Введение к работе
Несмотря на широкое распространение в растительном пире различаого рода физиологических заболеваний, их биохимическая природа еще мало изучена. Многие физиологические заболевания» внешне проявляющиеся в поборений тканей, служат причиной преждевременного старения и гибели растительных организмов. Примером может служить побуренае тканей сочных плодов (яблок, груд, айвы, цитрусовых плодов) во время их хранения. Таким образом, познание причин этих заболеваний тесно связано с изучением всего комплекса процессов, лежащих в основе старения растительных организмов*
Одним из наиболее распространенных физиологических заболеваний плодов, в частности, яблок является "загар", характеризующийся поверхностным побурением тканей, что сильно ухудшает внешний вид плодов, а при сильном развитии делает плоды непригодными к употреблению. Потери урожая плодов от этого заболевания весьма значительны.
Существуют разные точки зрения на происхождение "загара". Согласно одной из них. "загар" связан с некоторыми летучими веществами, выделяемыми самими плодами, к числу которых, в частности, относится фарнезен (Hueiin, Coggioia, 1968,1972), Другая точка зрения предполагает, что побуреяие тканей при развитии "загара" является следствием декомпенсации процессов окисления и восстановления фенолвных соединений (иетлицкий, Цехомская, 1958; Иетлицкий и др.. 1972). Остается, однако, неясным, что приводит к этой декомпенсации, и как происходит процесс побуреяия, если по имеющийся данным фенолы и фермент, их окисляющий, локализованы в клетке в разных органоидах.
В связи с тем, что плод гисхофиэиологически весьма разнороден, а заболевание начинается с локального ообурекия отдельных участков тканей, большое значение приобретает гистохимическое и глектронномикросхопическое изучение плодов, которое мохет дать более полное представление об обменных процессах,
тесно связанных с нарушениями в их структурной организации. Такой подход к изучению физиологических заболеваний плодов был уже частично использован в ряде работ (Fidler,i950fBsinf 1956; ВаШ,м»гсвг, 1963). но исследования, объединяющие эти два направления, по существу еще не проводились*
Целью настоящей работы было изучение особенностей поверхностных тканей плода яблони Fyme malue l. при созревании, старении и развитии "загара".
Мы поставили перед собой следующие задачи:
-
Изучить строение поверхностного покрытия яблок - кутикулы* в значительной степени определяющей газовый режим внутри плода.
-
Определить активность и локализацию некоторых окислительных ферментов: цитохромоксидазы, пероксидазы и полифенол-оксидазы, как показателей физиологического состояния тканей и клеток плода, а также установить изменения в величине внутриклеточного рВ, которая во многой определяет направление обменных процессов в плоде.
8. Изучить локализацию веществ полифенольной природы, участвующих в процессе побурения тканей плода.
-
Определить изменения в ультраструктуре клеток плода.
-
На основе полученных данных охарактеризовать те функциональные и структурные нарушения в отдельных клетках плода, которые приводят к побурешш тканей при развитии "загара".
* ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объект и методы исследования
В качестве объекта исследования служили плоды яблони руги» maiu» L., которые являются прекрасной моделью для изучения процессов старения, так как по существующим представлениям климактерический подъем дыхания плодов означает кульминацию процессов созревания и переход к старению. Для изучения были выбраны плоды яблони известного русского сорта Антоновка, -
которые уже в декабре-январе начинает поражаться "загаром". Плоды для опытов были получена из сада ВНИИ садоводства нечерноземвой полосы и на протяжении всей экспериментальное работы содержались в хранилище при t =. +4С. Исследование проводили в течение пяти сезонов с 1966 года По 1972 год. - В работе был использован ряд гистохимических методов и метод электронной микроскопии.
Для гистохимического изучения кутикулы яблок мы пользовались свежими срезами, окрашивал их растворами судана Ш и судана черного В. Кроме того, срезы, фиксированные 10%-нш формалином, окрашивали раствором нильского голубого.
Люнинесцентко-иикроскопнческэе изучение кутикулы проводилось на свежих срезах, обработанных следующими флзэрохро-ыаыи: фосфином 3r (I;10 000)» нильским голубым (1:10 000), нейтральніш краевым (1:10 000) и насыщенным раствором судана Ш. Флюоресценция возбуждалась синими лучами. Наблюдения проводили в люминесцентном микроскопе ШГ-І.
Для сравнительных измерений толщины кутикулы и воскезого слоя пользовалась как свежим материалом, так и материалом, фиксированным в смеси спирта с формалином. Срезы окрашивали раствором судава Ш. Измерения проводили с помощью окулярного микрометра. Средние величины выводили из расчета 40 измерений по каждому показатели. Результаты обрабатывали статистически, принимал вероятность безошибочного прогноза = 0,95. Определяли значения средних арифметических - /м/ и ошибку репрезентативности выборочного показателя — /п /. Высчитывали достоверность различий между вариантами (Плохинсхий, 1967).
Гнстохиинческя концентрацию водородных ионов (рН) определяли с помощью окрашивания индикаторными красками - нейтральным красным и метиленовим красным (Критиков. 1954). Значения рН получали на основании просмотра 10-15 срезов, взятых с разных плодов. ...
Для обнаружения веществ полкфенольной природы в тканях плодов пользовались нитрозореажцней (Джеясен. 1965). Контролем служили срезы с обратным порядком проведения иитрозореакуии.
- 6.-
Изучение окислительных ферментов проводили на свежих срезах. Для определения активности цнтохромокевдазы Сил использован метод Берсюна (Берстон, 1965; Дженсен, 1965). Перед проведением реакции на цитохроыокседазу срезы обрабатывали 0.02И раствором, диатилдитиокарбамата Ма (ДЭДТК) с целью ивгибирования полифенолоксидазы. В качестве контроля служили срезы, обработанные перед проведением реакции 0.005Ы растворам азида натрия, а также срезы, инактивированные нагреванием до SO0.
Активность пероксидазы определяли по широко распространенному бензидиновону методу (Бояркин, IS5I). Контрольные срезы перед проведением реакции обрабатывали 0,005м раствором азида натрия или инкубировали в реакционной смеси без перекиси водорода.
Для изучения полифенолоксидазы пользовались методом Бояркина (Бояркин, 1954). Е качестве контроля иелольэовались срезы, обработанные 0.02Ы раствором ДЭДТК натрия - специфическим ингибитором полифенолоксидазы, а также срезы, инактивированные нагреванием.
Для полуколичественной оценки активности окислительных ферментов время развития ферментативной окраски на срезах, выраженное в секундах (или минутах), оценивали по десятибаль-ной системе. Результаты обработаны статистически. По средним данным /м /, взятым из результатов, полученных в течение трех сезонов, строили графики изменений активности каядого фермента в процессе созревания, старения и при развитии "загара". На графиках показаны значений /га/.
При всех гистохимических процедурах препараты просматривали в микроскопе ЦБР и фотографировали с помощью шкрофото-насадки МФН-І2.
Для электронномикроскопического изучения тканей плодов материал фиксировали в 2,5-5/5-ноы глутаровом альдегиде, забу-Ференном 0.2Ы фосф&твш буфером с рН= 7,2-7,4. дофиксировали 2^-ныы раствором OSO4 и заключали в смесь бутил- и метил-иетакрвдатов (4:1). часть материала заключали в эпоксидную смолу
Зион-812. Срезы толщиной 300-400 А, изготовленные на ультрамвкротоме LKB , контрастировали по Рейнольдеу (Reynolds^ 1963). Изучение ультратонких срезов проводили на электронной микроскопе Jem - 5 с использование»! увеличении микроскопа от 10 000 до 30 000.
