Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ХРОМАТИНА ПРИ
СТАРЕНИИ /Обзор литературы/ II
1.1. Состав и структурная организация хроматина II
1.2. Возрастные изменения соотношений основных компонентов хроматина 20
1.3. Возрастные изменения структуры хроматина 22
1.4. Возрастные изменения гистонов и негистоновых белков хроматина 29
1.4. Возрастные изменения матричной активности хроматина 35
ГЛАВА II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
ГЛАВА III. СВОЙСТВА АКТИВНОЙ И НИЗКОАКШВНОЙ ФРАКЦИЙ ХРОМА
ТИНА ИНТАКТНОЙ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ 56
3.1. Макромолекулярный состав фракций хроматина печени взрослых и старых крыс 59
3.2. Физико-химические свойства фракций хроматина печени взрослых и старых крыс 66
3.2.а. Электрофоретический анализ бб
3.2.6. Термоденатурация 77
3.3. Включение меченого предшественника в РНК фракций хроматина печени взрослых и старых крыс 83
3.4. Обобщение результатов 85
3.5. Выводы 89
ГЛАВА ІV. СВОЙСТВА АКШВНОЙ И НИЗКОАКТИВНОЙ ФРАКЦИЙ ХРОМА
ТИНА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ 92
4.1. Зависимость уровня включения меченого предшественника в РНК хроматина от времени регенерации печени взрослых и старых крыс 96
4.2. Макромолекулярный состав фракций хроматина регенерирующей печени взрослых и старых крыс 100
4.3. Физико-химические свойства фракций хроматина регенерирующей печени взрослых и старых крыс 105
4.3.а. Электрофоретический анализ 105
4.3.6. Термоденатурация 109
4.4. Включение меченого предшественника в РНК фракций хроматина регенерирующей печени взрослых и старых крыс в период активации транскрипции 114
4.5. Обобщение результатов 117
4.6. Выводы 120
ГЛАВА V. СВОЙСТВА АКТИВНОЙ И НИЗКОАКТИВНОЙ ФРАКЦИЙ ХРОМАТИНА СЛИЗИСТОЙ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ 122
5.1. Макромолекулярный состав фракций хроматина слизистой тонкого кишечника взрослых и старых крыс 123
5.2. Физико-химические свойства фракций хроматина слизистой тонкого кишечника взрослых и старых крыс 129
5.2.а. Электрофоретический наллиз 129
5.2.6. Термоденатурация 134
5.3. Включение меченого предшественника в РНК фракций хроматина слизистой тонкого кишечника взрослых и старых крыс 139
5.4. Обобщение результатов 141
5.5. Выводы 144
- Состав и структурная организация хроматина
- ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Макромолекулярный состав фракций хроматина печени взрослых и старых крыс
- Зависимость уровня включения меченого предшественника в РНК хроматина от времени регенерации печени взрослых и старых крыс
- Макромолекулярный состав фракций хроматина слизистой тонкого кишечника взрослых и старых крыс
class1 ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ХРОМАТИНА ПРИ
СТАРЕНИИ /Обзор литературы/ class1
Состав и структурная организация хроматина
В развитии представлений о природе и механизмах старения в зчение последних 30 лет большая, а часто и определяющая роль от-одится молекулярным процессам, протекающим на уровне ядерного энома. Независимо от взгляда на процесс старения как на резуль-ат генетической программы /по аналогии с процессом развития/ или педствие накопления повреждений в молекулярных структурах клетки, Зъектом глубокого и всестороннего исследования является структу-а ядерного генома, количественные и качественные соотношения его омпонентов, его функциональные свойства и особенности регуляции ри старении /В.Н.Никитин, 1954, 1972, 1979; В.В.іролькис, 1970, Э77; Б.&.Ванюшин, Г.Д.Бердышев, 1977; strehier , 1961; Curtis , Э64; Hahn , 1970; Cutler , 1972; Канунго, 1982 и др./.
Следует отметить, что основные направления исследований в об-асти молекулярной геронтологии были тесно связаны с успехами и остижениями фундаментальных основ молекулярной биологии. Поэтому олее ранние исследования были направлены на изучение возрастных собенностей структуры ДНК. В более поздних работах основное вни-ание уделялось изучению взаимодействия ДНК и белков, которые ор-анизованы в ядре в единый функционирующий комплекс - хроматин, ба эти направления развиваются и в настоящее время.
Хроматин эукариот представляет собой сложноорганизованную адмолекулярную структуру. В основе ее лежит двухцепочная молеку-а ДНК, которая связана с более или менее регулярно повторяющими-я комплексами катионных белков /гистонами/, а также с целым ря-ом других белков /негистоновые белки/, с РНК и липидами. Органи -12 щия и взаимодействие структурных компонентов хроматина обеспе-івает очень плотную паковку ДНК, защиту ее от повреждающих воз-зйствий, избирательную транскрипцию одних генов и репрессию дру-лх, определенную последовательность репликации, процессов, связанное с митозом и т.д.
Объект и методы исследования
Анализ данных литературы, представленных в предыдущей главе, зидетельствует о том, что при старении происходит изменение соот-шюний и взаимодействия основных компонентов, а также матричной [тивности хроматина, представляющего собой функционирующий комп-зкс генетического аппарата клетки.
Эффективность процессов, протекающих на уровне ядерного гено-i - регуляции и передачи генетической информации - в значительной jpe определяется особенностями структурной организации хроматина, )т почему изучение связи возрастных изменений структуры и функции юматина представляется важным для выяснения молекулярных механиз-)в старения.
При исследовании возрастных особенностей состояния хроматина шдует учитывать два момента. Первый связан с функциональной ге-зрогенностью хроматина: почти во всех клетках эукариот хроматин зедставлен двумя фракциями - активно транскрибируемой и репресси-)ванной. Второй - с тканевой специфичностью функции хроматина: все іетки организма содержат одинаковую ДНК, но синтезируют только те элки, которые необходимы для функции данной ткани.
Сравнительное изучение активной и низкоактивной фракций хро-ітина клеток различных тканей может способствовать выяснению об-ЇХ закономерностей и специфических особенностей перестройки хрома-ша при старении, а также роли разных тканей в развитии процесса дарения. Одним из подходов к такого рода исследованиям может быть завнительное изучение хроматина тканей с различной митотической стивностью. Следует отметить, что вопрос о значимости возрастных шенений различных по степени митотической активности клеточных пуляций в процессе старения целостного организма является пред-этом дискуссий и, по-существу, не разрешен до настоящего времени. гак, на основании вьшеизложенного, была сформулирована цель насто-цего исследования, которая состояла в сравнительном изучении груктурно- функциональных характеристик активной и низкоактивной эакций хроматина тканей с различной митотической активностью при гарении. Фракции активного и низкоактивного хроматина получали из цер следующих тканей:
1. Интактная печень - ткань с низкой митотической активно-гью.
2. Регенерирующая печень - ткань со стимулированной клеточной ролиферацией.
3. Слизистая тонкого кишечника - митотически активная ткань.
Выбор тканей диктовался следующими соображениями.
В соответствии с современными представлениями печень занимает дно из центральных мест в регуляции метаболизма и функций всего рганизма. Значимость печени в поддержании гомеостаза организма пределяется многообразием процессов, протекающих в клетках этой кани. К ним относятся: I/ превращения углеводов, жиров, аминокис-от ; 2/ синтез белков плазмы крови, компонентов свертывающей и ибринолитической систем крови; 3/ синтез желчных кислот и били-убина; 4/ биохимические процессы, связанные с детоксикационной ункцией печени и т.д.
class2 СВОЙСТВА АКТИВНОЙ И НИЗКОАКШВНОЙ ФРАКЦИЙ ХРОМА
ТИНА ИНТАКТНОЙ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ class2
Макромолекулярный состав фракций хроматина печени взрослых и старых крыс
В экстрагированных раствором низкой ионной силы фракциях хро-ітина печени взрослых /6-8 мес. /и старых /24-26 мес/ крыс оп-эделяли содержание ДНК, РНК, суммарных гистонов и негистоновых злков, Для сравнительной оценки количественного состава фракций удержание определяемых компонентов рассчитывали по отношению к Ж.
Значительная часть хроматина печени взрослых и старых крыс эедставлена низкоактивной фракцией. Для этой фракции характерно эвысокое содержание РНК и белка. В активном хроматине взрослых ивотных соотношение РНК/ДНК в 7,4, белок/ ДНК в 2,9 раз выше, чем низкоактивном. У старых животных в активной фракции хроматина эотношение белок/ДНК в 3,8, РНК/ДНК - в 10,3 раза выше, чем в язкоактивной.
Приведенные данные совпадают с аналогичными характеристиками ракций неактивного и активного хроматина, выделенных с помощью эугих методических приемов из различных тканей /см.табл.3.1/.
Из данных таблицы видно, что фракции хроматина печени сущестнно отличаются по содержанию в них гистонов и негистоновых бел-эв. Отношение гистон/ДНК в активном хроматине в 1,5 и 1,7 раза, негистон/ДНК в 3 и 2,6 раза выше, чем в низкоактивном /соответ-рвенно у взрослых и старых крыс/. Этот результат соответствует анным об обогащенности активного хроматина белками. Неожиданным казалось высокое отношение гистон/ДНК в активном хроматине. Обыч-э это отношение в тотальном хроматине приближается к единице, а активном хроматине или несколько ниже, или такое же как и в низ-эактивном. Полученные нами данные, напротив, свидетельствуют о зачительном обогащении активного хроматина гистонами. Объяснить РОТ результат представилось возможным; при электрофоретическом раз-элении препарата тотальных гистонов, значительную часть которого, 1к оказалось, составляют кислоторастворимые негистоновые белки 5олее детально данные электрофореза будут рассмотрены ниже/.
Анализ полученных данных позволил установить ряд возрастных зманений свойств активного и низкоактивного хроматина. Прежде все-э следует отметить, что с возрастом происходит перераспределение рносительного содержания фракций хроматина, рассчитываемого в про-энтах от суммарной ДНК хроматина, В хроматине старых животных до-говерно увеличивается доля низкоактивной фракции и, соответствен-э, снижается содержание активной.
class3 СВОЙСТВА АКШВНОЙ И НИЗКОАКТИВНОЙ ФРАКЦИЙ ХРОМА
ТИНА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ class3
Зависимость уровня включения меченого предшественника в РНК хроматина от времени регенерации печени взрослых и старых крыс
Необходимость исследования динамики включения меченого пред-іественника в РНК фракций низкоактивного и активного хроматина ізросльк и старых крыс в процессе регенерации печени была вызвана деумя причинами. Во-первых, по данным разных авторов, время достижения клетками печени второго /основного/ максимума синтеза РНК іесколько варьирует /от 12 до 18 часов после частичной гепатэкто-ши/ в зависимости от условий эксперимента. Необходимо было опре- лить время максимального включения меченого предшественника в НК фракционированного хроматина регенерирующей печени в применя-)мых нами экспериментальных условиях.
Во-вторых, исходя из данных о возрастных сдвигах максимума юпликативной активности и митотической активности, можно было жидать изменения с возрастом времени достижения максимума включе-іия меченого предшественника в РНК.
Увеличение включения меченого предшественника в РНК активно-о и низкоактивного хроматина печени крыс обеих возрастных групп происходит в период 12-18 часов, достигая максимального значения іерез 15 часов после операции /рис.4.1/. Параллельно изменениям шлючения метки в РНК в регенерирующей печени обеих возрастных рупп происходит перераспределение фракций хроматина, определяе-юе в процентах от тотальной ДНК хроматина /рис.4.2/, Однако в іериод, соответствующий s и G2 фазе /22-30 часов/ это соответ-їтвие нарушается: включение предшественника в РНК продолжает снижаться, а относительное содержание фракции активного хроматина шачительно увеличивается к 30 часам после частичной гепатэкто-лии. К этому же времени снижается содержание белка во фракции активного хроматина /отношение белок/ДНК составляет 5,1+0,2 в ин-актной печени, 3,3+0,5 через 30 часов регенерации/. Снижение включения метки в РНК и снижение содержания белка в активном хроматине вполне закономерны и связаны со структурной перестройкой хроматина в период подготовки клеток к делению. Причина увеличенного зодержания фракции активного хроматина печени в этот период неяс-яа. Возможно, это связано с тем, что максимальное перераспределение хроматина наблюдается в период, когда произошло удвоение D.HK, но еще не завершился процесс организации хромосом. Кроме то-ро, в период подготовки клеток к делению, активируется новая популяция гепатоцитов /начало второй волны пролиферации /Г.Г.Ревич и соавт., 1975/, что может обусловить обнаруженные изменения хроматина ,
Макромолекулярный состав фракций хроматина слизистой тонкого кишечника взрослых и старых крыс
При фракционировании хроматина для отделения фракции актив гаго хроматина от ядерного осадка используется обработка ультра вуком. В хроматине слизистой тонкого кишечника ультразвуковое юздействие вызывало деградацию активного хроматина до кислото астворимых фрагментов. Поэтому возникла необходимость подобрать іолве мягкие условия отделения активного хроматина от ядерного юадка. По данным Pomerai et ai. /1975/, сравнивавших различные ютоды выделения хроматина в плане максимальной сохранности его труктуры и матричной активности, наиболее щадящее действие ока ывала обработка ядер раствором низкой ионной силы, содержащим p 0,05/ ниже, а содержание белка /отношение белок/ДНК/ и РНК РНК/ДНК/ выше в обеих фракциях хроматина слизистой /рис.5.1/,
В активном хроматине слизистой, как и в печени, отношение ислоторастворимых белков к ДНК выше единицы, что обусловлено вы-оким содержанием примеси кислоторастворимых негистоновых белков.
Таким образом, низкоактивной и активной фракциям хроматина лизистой тонкого кишечника свойственны признаки, характерные и ля хроматина печени: незначительная доля активной фракции, обога-енность этой фракции РНК, суммарным и кислоторастворимым белком о сравнению с низкоактивной. Однако количественные характеристики ракций хроматина слизистой и печени различаются.
Похожие диссертации на Возрастные особенности хроматина тканей с различной митотической активностью
