионной силы. Наряду с индивидуальными квази-линейными молекулами ДНК в структурах комплексов обнаружены характерные тороидальные структуры, а также новые планарные протяженные сетевидные структуры.

Практическое значение результатов работы

Полученные в работе результаты вносят значительный вклад в существующие представления о связи структуры и физико-химических свойств биологических мембран и планарных молекулярных наносистем и могут использоваться в фундаментальных и прикладных биофизических исследованиях мембран. Развитые в работе экспериментальные и методические подходы, основанные на комплексном использовании ряда молекулярных зондов, могут найти практическое применение в лабораториях биологического и медицинского профиля и оказаться весьма полезными в прикладных работах, связанных с детальными исследованиями физико-химических свойств конкретных биологических мембранных структур и их изменений под действием факторов внешней среды и в ходе патологических процессов. Практическое значение для медицинских разработок имеет реализованная в работе возможность тестирования и анализа неспецифического взаимодействия фармакологических и биологически-активных веществ с мембранами с помощью анализа их взаимодействия с модельными ленгмюровскими монослоями. Такой подход позволяет моделировать и выявлять особенности взаимодействия биологически-активных веществ с мембранными структурами и может быть перспективным для выяснения механизмов их функционального действия, а также выявления и прогнозирования их неспецифического воздействия на биологические мембраны.

Полученные в работе результаты заложили основу базовых знаний и экспериментальных методов, которые могут обеспечить возможности для дальнейшего успешного продвижения в области разработки новых функциональных молекулярных наноматериалов и организованных низкоразмерных наносистем. Важными для практической разработки технологических основ создания новых перспективных наноструктурированных материалов являются результаты проведенных в диссертационной работе исследований высокоупорядоченных пленок Ленгмюра-Блоджетт, содержащих двухмерные ансамбли белков, ионов гадолиния, новых комплексов ДНК, комплексов полиэлектролитов с катионами редкоземельных металлов, а также с тилакоидными мембранами хлоропластов. Результаты работы могут быть полезны для разработки физико-химических основ перспективных методов молекулярной нанотехнологии, обеспечивающих экономически эффективное и экологически приемлемое получение новых функциональных наноструктурированных материалов с использованием управляемых процессов синтеза и сборки организованных органических, органико-неорганических и био-органических наносистем, в том числе тонкопленочных и нанокомпозитных материалов, перспективных для создания оптоэлектронных систем, оптических и нелинейно-оптических устройств, для химических технологий, для сенсорных, биоэлектронных, биомедицинских и биотехнологических систем. Разработанные в диссертации методы позволяют получать предельно тонкие и при этом высокоорганизованные и стабильные полимерные и композитные наноструктуры, что открывает возможности для включения в арсенал нанотехнологических разработок полимерных материалов, являющихся основой многих современных промышленных продуктов и технологий и обладающих многими практически полезными свойствами. Результаты работы способствуют развитию ряда технологий, включенных в перечень критических технологий Российской федерации, среди которых, в частности, генотерапия, мембранные технологии, полимеры и композиты. Результаты работы могут быть полезны и уже используются на ряде кафедр физического и химического факультетов МГУ, в Институте биофизики РАН, Институте кристаллографии РАН и др.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Параметры связывания заряженных компонентов (ионов, молекул, коллоидных частиц) в произвольной локальной области гетерогенной системы, характеризующейся быстрым установлением равновесия между ее локальными областями, в которых равновесные и/или стационарные концентрации заряженных компонентов различны и параметры, определяющие их равновесное связывание, неодинаковы, могут быть количественно определены путем измерения изменений концентрации соответствующего заряженного компонента в объемной фазе системы в условиях изменения величины электростатического потенциала в исследуемой локальной области системы. В свою очередь, изменения величины электростатического потенциала локальной области гетерогенной системы зависят от параметров связывания заряженных компонентов в данной локальной области.

Установлено, что величина буферной емкости наружной поверхности тилакоидной мембраны хлоропластов, определенная экспериментально с использованием модификаторов поверхностного потенциала наружной поверхности мембраны, равна 80+5 моль/мольР700хрН при рН=8,0 и составляет примерно половину полной буферной емкости мембран хлоропластов. Количество протонов, поглощаемых на свету тилакоидами при рН=8,0 составляет 50±4 Н⁺/Р700. Протон-акцепторные группы тилакоидных мембран являются гетерогенной системой. Значительная часть буферной емкости тилакоидов (примерно 50 %) обусловлена протон-акцепторными группами, которые не вносят вклад в буферную емкость наружной поверхности тилакоидной мембраны, и при этом не находятся в непосредственном равновесии с протонами, попадающими при освещении хлоропластов в водную фазу внутритилакоидного пространства.

Оптимизация ионного состава водной фазы, содержащей соединения гадолиния, позволяет получать мультислоиные пленки Ленгмюра-Блоджетт стеарата гадолиния с высокой степенью структурного совершенства и макроскопически планарной поверхностью с неровностями, не превышающими 1 нм на расстояниях ~ 1 цм, обладающие свойствами двухмерных магнетиков.

Ряд лекарственных и биологически-активных соединений (ингибиторы анионного транспорта в эритроцитах фуросемид и DIDS, каналоформер аламетицин, нейропептиды гуанфацин и клонидин) обладает амфифильными свойствами. Присутствие этих соединений в водной фазе в концентрациях выше 10' ⁴ М вызывает характерные изменения формы изотерм сжатия Ленгмюровского монослоя стеариновой кислоты, зависящие от рН и ионного состава водной фазы.

В пленарных биомиметических и гибридных наносистемах, включающих амфифильные молекулы, катионы редкоземельных металлов, полиэлектролитные комплексы, молекулы ДНК, ансамбли белков (цитохром с), происходит формирование упорядоченных низкоразмерных наноструктур.

В определенных условиях происходит формирование комплексов полиэлектролитов с тилакоидными мембранами хлоропластов и липосомами. Получены комплексы тилакоид/полиэлектролит в объемной водной фазе и иммобилизованные комплексы на поверхности твердотельной подложки. При этом, не наблюдается существенного влияния поликатиона на фотоиндуцированный электронный транспорт в тилакоидных мембранах хлоропластов и на структурные характеристики этих мембран вплоть до концентраций полиэлектролита 10³ М (в расчете на мономер).

С использованием метода Ленгмюра-Блоджетт и метода послойной чередующейся адсорбции противоположно заряженных компонентов получены и охарактеризованы новые тонкопленочные структуры на основе полиэлектролитных комплексов, включающих полианионы, катионы редкоземельных металлов (Gd³⁺, Nd³⁺, Er³⁺, Tb³⁺), анионные амфифильные соединения в виде пленок на твердотельных подложках и коллоидных микрокапсул.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на II и III Всесоюзных симпозиумах "Липиды биологических мембран" (Ташкент 1980, Пущино 1984); Всесоюзных и Российских конференциях "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка 1981, Звенигород 1983, 1985, 1989, 1990, Суздаль 1998); Ломоносовских чтениях МГУ (Москва 1981, 1993, 1998, 2001); III Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси 1981); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва 1982); Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка 1982); III Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Ташкент 1983); 16 и 22 конференциях Федерации Европейских биохимических обществ (FEBS) (Москва 1984, Стокгольм (Швеция) 1993); XII Всесоюзном совещании по транспортным АТФазам "Ионный гомеостаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки" (Иркутск 1987); V Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси 1987); 21-м Иерусалимском международном симпозиуме по квантовой химии и биохимии "Транспорт через мембраны: переносчики, каналы и помпы" (Иерусалим (Израиль) 1988); Гордоновской международной конференции "Протоны и мембранные реакции" (Вентура (США) 1988); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва 1989); Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" (Пущино 1989); Международном симпозиуме "Биомолекулярная инженерия" (Москва 1991); Пущинских чтениях по фотосинтезу и конференции стран СНГ "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделей" (Пущино 1993); 5 Международном Симпозиуме по молекулярным аспектам хемотерапии (Гданьск (Польша) 1995); VI, VII, VIII, IX Международных конференциях "Упорядоченные молекулярные пленки" (LB6 - Труа-Ривьер (Канада) 1993, LB7 - Анкона (Италия) 1995, LB8 - Асиломар (США) 1997, LB9 -Потсдам (Германия) 2000); 3-й и 4-й Европейских конференциях по молекулярной электронике (Левен (Голландия) 1996, Кэмбридж (Великобритания) 1997); I, II, III и IV Международных конференциях "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии", (С.-Петербург 1996, 1998, 2001, 2004); VII Международной конференции "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах" (Иваново 1998); 6-й, 7-й и 8-й Европейских конференциях по тонким организованным пленкам (ECOF6 - Шэффилд (Великобритания) 1996, ECOF7 -Потсдам (Германия) 1998, ECOF8 - Отранто (Италия) 2001); Симпозиумах Materials Research Society (USA) (Сан-Франциско 1997, 1999, 2000, 2005, Бостон 2000, 2003); II Всероссийской научной конференции "Физические проблемы экологии (Физическая экология)" (Москва 1999); II и III съездах биофизиков России (Москва 1999, Воронеж 2004); Московском международном симпозиуме по магнетизму MISM'99 (Москва 1999); XVI, XVII и XVIII Международных симпозиумах по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Братислава (Словакия) 2001, Флоренция (Италия) 2003, Coimbra (Португалия) 2005); Девятой конференции по молекулярной нанотехнологии (Санта-Клара (США) 2001); 1-м Евразийском конгрессе по Медицинской физике (Москва 2001); Пятом семинаре ISTC Scientific Advisory Committee "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology" (Санкт-Петербург 2002); 7-th International Conference on nanometer-scale science and technology (NANO-7) и 21-st European conference on surface science (EC0SS-21) (Мальмо (Швеция) 2002); XVI и XVII European Chemistry at Interfaces Conference (Владимир 2003, Loughborough (UK) 2005); 4-th International Conference on Intelligent Processing and Manufacturing of Materials (Sendai (Япония) 2003); Симпозиумах Европейского общества исследователей материалов (E-MRS) (Страсбург (Франция) 2003, 2005); Международной конференции по наноматериалам и нанотехнологиям (Крит (Греция) 2003); 22-й Европейской конференции по изучению поверхностей (Прага (Чехия) 2003); первом международном симпозиуме по прикладной физике (APHYS-2003) (Badajoz (Испания) 2003); 2-м Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва 2003); 7-th International Conference on Atomically Controlled Surfaces, Interfaces and Nanostructures (ACSIN-2003) (Nara (Япония) 2003); Всероссийской конференции по сканирующей зондовой микроскопии (Н.Новгород 2003); IV Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва 2003); The 8th International Conference on Nanometer-scale Science and Technology (NANO-8) (Venice (Италия) 2004); ІІ-м Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2005», (Москва 2005); Европейском полимерном конгрессе (Москва 2005); 13-th International Congress on Thin Films/8-th International Conference on Atomically Controlled Surfaces, Interfaces and Nanostructures (ICTF13/ACSIN8) (Стокгольм (Швеция) 2005); Конференции по нанотехнологии Nanotech-2005 (Anaheim (США) 2005); 5-й Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем (Москва 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано ПО печатных работ, включая 55 статей в ведущих реферируемых Российских и зарубежных научных журналах, 55 тезисов докладов на конференциях и препринтов. Список основных публикаций по теме диссертационной работы приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 838 наименований. Объем диссертации 437 страниц, включая 118 рисунков и 9 таблиц.

Похожие диссертации на Особенности структурной организации, ионные взаимодействия и физико-химические свойства мембран и планарных биомиметических наносистем