Введение к работе
Актуальность работы. Шмели - эффективные опылители ряда важных сельскохозяйственных культур, таких как томаты, болгарский перец, огурец (Torres-Ruiz, Jones, 2012; Lye et al., 2011; Julier, Roulston, 2009). Экономическая важность насекомых-опылителей обусловила особое внимание к исследованиям физиолого-биохимических процессов, протекающих в них.
Насекомые, в частности земляные шмели Bombus terrestris (L.), используются в качестве модельного объекта для изучения окислительного стресса, так как они отличаются интенсивным дыхательным метаболизмом, обусловленным высокими затратами энергии во время полета (Suarez R.K., 2000; Suarez R.K. et al., 2005). Интенсификация энергетического метаболизма насекомых, повышение скорости работы ЭТЦ и, как следствие, высокий уровень образования АФК обусловливают важность изучения биохимических процессов, протекающих в митохондриях летательных мышц. Как известно, 2-5% потребляемого кислорода идет на образование АФК (Harman, 2006.). При усиленном поступлении кислорода в клетки или нарушении работы ЭТЦ митохондрий образование АФК может значительно возрастать (Murphy, 2009). Высокая интенсивность дыхания насекомых обусловлена не большим количеством ферментов, а их высокой удельной активностью (Suarez, 2000). Интересно, что в летательных мышцах насекомых цикл Кребса характеризуется большей интенсивностью в сравнении с другими животными, что достигается высокой активностью ряда катаболических ферментов (Гилмур, 1968).
Основные субстраты дыхания у насекомых - пролин, пируват, а- глицерофосфат, характерной чертой летательных мышц является то, что митохондриальная и цитоплазматическая формы фермента а- глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) образуют мощный каталитический цикл, передающий электроны на ЭТЦ (Suarez et al., 2005; Carmon, MacIntyre, 2010). Функционирование а-ГФДГ хорошо изучено в организмах разных таксономических групп, в том числе насекомых (Agboola et al., 2003; Miwa, Brand, 2005; Yeh et al., 2008; Carmon, MacIntyre, 2010; Orr et al., 2012; Mracek et al., 2013). Известно, что сукцинат является субстратом дыхания в стрессовых условиях (Кондрашева и др., 1987; Zakharchenko et al., 2013). Более того, сукцинат - компонент множества метаболических реакций, что позволяет ему осуществлять гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторного фактора. Изучение роли окисления сукцината заслуживает более пристального внимания. Реакция превращения сукцината в фумарат с образованием энергетического эквивалента в виде восстановленного флавинадениндинуклеотида (ФАДН2) катализируется сукцинатдегидрогеназой (СДГ).
Выделение и изучение свойств СДГ сопряжено с рядом трудностей, так как в процессе очистки, отделяясь от мембранных компонентов, фермент становится крайне лабильной структурой. Впервые очищенный препарат растворимой СДГ был получен из животных тканей Сингером (Singer, Kearney, 1954). В литературе описано несколько методов выделения комплекса II из митохондрий животных тканей, микроорганизмов (Moll, Schafer, 1991; Yu, Yu, 1993) и растений (Игамбердиев, Фалалеева, 1994). Однако работ по экстракции данного фермента из летательных мышц насекомых, в частности B. terrestris, не проводилось.
Структурная организация молекулы СДГ устроена таким образом, что данный белок расположен вблизи источников генерации АФК - компонентов ЭТЦ. В связи с этим представляется чрезвычайно важным изучить и охарактеризовать особенности организации окисления сукцината в митохондриях летательных мышц B. terrestis и функционирования СДГ, ее регуляторные свойства и молекулярную структуру. Также данные исследования имеют научный и практический интерес, в связи с тем, что нарушения в структуре фермента и работе генов, кодирующих отдельные субъединицы белковой молекулы, сопряжены, в частности, с развитием канцерогенеза (Weihua, Shimin, 2013; Baysal, 2013; Kluckova et al., 2012).
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение молекулярной организации и регуляции окисления сукцината как резервного субстрата дыхания при адаптации к стрессовым факторам шмелей B. terrestris.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
измерить максимальную скорость поглощения кислорода в летательных мышцах B. terrestris при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания в состоянии покоя и при нагрузке;
-
определить интенсивность образования АФК при утилизации сукцината в качестве единственного субстрата дыхания;
-
оценить степень повреждения митохондриальной и ядерной ДНК из летательных мышц B. terrestris в модельном эксперименте;
-
выявить динамику активности СДГ и восстановленного глутатиона на разных этапах в процессе индивидуального развития B. terrestris;
-
выявить корреляцию активности ключевых ферментов энергетического метаболизма - СДГ и АГ - и динамику концентрации глутатиона в митохондриях в зависимости от продолжительности полета;
-
исследовать изоферментный состав СДГ в митохондриях самок и самцов шмелей B. terrestris с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;
-
получить гомогенный препарат СДГ из летательных мышц самцов шмелей и изучить физико-химические, кинетические и некоторые регуляторные свойства СДГ.
Научная новизна. Установлено, что сукцинат может выступать в качестве резервного субстрата дыхания при адаптации насекомых, в частности шмелей B. terrestris, к стрессовым факторам. Возможно, это обусловлено тем, что сукцинат является компонентом множества метаболических реакций. Это позволяет осуществлять гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторного фактора. Определен уровень продукции пероксида водорода при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания, произведена оценка % потребленного кислорода, который идет на выработку H2O2. Полученные данные о степени повреждения митохондриальной и ядерной ДНК из летательных мышц B. terrestris в модельном эксперименте показали возможность использования метода long range ПЦР для интегрального определения уровня повреждений, и вполне вероятно, для мониторинга репараций этих повреждений.
Выявлена обратная зависимость активности СДГ и концентрации глутатиона в процессе развития B. terrestris, что соответствует существующим представлениям об оксидативном статусе клетки и подтверждает роль глутатиона как маркера окислительного стресса. Показано, что во время продолжительной нагрузки наблюдается двукратное повышение удельной активности СДГ, трехкратное снижение активности АГ и 30% снижение концентрации восстановленого глутатиона в митохондриях летательных мышц B. terrestris.
Обнаружены различия в изоферментном составе СДГ между самками и самцами B. terrestris - у самок выявлена дополнительная изоформа СДГ в абдомене, возможно, участвующая в утилизации жирового тела, локализованного в данном отделе. Данная черта является отличительной для самок B. terrestris.
Впервые получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ из летательных мышц B. terrestris, охарактеризованы некоторые кинетические (константа Михаэлиса), физико-химические (молекулярная масса нативной молекулы и двух субъединиц фермента) и регуляторные свойств СДГ (влияние рН и солей), чувствительность к действию Н2О2. Проведен сравнительный анализ свойств СДГ B. terrestris с СДГ представителей других таксономических групп.
Практическая значимость.
Научно-практическая значимость полученных результатов состоит в первую очередь в диверсификации существующих представлений о путях превращения сукцината - использование в качестве резервного субстрата в условиях стресса - у насекомых и свойствах ферментной системы - сукцинатдегидрогеназы, участвующей в превращениях сукцината, обладающей рядом адаптационных преимуществ.
Постановка и оптимизация метода long range ПЦР показала возможность его использования для интегрального определения уровня повреждений, и вполне вероятно, для мониторинга репараций этих повреждений.
Наличие дополнительной изоформы СДГ в митохондриях самок шмелей B. terrestris поднимает спорный вопрос о функционировании глиоксилатного цикла в животных (Епринцев и др., 2005).
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии, молекулярной биологии, спецкурсов энзимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Положения, выносимые на защиту.
-
-
Сукцинат является резервным субстратом дыхания у насекомых при адаптации к стрессовым факторам, которым может являться продолжительный полет.
-
Митохондриальная ДНК насекомых более склонна к повреждениям, чем ядерная. Несмотря на наличие антиоксидантной системы и ферментов систем репарации, митохондрии не обеспечивают высокого, подобного ядерному, уровня защиты генома от АФК.
-
Выявлена динамика некоторых биохимических показателей в процессе индивидуального развития и во время продолжительного полета B. terrestris.
-
Обнаружена одна изоформа СДГ в митохондриях самцов шмелей, тогда как в митохондриях самок - две изоформы фермента, выполняющих, вероятно, различные метаболические функции.
-
Получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ из летательных мышц шмелей самцов, определены молекулярные массы нативной молекулы СДГ и двух субъединиц A и В, изучены некоторые кинетические и регуляторные характеристики фермента.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 13-ой, 14-ой международных Пущинских школах- конференциях «Биология - наука 21 века» (Пущино-на-Оке, 2009, 2010, 2012); на
3U U U "I U
-й международной научно-технической конференции инновационных технологий (Воронеж, 2009), XV, XLIX МЭСК «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010, 2011), Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных» (Махачкала, 2010), IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз России» (Воронеж, 2011).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 17 публикациях, из них 7 тезисов, 10 статей, 4 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (237 источников). Иллюстрационный материал включает 31 рисунок и 2 таблицы.
Похожие диссертации на Особенности организации и регуляции ферментативного окисления сукцината митохондриями летательных мышц Bombus terrestris (L.)
-
