Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Анатомия и физиология семян 8
1.1.1. Фазы развития плода и семени 8
1.1.2. Способность семян к прорастанию в зависимости от степени зрелости 10
1.1.3. Покой семян И
1.1.4. Зависимость прорастания семян от внешних факторов 15
1.1.4.1. Температура 16
1.1.4.2. Вода 16
1.1.4.3. Свет 18
1.1.4.4. Биологические факторы 19
1.1.5. Жизнеспособность семян 20
1.2. Высушивание, старение и потеря всхожести 25
1.2.1. Введение 25
1.2.2. Биохимические адаптации при ангидробиозе 26
1.2.3. Стабилизация высушенных мембран и белков с помощью трегалозы 27
1.2.3.1. Стабилизация высушенных мембран 27
1.2.3.2. Механизм стабилизации высушенного бислоя 28
1.2.3.3. Влияние дегидратации на фософолипиды 28
1.2.3.4. Механизм взаимодействия с фосфолипидами 29
1.2.3.5. Стабилизация высушенных белков 31
1.2.3.6. Одинаково ли влияние замораживания и дегидратации? 32
1.2.4. Применение гипотезы фазового перехода к
неповрежденным клеткам 32
1.2.4.1. Повреждения из-за впитывания 32
1.2.4.2. Избежание повреждения из-за впитывания 33
1.3. Методы оценки качества семян 33
1.4. Применение метода ЭПР-спектроскопии спиновых меток для исследования физико-химических свойств семян 35
1.4.1. Влияние подвижности парамагнитного фрагмента на спектры ЭПР спиновых меток: область медленных вращений 36
1.4.2. ЭПР-спектроскопия спиновых меток в исследованиях зародышей семян 41
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Исследуемый материал. Тестирование семян на всхожесть 44
2.2. Спин-мечение подготовка образцов к измерениям 44
2.2.1. Гидратированные образцы зародышевой оси 44
2.2.2 Дегидратированные образцы зародышевой оси 46
2.2.3. Подготовка спин-меченых жировых капель 46
2.3. Оценка целостности клеточных мембран 47
2.4. Регистрация спектров ЭПР 48
2.5. Анализ спектров ЭПР 49
2.5.1. Обычные спектры ЭПР (КО 49
2.5.2. Спектры ЭПР переноса насыщения (Т2') 51
2.5.3. Интегрирование и вычитание спектров ЭПР 52
Глава 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Исследование структурной целостности цитоплазматических мембран клеток зародыша семян пшеницы. 53
3.2. Встраивание спиновых меток в клетки зародышевой оси 60
3.3. Кинетика встраивания спиновой метки в зародышевую ось 64
3.4. Позиционный профиль спектров ЭПР 66
3.4.1. Обычные спектры ЭПР (ГО 68
3.4.1.1. Профиль упорядоченности нитроксильных радикалов 68
3.4.1.2. Профили полярности 74
3.4.2. Спектры ЭПР переноса насыщения (F2') 78
3.4.2.1. Исследования спин-меченых зародышеых осей 78
3.4.2.2. Спиновые метки в модельных системах 83
3.5. Температурные зависимости подвижности спиновой метки 87
3.5.1. Обычные спектры ЭПР (Vx) 87
3.5.2. Спектры ЭПР переноса насыщения. (fY) 96
3.6. Влияние высушивания зародышей на спектр ЭПР 1(12,3) 101
3.6.1. Кинетика "быстрого" высушивания регидратированных зародышей 101
3.6.2. Влияние высушивания на термоиндуцированные структурные изменения клеточных мембран зародыша 103
3.6.2.1. Обычные спектры ЭПР (V{) 103
3.6.2.2. Спектры ЭПР переноса насыщения (V^) 107
3.7. Структурные изменения мембран зародышевой оси, происходящие в условиях естественного хранения зародышевой оси ПО
Заключение 114
Выводы 116
Список литературы
- Способность семян к прорастанию в зависимости от степени зрелости
- Стабилизация высушенных мембран и белков с помощью трегалозы
- Спин-мечение подготовка образцов к измерениям
- Встраивание спиновых меток в клетки зародышевой оси
Введение к работе
Диссертационная работа посвящена исследованию физико-химических характеристик цитоплазматических мембран зародышевой оси семян пшеницы.
Нарушение целостности плазматических мембран является одной из причин потери всхожести семян, происходящей при хранении семян. Исследование физико-химических свойств клеточных мембран семян традиционными методами, такими как ИК спектроскопия, затруднено из-за присутствия в них значительного количества липидных телец. В клетках зародышевой оси ИК спектры мембранных липидов перекрываются с ИК спектрами липидных телец. Поэтому разработка новых методических подходов к изучению клеточных мембран семян, которые позволяют следить за динамикой изменения физико-химических свойств клеточных мембран семян, представляет актуальную научную задачу, имеющую важное практическое значение.
Метод спиновых меток является одним из наиболее распространенных методов изучения структурно-функциональных характеристик искусственных и биологических мембран. В последнее время этот метод начал все чаще применяться в биофизике и физиологии растений в частности, для исследования жизнеспособности семян различных растений и для выяснения факторов, определяющих их устойчивость к высушиванию и сохранению всхожести в зависимости от условий хранения семян. Однако, несмотря на многолетнюю научную традицию использования метода спиновых меток для изучения липидных мембран, этот метод не получил еще столь широкого распространения при исследовании мембран семян, по сравнению с другими областями биофизики, биохимии и физиологии, где применение спиновых меток давно стало рутинным методом изучения биологических мембран. Практика этого заключается в том, что растительные клетки представляют собой сравнительно сложные системы, в состав которых наряду с мембранами входят липидные тельца, крахмальные гранулы и другие структурные образования.
Использование традиционного метода ЭПР (регистрация первой производной сигнала поглощения СВЧ) не всегда позволяет разделить сигналы ЭПР от спиновых меток, локализованных в мембранах различного происхождения, особенно в тех случаях, когда движение спиновых меток заторможено. Последнее обстоятельство имеет место при изучении сухих (обезвоженных) биологических структур, какими являются зрелые семена различных растений. В этой связи становится особенно актуальным использование методов регистрации спектров ЭПР, чувствительных к сравнительно медленным вращениям спиновых меток. К числу этих методов относится спектроскопия ЭПР с переносом насыщения.
В диссертационной работе проведено обширное исследование, в котором впервые использована техника ЭПР спектроскопии с переносом насыщения для изучения взаимодействия липидорастворимых спиновых меток с мембранами клеток зародышевой оси и доказана практическая возможность использования этого метода для изучения клеточных мембран в таких сложных биологических системах, как клетки зародышевой оси семян пшеницы.
Впервые показано, что подавляющее число молекул спиновых меток, использованных в данной работе, локализуется в мембранах клеток зародышевой оси, а не в объемной фазе масляных частиц, что служит основанием для применения метода ЭПР спектроскопии спиновых меток для изучения структурных характеристик мембран клеток семян in situ. Установлено, что термоиндуцированные структурные перестройки в липидных областях клеточных мембран зародышевой оси семян пшеницы имеют кооперативный характер. Показано, что мембраны дегидратированных клеток зародышевой оси семян пшеницы в широком диапазоне температур (плоть до 60С) находятся в твердом состоянии. Гидратация клеток зародышевой оси приводит к разжижению мембран: при температурах выше Тт2 ~ -7С большая часть мембранных липидов находится в жидкокристаллическое состояние, при уменьшении температуры ниже Гт1 ~ -30С большинство мембранных липидов переходит в твердокристаллическое состояние.
Показано, что хранение семян пшеницы в естественных условиях сопровождается нарушением целостности мембран клеток зародышевой оси. При этом происходят структурные изменения мембран клеток зародышевой оси, сопровождающиеся разрыхлением липидного бислоя, которое проявляется в заметном уменьшении времени вращательной корреляции нитроксильных радикалов, локализованных в мембранах зародышевой оси. С увеличением времени хранения семян наблюдается уменьшение числа интактных клеток; при этом, однако, индекс всхожести семян не коррелирует однозначно с общим количеством клеток зародышевой оси, сохраняющих неразрушенные мембраны.
Способность семян к прорастанию в зависимости от степени зрелости
Семена большинства видов обладают удивительным свойством длительное время находиться в состоянии покоя, сохраняя при этом полностью жизнеспособность. Они могут быть в состоянии вынужденного или органического покоя. Причиной вынужденного покоя являются различные факторы внешней среды, препятствующие прорастанию, чаще всего неблагоприятная температура или недостаток влаги. Под органическим покоем подразумевается задержка прорастания, вызванная свойствами зародыша или его окружающих тканей, а именно эндосперма и/или перисперма и семенной кожуры, а также околоплодника или его части.
Семена, находящиеся в органическом покое, характеризуются снижением всхожести и полным отсутствием прорастания при благоприятных для данного вида условиях, или же значительным сужением пределов температурных условий, при которых происходит прорастание семян.
У некоторых растений органический покой семян так глубок, что в естественных условиях они прорастают лишь через 1-2 года, а при отсутствии достаточно благоприятных условий для нарушения покоя появление всходов нередко растягивается на несколько лет. Кроме того, для многих дикорастущих растений характерна разновременность прорастания, связанная главным образом с растянутостью периода созревания семян. Оба эти свойства способствуют тому, что семена переживают неблагоприятный период года; у растений тем самым сохраняется запас семян в почве, что обеспечивает сохранение видов. Вместе с тем, указанные свойства семян создают немалые сложности в практике лесного и сельского хозяйства, затрудняя своевременное получение дружных всходов и во многом осложняя борьбу с засорением посевов.
В 1916 году американскими учеными [8] была предложена классификация типов покоя семян. В основу ее были положены известные в то время причины, вызывающие покой: 1) недоразвитость зародыша, 2) непроницаемость кожуры для воды, 3) механическое сопротивление покровов росту зародыша, 4) низкая газопроницаемость покровов, 5) покой самого зародыша, связанный с существованием метаболического блока, который может быть снят действием света или охлаждения, 6) комбинирование упомянутых причин, 7) вторичный покой. Эта классификация иногда используется за рубежом и теперь, хотя она устарела, поскольку накопилось большое количество новых сведений о биологии покоящихся семян.
В зависимости от причин, вызывающих торможение прорастания, в частности от того, с какими частями семени или плода оно связано, следует различать 3 типа покоя семян [18]: экзогенный, эндогенный и комбинированный. Соответственно различны и условия, приводящие к нарушению покоя этих типов. В природе мы часто имеем дело не с «чистыми» типами покоя, а с их комбинированием. Эндогенный покой обусловлен свойствами зародыша: его недоразвитостью или особым физиологическим состоянием. Экзогенный покой обусловлен такими свойствами покровов зародыша (кожуры или околоплодника, а иногда и эндосперма), как водонепроницаемость, присутствие ингибиторов или механическое сопротивление росту. Нарушение такого покоя происходит обычно под влиянием различных физических воздействий.
Особым типом экзогенного покоя является твердосемянностъ. Явление твердосемянности состоит в том, что при благоприятных для прорастания условиях семена не набухают и потому не могут прорастать. Такие семена называются твердыми [23]. Возникновению твердосемянности способствует низкая влажность воздуха во время созревания или хранения семян. Поэтому процент твердых семян обычно бывает выше у растений, произрастающих в пустынных и полупустынных районах. Водонепроницаемость твердых семян в большинстве случаев связана с присутствием в семенной кожуре, особого, так называемого, палисадного слоя клеток. Для палисадного слоя клеток характерно наличие «световой линии» (рис. 2). Природа ее остается до сих пор неясной, но именно с ее присутствием связывают водонепроницаемость семян.
В естественных условиях наблюдается два пути утраты твердосемянности. Во-первых, она иногда исчезает самопроизвольно при длительном хранении семян. Во-вторых, семена могут приобретать способность прорастать под воздействием различных факторов внешней среды, например вследствие разрушения кожуры почвенной микрофлорой или механического воздействия (копытами животных, потоками воды, движением частиц почвы), но основным фактором, выводящим твердые семена из состояния покоя, являются температурные условия: промерзание, чередование промерзания с оттаиванием, дневные колебания температуры (10730С, 15760С) и, наконец, сезонные повышения температуры (до 30-60С).
Несмотря на большие достижения в изучении покоя семян и особенно глубокого физиологического покоя, остается много нерешенных вопросов. Однако имеющиеся данные позволяют предполагать, что причиной физиологического покоя семян является низкий уровень активности ферментативного аппарата. Этот блок устраняется под влиянием внешних специфических факторов, главным образом пониженной температуры
Стабилизация высушенных мембран и белков с помощью трегалозы
В работах [57,58] эффекты, связанные с высушиванием, изучались на мембранах саркоплазматического ретикулума, выделенного из скелетных мышц. Эти мембраны обладают характерной морфологией, которую можно видеть в замороженном состоянии, а их биологическая активность проявляется при переносе Са , который легко измерить. Когда эти мембраны высушивались без трегалозы, везикулы сливались и морфология изменялась. В результате этих повреждений, после регидратации способность к транспортировке Са + была потеряна. Однако когда мембраны высушивались с трегалозой при концентрациях близких к найденным в ангидробиотических организмах, морфологические повреждения не проявлялись во время высушивания, и после регидратации степень переноса Са2+ у везикул оказывалась близкой к исходной. Высушенные везикулы могут храниться до 6 месяцев без потери стабильности при условии, что они защищены от попадания кислорода [116]. В других лабораториях были получены похожие результаты.[123-126]. Все пришли к единому мнению, что трегалоза является наиболее эффективной молекулой для сохранения сухих мембран, но другие дисахариды могут быть настолько же эффективны, особенно при высоких концентрациях.
Механизм стабилизации высушенного бислоя.
Два основных стресса дестабилизируют бислои во время высушивания: слияние везикул и фазовые переходы в липидах [52,54,55]. Определение степени слияния по резонансному переходу энергии между амфифильными флуоресцентными пробами, встроенными в бислой [64,144], или по рассеиванию лазерного луча, показано, что трегалоза и другие сахара действительно ингибируют процесс слияния между пузырьками во время высушивания, но вместе с тем одного этого недостаточно для сохранения высушенных везикул уже небольшого количества трегалозы оказывается достаточным для полного подавления процессов слияния, но куда большее количество необходимо для предотвращения потери водо-растворимого маркера. В свете полученных результатов, представляет интерес рассмотреть фазовые переходы в липидах как альтернативное объяснение механизма стабилизации.
Для гидратированных мембранных фосфолипидов, в частности у фосфатидилхолина, вокруг каждого фосфата имеется 10-12 молекул воды вязаных кислородными связями. Эти молекулы воды составляют приблизительно 20 % от веса всего гидратированного бислоя [47,53]. С удалением воды расположение липидных головок становится более плотным, что ведет к увеличению Ван дер Ваальсовых взаимодействий между углеводородными цепочками. Как следствие, температура фазового перехода Т сильно увеличивается. Например, в экспериментах по дегидратации липосом температура Т увеличивалась с -10С до 60С. Таким образом, сухие липиды будут находиться в гелевой фазе при комнатной температуре, т. е. при температуре, при которой полностью гидратированные липиды находятся в жидкокристаллической фазе. В результате, когда сухие липиды помещаются в воду, они должны претерпевать фазовый переход. В дополнение к этому показано, что дегидратация может приводить к латеральному разделению фаз липидов, составляющих мембраны [120]. Хорошо известно, что гидратированные бислои становятся сильно текучими после того, как претерпевают подобный фазовый переход [34,56]. Следовательно, сухие бислои, которые находятся в гелевой фазе, могут перетекать во время регидратации. Имеющееся факты позволяют утверждать, что трегалоза предотвращает это перетекание, изменяя температуру фазового перехода сухих липидов. Это дает им возможность оставаться в жидкокристаллической фазе в отсутствие воды (рис. 3). На самом деле, трегалоза может сделать Т гораздо ниже температуры фазового перехода у полностью гидратированных липидов [62,66]. При этом изменение Т трегалозой сильно коррелирует со способностью удерживать захваченные растворенные вещества [66]. Как следствие этого эффекта, сухие липиды не претерпевают переход из гелевой в жидкокристаллическую фазу во время регидратации и они не текут. Этот механизм представлен на рис. 3. Предложенный механизм позволяет заключить, что для насыщенных липидов, которые используются для приготовления липосом, (например, дипальмитилфосфатидилхолин) механизм предохранения совсем другой. Дело в том, что температуры фазовых переходов оказываются во всех случаях выше комнатной. Следовательно, липиды будут находиться все время в гелевой фазе во время дегидратации-регидратации если ее проводить при комнатной температуре. Таким образом, фазовый переход, связанный с гидратацией, не должен представлять проблемы и задачу сохранения можно решить только путем ингибирования слияния. Полученные данные свидетельствуют о правильности этой гипотезы [77,106], хотя детали механизма остаются пока неизвестными.
Спин-мечение подготовка образцов к измерениям
У семян потенциальная способность к метаболизму сохраняется даже после потери ими практически всей воды. Известно (см. [2,26]), что образование макромолекулярных комплексов и бислойных структур биологических мембран определяется гидрофобными взаимодействиями между молекулами липидов, чьи полярные "головки" обращены в водную фазу, и мембрано-связанных белков. Как могут клеточные мембраны зародышей семян сохранять их структурную и функциональную целостность в случае сухого жизненного цикла? В поисках ответа на этот вопрос в работе [76] была выдвинута гипотеза, которая основана на представлениях о структурных преобразованиях липидов мембран, управляемым уровнем гидратации в мембране. Результаты проведенных авторами экспериментов по исследованию структурной реорганизации модельных мембранных систем под влиянием их регидратации позволяют предположить, что структурное состояние липидов в мембране может контролироваться уровнем влажности. Согласно [39-41], липидные молекулы могут образовывать инвертированную гексагональную фазу, как только уровень воды снизится до 20 %. Согласно полученным данным, этот процесс обратим и такая бислойная структура мембран может восстанавливаться после медленной регидратации клеток. Эта гипотеза объясняла различные процессы, которые сопровождают жизненный цикл семян (нехватку электролитов от впитывающих клеток, оптимальную температуру прорастания и т.п.). Однако вопрос о влаго-зависимых структурных перестройках в мембранах зародышей семян еще не разрешен, а имеющиеся литературные данные весьма противоречивы.
Другое возможное объяснение изменения барьерных свойств мембран клеток зародыша при гидратации-дегидратации основано на том, что недостаток воды приводит к разделению мембранных компонент с сопутствующим этому процессу образованием липидных доменов, которые различаются по своим физическим свойствам [40,51,122]. Получены экспериментальные данные [134], что влаго-контролируемые структурные перестройки липидных мембран являются необратимыми процессами. Следовательно, можно предположить, что засухоустойчивые организмы должны иметь механизм, стабилизации мембраны, который предотвращает необратимое разделение липидов. Показано [42], что некоторые формы Сахаров оказывают существенное защитное действие на биологические мембраны [42]. Этот эффект защиты может быть объяснен взаимодействиями Сахаров с сухими липидами мембран. Замещая воду из мембраны, молекулы Сахаров защищают мембрану от разрушений, которые могут быть вызваны ее дегидратацией.
Метод ЭПР-спектроскопии спиновых меток был использован для изучения физико-химических основ процессов высушивания и регидратации семян рядом исследователей [37,38,74-76,135,139]. В этих работах использовались разные спин-меченые соединения, а измерения их спектральных параметров проводились как с помощью методов обычной ЭПР-спектроскопии, так и с помощью методов ЭПР-спектроскопии с переносом насыщения.
Эксперименты, проведенные с использованием спиновой метки TEMPONE, которая хорошо растворима как в полярной, так и в гидрофобной среде, показали, что потеря жизнеспособности семян коррелирует с изменением целостности мембран [76]. К этому выводу авторы данной работы пришли, изучая проникновение во внутриклеточное пространство парамагнитного уширителя (феррицианида, а также оксалата хрома), уширяющего вследствие магнитного дипольного спин-спинового взаимодействия линии спектра ЭПР молекул TEMPONE внутри клетки. Интересные результаты о влиянии высушивания и повторного увлажнения на характеристики мембран зародышей семян пшеницы были получены с помощью спин-меченых производных стеариновой кислоты 1(12,3) и 1(1,14) [75]. Оказалось, что различные области клеток зародыша, даже при нормальной степени гидратации отличаются жидкостностью мембранных липидов. Жидкостность липидных областей мембран нежизнеспособных семян была существенно ниже, чем у мембран жизнеспособных семян. Удаление воды из образцов сопровождалось увеличением разницы спектральных параметров спин-меченых мембран жизнеспособных и нежизнеспособных семян. В тоже время для обоих образцов был характерен сложный вид регистрируемых спектров ЭПР спиновых меток, свидетельствующий о наличии минимум двух областей с разной вязкостью, в которых локализованы молекулы метки. Было показано, что распределение молекул спиновой метки 1(12,3) лишь незначительно менялось после высушивания жизнеспособных семян, в тоже время, как эффективный объем областей с меньшей вязкостью значительно уменьшался в случае высушивания жизнеспособных семян.
В работе [76] авторы провели сравнительное исследование спектральных параметров радикала 1(12.3), у которого парамагнитный фрагмент в значительной степени иммобилизован в мембране, и более подвижных молекул метки 1(1,14), в мембранах зародышей семян, а также в полной фракции изолированных липидов этих семян и их масел. Эти эксперименты показали, что часть молекул спиновых меток может быть локализована во внутриклеточных липидных тельцах. Основной вывод из этих экспериментов заключается в том, что такое содержание липидных телец в зародышах клеток нежизнеспособных семян уменьшается. Клетки зародышевой оси семян пшеницы содержат только т. н. "сложные" липидные тельца, связанные с плазматическими мембранами и мембранами белковых телец. Точная физиологическая роль "сложных" липидных телец до настоящего времени не известна. На основе имеющихся экспериментальных данных можно предположить, что эти тельца служат своего рода запасником липидов, которые могут быть использованы для увеличения поверхности плазматической мембраны во время гидратации семян.
Встраивание спиновых меток в клетки зародышевой оси
Вместе с упорядоченностью и подвижностью нитроксильных радикалов, полярность их окружения также может влиять на форму сигнала ЭПР. Для измерения полярности, можно измерить величину констант изотропного сверхтонкого расщепления Т0. В полярном окружении (например, в водном растворе), быстро и изотропно вращающиеся радикалы дают характерный триплетный сигнал ЭПР с большими значениями параметра То, чем в гидрофобном окружении [1]. Для спиновых меток I(m,n) и I(m,n)CH3, растворенных в масляных каплях, константа Т0 изотропного расщепления при 20С равна 13,9±0,1 Гс, что характерно для нитроксильных радикалов в гидрофобном окружении. Похожее значение Т0= 13,8±0,1 Гс было получено для нитроксильных радикалов 1(5,10), 1(1,14) и метилированных спиновых меток, локализованных в клетках зародышевой оси. Однако на практике не всегда можно определить точное значение Т0 для 1(12,3), потому что спиновая метка сохраняет анизотропное вращение в мембранах клеток зародыша даже при высоких температурах. Принимая во внимание это обстоятельство, для оценки полярного профиля доксилстеаратов, мы провели сравнение спектров ЭПР гидратированных и дегидратированных зародышей, полученные при различных температурах (рис. 19).
На рис. 19 показано, что при комнатной температуре (20С) параметр расщепления 2Тц метки 1(12,3) в дегидратированных зародышах выше, чем в гидратированных. Этот результат объясняется более высокой жесткостью мембранных липидов в дегидратированных клетках зародышей [75]. Однако, при низких температурах (когда подвижность радикалов в обоих образцах заморожена) сигнал ЭПР в гидратированных зародышах имеет большее расщепление внешних пиков (2Тц = 66,75 Гс) по сравнению с дегидратированными зародышами (2Тц = 64,75 Гс). Этот результат можно объяснить различной полярностью окружения нитроксильных радикалов в гидратированных и дегидратированных образцах. Гидратированные фосфолипидные мембраны содержат воду. Так, например, для мембраны из фосфатидилхолина 10-12 молекул воды связаны водородной связью к одной молекуле фосфолипида [47,53]. Молекулы воды в гидратированном липидном бислое могут влиять на тензор сверхтонкого взаимодействия нитроксильных радикалов, вызывая увеличение параметра 2Тц . Сравнение спектров ЭПР при низких температурах (-50С) показывает, что нитроксильный радикал 1(12,3) локализуется в более полярных доменах, чем другие доксильные группы. Рис. 20 показывает, что параметр расщепления 2ТИ , измеренный при -50С, уменьшается по мере проникновения доксильной группы в мембраны гидратированных клеток. Этот результат можно объяснить различной полярностью окружения нитроксильных радикалов в области головок липидов мембраны и в гидрофобной сердцевине мембраны. Оба явления, эффект высушивания (рис. 19) и зависимость от расположения доксильной группы (рис. 20), показывают, что в гидратированных клетках зародыша окружение нитроксильного радикала 1(12,3) более полярно, чем окружение других доксилстеаратов.
В отличие от клеток зародыша, не наблюдалось существенного различия между константой изотропного сверхтонкого расщепления Т0 и параметром расщепления 2ТП для молекул 1(12,3) и 1(12,3)-СН3, растворенных в масляных каплях и очищенном масле, соответственно. Этот результат означает, что молекулы воды из водной части раствора не влияют на сигнал ЭПР от 1(12,3),
С понижением температуры, когда основная часть липидов затвердевает, обычный метод ЭПР теряет чувствительность к более медленным (субмиллисекундным) вращениям нитроксильных радикалов. В этом случае для изучения вращательного движения спиновых меток можно использовать ЭПР-спектроскопию переноса насыщения (ЭПР-ПН) [79-81,97,113,137].
Спектры ЭПР-ПН от I(m,n) и I(m,n)-CH3 в гидратированном зародыше представлены на рис. 21. Эти спектры (записанные при температуре -50С) нормализованы по величине интегральной интенсивности соответствующих обычных спектров ЭПР. Согласно [97,137], отношения величин трех пар пиков, L"/L (низкое поле), С/С (центральное) и Н"/Н (высокое поле) использовались для оценки субмиллисекундных времен корреляции вращательного движения. В нашей работе, для анализа низкотемпературной подвижности нитроксильных радикалов в клетках зародыша, мы сравнивали низкополевые и центральные пары пиков, так как точность определения отношения сравнительно слабых высокополевых пиков была затруднена относительно низким отношением сигнал/шум (см. рис. 21).
Для амфифильных производных стеариновой кислоты I(m,n), форма линии спектра V-i заметно меняется с проникновением доксильной группы внутрь мембраны. Из рис.21 видно, что спектр ЭПР-ПН для 1(12,3) имеет более высокое значение параметра L VL по сравнению со спектрами 1(5,10) или 1(1,14). Однако (рнс. 22), отношение параметров L"/L изменяется немонотонно с проникновением доксильной группы внутрь мембраны (минимум для положения m = 5, n = 10). Метилированные спиновые метки 1(т,п)-СНз характеризуются позиционным профилем, который отличается от остальных стеариновых кислот: отношение L VL имеет одно и тоже значение для (m = 12, n = 3) и (m = 5, n = 10), но увеличивается при (m = 1, n = 14) (рис. 22A). Метальные эфиры спиновых меток дают спектры ЭПР-ПН с меньшим значением параметра L YL по сравнению с соответствующими стеариновыми кислотами. Этот факт означает, что нитроксильные радикалы липофильных спиновых меток, включая 1(12,3)-СН3, имеют большую вращательную степень свободы, чем амфифильные спиновые метки I(m,n). Что касается отношения С/С, то нет существенного отличия между стеариновыми кислотами и их метилированными аналогами.
На рис. 22Б показаны позиционные профили кажущихся времен корреляций вращательного движения XL И ХС, определенных по параметрам L"/L и С/С, соответственно. Позиционный профиль xL указывает на то, что при низких температурах подвижность нитроксильных радикалов в средней части мембраны в несколько раз выше, чем в поверхностном слое мембраны (1(12,3)). Необходимо, однако, отметить, что кажущиеся времена корреляции xL существенно отличаются от тс. Величина времени корреляции xL выходит за пределы интервала 10-100 мкс, тогда как величина хс на порядок меньше.
Разница во временах корреляции XL и хс отражает анизотропный характер движения спиновой метки. Согласно [80], отношение С/С должно быть более чувствительно к вращению спиновых меток вокруг длинной оси стеариновой кислоты, a L YL - к непосредственному движению самой длинной оси. Таким образом, степень анизотропии вращения радикала можно формально охарактеризовать параметром Ъ, — xL I%Q. Чтобы вычислить значения xL и хс из отношений L 7L и С/С, мы использовали калибрирующие кривые, полученные Говартом и Маршем [95] для спектров ЭПР-ПН спиновой метки, прочно связанной с гемоглобином. Можно предположить, что в водно-глицериновом растворе молекулы гемоглобина вращаются почти изотропно, поэтому можно ожидать, что соотношение xL « хс выполняется также для изотропно вращающихся радикалов в мембране.
