Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
I. Объекты исследования 42
2. Способы приготовления мембран 44
3. Приготовление липосом . 44
4. Спектральные исследования 47
5. Фото электрохимические исследования 48
6. ЭЛР-измерения 54
7. Электронномикроскопические исследования . 54
8. Способ регистрации выделения кислорода . 54
ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ЛИПОСОМ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ 55
1. Характеристика липосом, приготовленных из лецитина 56
2. Структура пигментсодержащих липосом 63
3. Обсуадение результатов 69
Выводы . . 76
ГЛАВА 3. СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИСКУССТВЕННЫХ ПИГМЕНТ-
ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН И ЛИПОСОМ 77
I. Спектры поглощения и люминесценции мономерной и кристаллической форм хлорофилла . 77
2. Спектры ЭПР мономерной и кристаллической форм хлорофилла 81
3. Обсуждение результатов 82
Выводы 86
ГЛАВА 4. ФОТОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИСКУССТВЕННЫХ ПИШЕНТ-ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН 88
I. Симметричные условия 89
2. Асимметричные условия 90
3. Спектры действия фотопотенциала 101
4. Обсуждение результатов 105
Выводы 114
ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕМБРАН И ЛШІОСОМ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ
ПРОЦЕССОВ ФОТОСИНТЕЗА 115
I. Взаимодействие хлорофилла в мембране с метилвиологеном (моделирование фотосистемы I) 115
2. Изучение процесса миграции энергии с Jb -каротина на хлорофилл а (моделирование антенны) 119
3. Реконструкция киолород-выделящей системы (моделирование фотосистемы 2) 125
Выводы 129
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 131
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 132
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 135
- Приготовление липосом
- Характеристика липосом, приготовленных из лецитина
- Спектры поглощения и люминесценции мономерной и кристаллической форм хлорофилла
- Асимметричные условия
- Взаимодействие хлорофилла в мембране с метилвиологеном (моделирование фотосистемы I)
Введение к работе
Согласно положениям теории происхождения жизни А.И.Опарина, биологический этап эволюции начинается с появления границы раздела фаз и обособления коацерватных капель от окружающей среды /1,2/. Возникшая граница раздела была той первородной мембраной, последующее развитие которой привело к разнообразию существующих биологических мембран, организующих множество клеточных органелл.
С функционированием биологических мембран связаны важнейшие метаболические реакции, среди которых особое место занимает процесс фотосинтеза, относящийся к числу глобальных биологических процессов, определяющих существование жизни на Земле.
Процесс фотосинтеза осуществляется в особых клеточных ор-ганеллах - хлоропластах высших растений и хроматофорах водорослей и бактерий. Хлоропласт представляет собой высокоорганизованную систему, состоящую из двух мембран оболочки и расположенных в строме фотосинтетических мембран, образующих тилакоиды стромы и тилакоиды гран.
Фотосинтетические мембраны, являясь основной структурной единицей хлороплаотов, играют определяющую роль в процессе трансформации и запасания световой энергии. Во-первых, с помощью мембран создается и стабилизируется пространственная организация фотосинтетического аппарата, упорядочивается расположение и взаимодействие пигментов, липидов и элементов фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Во-вторых, мембраны играют важную функциональную роль, определяя направленный перенос электронов и протонов, создавая и поддерживая разность электрохимических потенциалов ионов, разделяя окисленные и восстановленные продукты и препятствуя их рекомбинации.
С этой точки зрения представляет интерес исследование роли мембранных систем в осуществлении процессов поглощения, трансформации и запасания энергии солнечного света при фотосинтезе.
Однако сложность нативной организации мембран хлоропластов, взаимосвязь перечисленных процессов с темновыми реакциями фотосинтеза затрудняют проведение этих исследований in vivo.
Поэтому в настоящее время для моделирования структурных и функциональных особенностей мембран хлоропластов и хроматофоров применяются искусственные пигмент-липидные мембраны и липосомы /3-9/. Такие модельные системы по целому ряду параметров очень близки к естественным мембранам /3,10-15/ и изучение их свойств позволит получить представление о строении фотосинтетических мембран, глубже понять механизм их функционирования, создаст предпосылки осуществления направленной регуляции фотосинтетических процессов. Кроме того, моделирование первичных процессов фотосинтеза, осуществляемых в мембранах хлоропластов, дает возможность использования принципов, заложенных в основу жизнедеятельности зеленого листа, при создании устройств, способных улавливать и аккумулировать энергию солнечного света. Искусственные пигмент-липидные мембраны и липосомы могут быть использованы при этом в качестве основы для создания моделей солнечных преобразователей.
В связи с вышеизложенным целью данного исследования было изучение фотоэлектрических и спектральных свойств искусственных хлорофилл-липидных мембран и липосом и использование их в качестве инструмента при изучении и моделировании отдельных реакций процесса фотосинтеза.
Основные задачи работы состояли в следующем:
I. Провести электронномикроскопическое исследование структуры получаемых липосом в зависимости от длительности и интен-
сивности ультразвуковой обработки, а также концентрации и состава пигмент-липидного раствора.
Исследовать влияние белковых, донорно-акцепторных добавок и рН электролита на спектральные свойства хлорофилла в искусственных пигмент-липидных мембранах,
Определить ЭПР-параметры катион-радикала мономерного и кристаллического хлорофилла в мембранах липосом и оценить количество молекул хлорофилла в кристаллическом агрегате.
Исследовать влияние акцепторов электрона градиентов рН и внешнего поляризующего напряжения на величину фотопотенциала, генерируемого хлорофиллом в мембране.
Изучить миграцию энергии электронного возбуждения с ^-каротина на хлорофилл а в искусственных мембранах.
Выяснить возможности моделирования процессов фотосинтеза с помощью мембран и липосом.
Основные положения, выносимые на защиту:
Липосомы, приготовленные из фосфотидилхолина и пигмент-липидного экстракта хлоропластов отличаются способом упаковки липидных молекул.
Хлорофилл в мембранах и липосомах, приготовленных из пигмент-липидного экстракта хлоропластов способен к спонтанному переходу из мономерного состояния в микрокристаллическое.
Фотопотенциал, возникающий на искусственной пигмент-ли-пидной мембране при освещении, связан с протеканием окислительно-восстановительных реакций на границе раздела фаз. Величина фотопотенциала определяется значением темновой разности потенциалов на мембране, возникающей в асимметричных условиях.
Липосомы являются удобным инструментом для исследования и моделирования отдельных стадий фотосинтеза.
., 7 -
Приготовление липосом
Для приготовления липосом определенное количество липидов помещали в пробирку и высушивали под вакуумом. К осадку липидов приливали фосфатный либо трис-HCl -буфер (рН 6,86) в таком количестве, чтобы концентрация липидов в полученных липосомах составляла 10-50 мг/мл в зависимости от условий эксперимента. После предварительного удаления кислорода путем продувки аргоном-полученную смесь подвергали ультразвуковой обработке с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-І при частоте 22 кгц и силе тока 0,42 А. Озвучивание осуществляли трубчатым или экспоненциальным облучателем при t = 4 С. Продолжительность озвучивания изменяли от I до 45 минут. При длительной обработке диспер-гатор работал в режиме: 45 секунд - озвучивание, 45 секунд -охлаждение образца. Режим работы задавали прибором КЭП-12У, подключенным к диспергатору.
Характеристика липосом, приготовленных из лецитина
Оптимальные условия приготовления лецитиновых липосом подбирали, изменяя длительность озвучивания от I до 45 минут и концентрацию липида от 10 до 50 мг/мл. Для электронномикроско-пического исследования структуры липосом применяли негативное контрастирование молибденово-кислым аммонием (МКА), Раствор МКА добавляли перед началом озвучивания к фосфатному буферу до конечной концентрации 2 %. Выбор метода негативного контрастирования обусловлен тем, что он дает наиболее наглядную картину мембранных структур и обладает большим разрешением по сравнению с другими методами контрастирования образца. Предел разрешения составляет приблизительно 10-12 А и зависит от размеров частиц высушенного красителя /225/, Водорастворимый электронноплотный контрастер не только создает вокруг исследуемого объекта (в нашем случае липосом) темный фон, но и проникает в промежутки мевду его структурными элементами, заполняя полости, в которых находится вода. При высушивании образца участки, бывшие гидра-тированными, становятся электронноплотными, что способствует контрастному выявлению деталей поверхности объекта.
На фото 1-4 представлены типичные структуры фосфатидил-холиновых липосом, наблюдаемые с помощью электронного микроскопа при увеличении в 100 тысяч раз. Метод негативного контрастирования МКА позволяет видеть липосомы как округлые, имеющие внутреннюю полость образования, ограниченные одной или несколькими мембранами. Мембрана выглядит как светлая полоса на темном фоне контрастера.
Для изучения влияния времени озвучивания на структуру липосом анализировали образцы, полученные через 1,3,7,10,15,20,30 и 45 минут после начала ультразвуковой обработки.
Липосомы, полученные при малых временах озвучивания (до 3 минут) большей частью многослойные и неоднородны по размерам (фото I). Наряду с небольшими полыми липосомами размером от 300 до 1000 А наблюдается значительное количество крупных липосом диаметром от 5 до 8 тысяч ангстрем, внутренние полости которых только начинают формироваться.
class3 СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИСКУССТВЕННЫХ ПИГМЕНТ-
ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН И ЛИПОСОМ class3
Спектры поглощения и люминесценции мономерной и кристаллической форм хлорофилла
Сопоставление спектральных характеристик мембранного раствора и мембран позволяет судить о состоянии хлорофилла в мембране и степени его агрегации.
На рис.11 приведены спектры поглощения мембранного раствора (разведение в 200 раз по сравнению с основным) и мембраны. Главный максимум поглощения хлорофилла в мембране сдвинут в длинноволновую сторону на 2-4 нм по отношению к положению его в растворе и имеет максимум в области 670 нм, что характерно для мономерной формы пигмента /169,171/. Этот результат наблюдается для хлорофилла в мембранах, приготовленных как из ПЭ, так и М растворов.
В процессе спектральных исследований пигмент-липидных мембран было обнаружено, что через 5-Ю минут после формирования мембран или липосом из ПЭ раствора в спектре поглощения хлорофилла появляется новый максимум в области 740 нм. При этом происходит постепенное уменьшение поглощения при 670 нм и возрастание максимума при 740 нм, продолжающееся в течение 40-60 минут (рис.12). Наличие изобестической точки указывает на то, что хлорофилл в мембранах представлен двумя формами, имеющими различные полосы поглощения., Абсорбция в области 740 нм свойственна кристаллической форме хлорофилла /149,174/. Следовательно, хлорофилл в мембранах или липосомах, сформированных из ДЭ раствора, может находиться в мономерном и кристаллическом состояниях. В мембранах или липосомах из М раствора этот эффект не обнаружен.
Вследствие различного липиднсто состава мембраны, приготовленные из ПЭ и М растворов, обладают различной механической прочностью. Мембраны из ПЭ раствора менее стабильны, поэтому в ряде экспериментов для усиления механической прочности использовали смесь ПЭ и М растворов в соотношении 1:1. Мембраны из смешанного раствора стабильны и хлорофилл в них также обладает способностью к кристаллизации.
Исследование кристаллизации пигментов в искусственных мембранах представляет интерес в связи с возможностью привлечения представлений о полупроводниковых и экситонных механизмах разделения зарядов для объяснения первичных процессов фотосинтеза.
Нами были проведены эксперименты по выявлению условий благоприятствующих кристаллизации, в частности, оптимального значения рН среды, состава мембранного раствора, наличия в водном электролите белковых и акцепторных добавок.
Асимметричные условия
Общепризнанно то, что в реальных условиях хлорофилл в мембранах хлоропластов находится в асимметричных условиях. Это связано с тем, что в нативном состоянии на мембранах всегда существуют градиенты концентраций, возникают электрические поля, хлорофилл может находиться в окружении акцепторных и донорных молекул. Для дальнейшего приближения нашей модели к нативной мембране было проведено изучение свойств искусственных пигмент- -ттидннх мембран в асимметричных условиях.
Исследование свойств искусственных пигмент-липидных мембран в асимметричных условиях начали с изучения влияния акцепторных добавок на фотопотенциал, генерируемый хлорофиллом в мембранах. В качестве акцепторной добавки использовали хлорное железо, вводимое в электролит с внешней стороны мембраны. Обычно к 40 мл водного раствора электролита добавляли 0,1 мл насыщенного раствора PeCl , Если в качестве электролита использовали 0,1 М ксі, добавка хлорного железа приводила к возникновению на мембране темновой разности потенциалов, составляющей величину +70 100 мв в зависимости от количества добавленного акцептора; при этом фотопотенциал становился малоинерционным и возрастал до +20++30 мв (рис.17). Сторона мембраны, содержащая хлорное железо, всегда была отрицательно заряжена по отношению к противоположной стороне. Увеличение концентрации хлорного железа в 5 раз вызывает резкое возрастание темновой разности потенциалов, достигающее величины 200-250 мв и последующее разрушение мембраны. Следует отметить, что добавка хлорного железа приводит не только к возникновению темновой разности потенциалов на мембране, но и вызывает изменение рН среды в той полуячейке, куда оно добавлено. В наших экспериментах рН 0,1 мксі изменялся при добавлении Feci, от 5,7 до 3,2. В этом случае на величину фотопотенциала генерируемого хлорофиллом в мембране, могла оказывать влияние не только темповая разность потенциалов, но и возникающий на мембране, градиент рН. При использовании в качестве электролита ци-тратного буфера рН 4,0, добавка хлорного железа почти не приводила к увеличению темновой разности потенциалов на мембране (трансмембранного потенциала f т). Величина генерируемого фотопотенциала в этом случае не велика и сравнима с наблюдаемой в симметричных условиях.
class5 ПРИМЕНЕНИЕ МЕМБРАН И ЛШІОСОМ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ
ПРОЦЕССОВ ФОТОСИНТЕЗА class5
Взаимодействие хлорофилла в мембране с метилвиологеном (моделирование фотосистемы I)
Основной фотореакцией осуществляемой фотосистемой I высших растений является перенос электрона с возбужденной молекулы хлорофилла на акцептор ФС І ферредоксин, В настоящее время для изучения этой реакции широко используется аналог ферредоксина ме тилвиологен, обладающий таким же как ферредоксин окислительно-восстановительным потенциалом. Имеющиеся литературные данные по фотовосстановлению метилвиологена хлорофиллом и другими красителями отражают в основном результаты опытов, проведенных в гомогенных системах, представленных растворами пигмента и акцептора /116,214/, Однако в нативных системах эта реакция осуществляется на границе раздела фаз, поэтому большой интерес проявляется к изучению взаимодействия фотовозбужденного хлорофилла с метилви-ологеном в гетерогенных системах, особенно в искусственных пиг-мент-липидных мембранах и липосомах /171,214/,
Нами проведено исследование фотовосстановления метилвиологена хлорофиллом, локализованным в мембранах липосом, приготовленных из пигмент-липидного экстракта хлоропластов гороха.
Были использованы три дополняющие друг друга метода регистрации: люминесцентный, потенциометрический и ЭПР.
С помощью люминесцентного метода изучено тушение люминесценции хлорофилла метилвиологеном в присутствии кислорода воздуха. Результаты, приведенные на рис.26 показывают, что добавление ме-тилвиологена в систему приводит к значительному ослаблению люминесценции хлорофилла. Вероятно это происходит в результате протекания фотохимической реакции между хлорофиллом и метилвиологеном, приводящей к переносу электрона с возбужденной молекулы хлорофилла (Хл) на метилвиологен (МБ).
Потенциометрическое исследование этой реакции позволило углубить представления о механизме ее протекания. На рис.27 представлена кинетика изменения фотопотенциала платинового электрода при освещении пишент-липидных липосом. Освещение ли-посом в аэробных условиях (рис.27 I) приводит к генерации небольшого отрицательного фотопотенциала. Откачка кислорода из системы вызывает уменьшение наблюдаемого фотоэффекта (рис.27 П). Добавление метилвиологена в отсутствии кислорода воздуха способствует резкому увеличению генерируемого фотопотенциала (рис.27 Ш), снижающемуся при напуске воздуха в ячейку (рис.27 ВО.
В исследованной системе знак и величина фотопотенциала на Pt электроде определяются взаимодействием с электродом восстановленного метилвиологена, приводящего к передаче электрона на и возникновению на ней отрицательного заряда. Снижение величины фотопотенциала в присутствии кислорода объясняется переносом электрона с МВ+ на 02, приводящим к конкуренции Pt электрода и кислорода за электрон восстановленного метилвиологена.
