Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Механизм каталитического действия витамина В 10
1.2. Влияние различных АТР:фосфотрансфераз и фосфатаз на метаболизм витамина Вт и его фосфорилированных производных 18
1.3. Транспорт биологически активной формы витамина B 24
1.4. Структурные аналоги витамина B в исследовании тиаминзависимых ферментативных систем 26
ГЛАВА 2. Методы исследования
2.1. Обоснование методов получения и идентификации фосфорилированных производных тетрагидротиамина 31
2.2. Обоснование методов изучения антивитаминной активности тетрагидротиамина и его фосфорилированных производных 34
2.3. Другие методы исследования 37
ГЛАВА 3. Получение, физико-химическая, токсикологическая характеристика тетрагидротиамина и его фосфорилированных производных 40
ГЛАВА 4. Тиаминзависимые формы, уровень свободной и коферментной форм витамша В при исследовании антивигаминных свойств тетра-гидротиамина и его ированных производных
4.1. Зависимость от дозы и длительности действия 56
4.2. Влияние способа введения исследуемых препаратов 64
4.3. Последействие высоких доз тетрагидротиа-мина, его монофосфорного и дифосфорного эфиров при подкожном введении 88
4.4. Антикоферментное действие тетрагидротиа-миндифосфата на пируватдегидрогеназный комплекс из митохондрий коры надпочечников быка 104
4.5. Тетрагидротиаминтрифосфат - новый антивитамин витамина B 106
Заключение
Выводы
Список использованной литературы 120
Приложение 139
- Влияние различных АТР:фосфотрансфераз и фосфатаз на метаболизм витамина Вт и его фосфорилированных производных
- Структурные аналоги витамина B в исследовании тиаминзависимых ферментативных систем
- Обоснование методов изучения антивитаминной активности тетрагидротиамина и его фосфорилированных производных
- Последействие высоких доз тетрагидротиа-мина, его монофосфорного и дифосфорного эфиров при подкожном введении
Введение к работе
Современные методы исследования экспериментальной витаминологии, химиотерапии невозможно представить без использования структурных аналогов природных физиологически активных соеди -нений.
Значительную группу подобных соединений представляют собой антивитамины, В клинике успешно применяются метатрексат, дику-марол, сульфаниламиды и другие высокоэффективные терапевтические препараты, созданные на антивитаминной основе (Островский, 1983).
Антивитаминные производные витамина Bj ампрол и хлоротиа-мин используются в ветеринарии для лечения кокцидиозных состояний у домашних животных (Труфанов, 1972).
Другие производные тиамина окситиамин и пиритиамин применяются в экспериментальной витаминологии для моделирования Bj-авитаминозных состояний (Островский, 1979).
Структурные изменения молекулы витамина Bj придают ей специфические антивитаминные свойства, позволяющие использовать их для направленного изучения тиаминзависимых ферментативных систем. Поиск подобного рода соединений актуален в плане дальнейшего развития представлений о механизмах тиаминового катализа, строении и функциях тиаминовых ферментов, изыскания новых возможных путей регуляции обмена веществ с участием витамина Bj в организме животных и человека.
Особенно остро в настоящее время стоит вопрос исследования Bj « патологических состояний у людей. Ряд "болезней цивилизации" - неврозы, тучность, ожирение, ранний атероскле -роз, гипертония, ишемическая болезнь сердца, алкоголизм, рас-
стройство функций органов пищеварения сопровождается Вт-ави-таминозным фоном.
Тиаминовый катализ главным образом определяется функциональным состоянием тиазоловой части молекулы витамина Вт (Островский, 1975). Гидрирование тиамина по 2, 3 и Ч, 5-двой -ным связям тиазолового кольца, естественно, приводит к каталитически неактивному производному витамина Вт-тетрагидротиа-мину (Пюльман Б., Пюльман А., 1965). Синтез тт осуществлен в 1957 году ( Bonvicino , Hennessy ). В опытах с меченым по сере тт (0,5 мг/кг) на крысах показано интенсивное выведение данного аналога витамина Вт в мочу через 0,5 часа после подкожного введения (Островский, Доста, 1967). Сочетанная подкожная инъекция животным меченого Bj и 10-кратного количества немеченного тт приводила к накоплению радиоактивной метки через І час в печени и почках (Островский, Доста, Садовник, 1970). Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии связывания тт , его влияния на механизмы физиологического транспорта и эксреции витамина Bj в организме животных. Величина активностей TDP -зависимых ферментов, уровень кофермент-ной формы витамина в тканях животных в обоих случаях не определялись.
Позднее была найдена причина индифферентности тт к распределению в различных тканях животного - препарат не взаимодействовал с атр :тиаминпирофосфотрансферазой (КФ 2.7.6.2.), (Воскобоев, Черникевич, Островский, 1976). Это исключало возможность связывания данного соединения в виде антикофермент-ного аналога.
В свою очередь исключались и эффекты тт на путях неспе-
цифического связывания витамина Bj за счет тиол-дисульфидных превращений (Оотровский, Доста, Садовник и др., 1970).
Тем не менее, 0-дифосфорный эфир тт на очищенных из дрожжей апоферментных белках пируватдекарбоксилазе (КФ 4.I.I.I.), ( Wittorf , Gubler , 1971) и транскетолазе (КФ 2.2.I.I.) ( Heiniich , Steffen , Janser a.oth. , 1972, Heinrlch, Schmidt , Noack , 1974) зарекомендовал себя как конкурентный ингибитор с аномально высоким сродством по сравнению с
OTDP , ptdp и 0-дифосфорными эфирами других различных производных витамина Bj.
Антивитаминные свойства ttdp, его метаболитов - ттмр» нефосфорилированного тт , более фосфорилированного производного 0-трифосфорного эфира тт , в условиях целостного организма с определением активности основных тиаминзависимых ферментных систем и уровня коферментной формы витамина Bj в тканях животных до сих пор не исследовались.
Целью настоящего исследования было сравнительное изучение антивитаминной активности тт и его фосфорилированных производных.
В связи с вышеизложенным задачами настоящей работы были:
препаративное получение, доказательство структуры 0-фоефор-ных эфиров тт, характеристика основных физико-химических и фармакологических свойств tt,ttmp,ttdp,tttp.
изучение антивитаминных свойств тт,ттмр,ttdp,тттр в условиях работы на животных через антикоферментную активность исследуемых соединений по отношению к тиаминзависимым ферментам - транскетолазе, пируватдегидрогеназе, с -кетоглутарат-дегидрогеназе и уровню свободной и коферментной формы витами-
на в тканях.
В результате изучения влияния тт и его фосфорилирован-ных производных на активность Bj-зависимых ферментов решена одна из актуальных задач современной биологической химии -изыскание химических соединений, обладающих Вт-антивитамин-ной активностью по отношению к тиаминовым ферментам в тканях животных, и тиаминзависимым ферментативным препаратам из животных тканей.
Научно-практическое значение полученных результатов состоит в следующем:
- 0-фосфорные эфиры тт впервые получены в препаративных
количествах и охарактеризованы как индивидуальные химические
соединения, определены их основные физико-химические и фар -
макологические параметры;
- показана неперспективность использования тт,ттмр и
ttdp в качестве антивитаминов тиамина при работе на живот
ных в области экспериментальных Вт-витаминологических иссле
дований (изучение транскетолазы, пируватдегидрогеназы, <* -ке-
тоглутаратдегидрогеназы, уровня свободной и коферментной форм
тиамина в тканях);
- впервые определена антивитаминная активность 0«дифос-
форного эфира тт на тиаминзависимом ферменте животного про
исхождения - пируватдегидрогеназном комплексе, выделенном
из митохондрий надпочечных желез крупного рогатого скота; ttdp рекомендуется к использованию в исследовании тиаминза-висимых ферментативных препаратов животного происхождения;
- О-трифосфорный эфир тт охарактеризован как новый анта
гонист витамина Bj (Авторское свидетельство СССР № 792893),
обладающий рядом преимуществ по сравнению с известными антивитаминами тиамина - окситиамином и пиритиамином; препарат рекомендуется для специфических исследований тиаминзависимых ферментных систем в условиях работы на животных,
тт и его фосфорилированные производные широко используются в институте биохимии им.А.В.Палладина АН УССР при изучении механизмов регуляции активности пируватдегидрогеназного комплекса и механизмов взаимодействия производных тиамина с возбудимыми мембранами животных клеток, в экспериментальной практике Отдела регуляции обмена веществ АН БССР г.Гродно при исследовании выеокоочищенных дегидрогеназных систем 2-оксо-кислот надпочечных желез крупного рогатого скота, уровня кофер-ментной формы витамина Bj, уровня эндогенного эталона, при изучении обмена липидов у белых крыс.
Положения, выносимые на защиту:
- получение, идентификация 0-фосфорных эфиров тт , основ
ные физико-химические и фармакологические параметры тт,ттмр,
TTDP,TTTP;
отсутствие выраженных антивитаминных свойств у тт ,ттмр, TTDP при различных экспериментальных условиях на животных;
антивитаминное действие ttdp на пируватдегидрогеназ-ный комплекс, выделенный из митохондрий коры надпочечников крупного.рогатого скота;
антивитаминные свойства тттр , квалифицирующие 0-три-фосфорный эфир тт как новое химическое соединение, обладающее Вт-антивитаминной активностью.
Влияние различных АТР:фосфотрансфераз и фосфатаз на метаболизм витамина Вт и его фосфорилированных производных
Неспецифическая щелочная нуклеозидтрифосфатаза печени, кишечника (КФ 3.6.1.15.) гидролизует как ТТР , так и TDP (Hashitani .Cooper , 1972, Penttinen , Uotila , 1981). TTP - - TDP + орто-фосфатион Фермент находят в различных органах животных, но изучен он недостаточно полно. ТТР , как и другие нуклеозидтрифосфаты, гидролитически расщепляются в мозгу, сердце, печени, легких, мышцах, селезенке и кишечнике крыс неспецифической щелочной фосфатазой (КФ 3.I.I.I.), ( Penttinen , Uotila , 1981). Специфическая тиаминтрифосфатаза (КФ 3.6.1.28.) найдена в мозгу, печени и других тканях животных, но в достаточно очищенном состоянии от сопутствующих фосфатаз фермент выделен из мозга крыс ( Penttinen , Uotila , І98І). Как известно, процессы возбуждения в нервной системе сопровождаются активным функционированием фосфатов (Диксон, Уэбб, 1982, с.330), что относится и к фосфатазам, участвующим в расщеплении ТТР. Так, содержание прочно связанного с мембранами головного мозга ТТР ( Itokawa , Schulz » Cooper » 1972) при возбуждении нерва резко падает при одновременном увеличении количества менее фосфорилированных форм витамина Вj ( Cooper , Pincus , 1979). Другим интенсифицирующим фактором действия ферментов катаболизма тиаминфосфатов является содержание животных на тиаминдефицитной диете (Рыбина, Пархоменко, Полыцак, 1978). Таким образом, в метаболизме Bj и его фосфоротированных производных принимают участие различного рода АТР :фосфотранс-феразы и фосфатазы. Некоторое целостное представление о циркуляции витамина Bj в организме животных с участием обсуждаемых выше ферментов можно получить при рассмотрении судьбы ТТР , инкубированного с отрезком тощей кишки крыс» (Тоцкий, Халмурадов, 1980). За I час инкубации около Н$ТТР проникает в серозный отсек кишечника посредством пассивной диффузии. Большая часть его в мукозной жидкости подвергается ферментативному расщеплению фосфатазами до свободного Т , который транспортируется белками-переносчиками в энтероциты, а оттуда - в серозную жидкость и кровь. Откуда витамин быстро проникает в печень и другие органы, фосфорилирующие т. с помощью АТЕфоефортрансфе-раз до TDP и ТТР. Часть свободного т из печени высвобождается в желудочно-кишечный тракт вместе с желчью, завершая циркуляцию витамина в животном организме ( Gassman , &etz , Haelnel , 1963, Розанов, Карпов, Коваль и др., 1970, Тоцкий, Халмурадов, 1980). TDP, образованный в гиалоплазме печени, транспортируется к внутренней мембране митохондрий печени - месту локализации дегидрогеназ 2-оксокиолот. При объяснении механизма переноса TDP пересекаются отдельные мнения, в связи с чем вопросы транспорта т 9 антиви таминов т и их фосфорилированных производных остаются до сих пор открытыми. Прохождение мембран гепатоцитов тиаминдифосфатом сопровождается полным гидролизом введенного животным 0-дифоефор-ного эфира витамина (Воскобоев, Островский, 1983). Витамин Вр представленный в пище фосфорилированными формами, почти полностью дефосфорилируется пищеварительными ферментами до свободного Вт, который с помощью белков-переносчиков всасывается из тонкого кишечника (Тоцкий, Халмура-дов, 1980). По всей видимости, нельзя отождествлять транспорт тиамина с его фосфорилированием (Komai , Shindo , 1972, Аверин, Воскобоев, 1982). Принимая во внимание данную точку зрения, нельзя объяснить присутствие внутри просвета кишечника преимущественно фосфорилированных производных тиамина ( Rindi , Ferrari , 1977). В ряде случаев проникновение TDP в клетку без дефосфори-лирования объясняется функционированием транспортных белков (Рыбина, Пархоменко, Чаусовский, 1974, Леус, 1974, Карпов, Розанов, 1977). Белки, транспортирующие витамин Вр выделены nsBsheri-chi a coli (Nishimune ,Hayashi , 1971), дрожжей (iwashima, Nishino , Nose , 1979), низших организмов (Рыбина, Халмура-дов, Пархоменко, 1980), куриного белка (Muniappa , Adida , 1980). Для высших организмов белковые переносчики витамина Bj и его фосфорилированных производных не найдены. Таким образом, в мембранном транспорте фосфорнокислых производных т (а равно и фосфорилированных производных антивитаминов) отмечается существование двух, исключающих друг друга возможностей, - дефосфорилирование фосфатов Bj и их прохождение в нативном виде за счет белковых переносчиков. В экспериментальной витаминологии при моделировании Вт-авитаминозных состояний применяются аналоги тиамина (Островский, 1979). Структурные формулы двух важнейших антивитаминных производных витамина Bj ОТ ( Rydon , 1951) и РТ ( Tracy , Eiderfield , 194%) изображены на схеме 3. ОТ (100-400 мг/кг) вызывает у животных быстрое появление (3-24 часа) биохимических признаков тиаминового авитаминоза - торможение активности дегидрогеназных комплексов 2-ок-сокислот на 50-85 процентов (Островский, Горенштейн, Караедо-ва и др., 1981), угнетение активности транскетолазы тканей животных на 2-3 сутки после введения препарата (Островский, Воскобоев, Горенштейн и др., 1979). от не проникает через гематоэнцефалический барьер (Островский, 1965). Сродство ОТ к АТР:тиаминпирофосфотрансферазе печени животных в 1000 раз меньше, чем у т (Арцукевич, Воскобоев, Островский, 1977), что определяет применение этого антивитамина в достаточно высоких дозах, - до 200 мг/кг и выше (крысы, голуби, мыши) без неврологических симптомов, сопутствующих Вт -недостаточности у млекопитающих. РТ , проникая в мозг (Горенштейн, Островский, Гриценко, 197), способствует развитию паралитической формы бери-бери у животных. Прочность связывания РТ АТР:тиаминпирофосфотрансферазой настолько велика (Арцукевич, Воскобоев, Островский, 1977), -что образующийся в ходе ферментативной реакции PTDP блокирует фермент, препятствуя дальнейшей наработке т .
Структурные аналоги витамина B в исследовании тиаминзависимых ферментативных систем
Испольээовался комплексный подход, учитывающий одновременно содержание свободного и общего тиамина в тканях, а также активность TDP -зависимых ферментов - транскетолазы, пиру-ватдегидрогеназы и о( -кетоглутаратдегидрогеназы (Островский, 1979).
Свободный тиамин определялся в безбелковом экстракте ткани методом окисления его феррицианидом калия в тиохром (щелочная среда). Образовавшийся тиохром экстрагируется изо-бутиловым спиртом и количественно определяется по интенсивности флюоресценсии на флюориметре (Елисеев, 1953).
Для определения общего тиамина необходимо разрушить все содержащиеся в ткани фосфорные эфиры витамина Bj до свободной формы с помощью ферментативного препарата фосфатаз из Aspergillus niger Дальнейший ход определения тот же.
Содержание общего и свободного тиамина рассчитывается по калибровочному графику и выражается в мкг тиамина на I грамм ткани. Метод высокочувствителен ( . I мкг Вт). Принцип определения величины активности транскетолазы из соответствующим образом разведенных гомогенатов тканей и гемолизата крови (Табл.1) заключается в колориметрическом ( Л = 625 нм) измерении интенсивности окраски цветного комплекса орцина и оксиэтилфурфурола ( Brims , Dunnwald ,Noltmann, 1958). Последний образуется при дегидратации седогептулозо-7-фосфата соляной кислотой. Метод точен и высокоселективен по отношению к седогеп-тулозо-7-фосфату в присутствии избытка многих других биологически активных фосфосахаров. Величина активности фермента рассчитывается согласно калибровочному графику, построенному по ангидриду седогептуло-зы, и выражается в мкмолях седогептулозо-7-фосфата на грамм ткани в час, или мкмоль седогептулозо-7-фосфата на грамм гемоглобина в час для крови. Гемоглобин крови определяется колориметрически (Л =540нм) по оксигемоглобину (Покровский, 1969). Количество гемоглобина выражается в граммах. Активность дегидрогеназ 2-оксокислот в тканях животных изучается из гомогенатов мышц (Хайлова, Фейгина, Северин, 1973), мозга (Оабаляускене, Глемжа, 1976, Островский, 1979), печени,- почек,. сердца (Островский, 1979), митохондрий печени (Островский, 1979). Величина активности ферментов U -кетоглутаратдегидроге-назы и пируватдегидрогеназы из гомогенатов тканей определялась нами по общепринятой в данном случае методике с использованием феррицианида калия ( Gubler , 1961). При окислении пировиноградной или 2-оксоглутаровой кислот гомогенатами тканей феррицианид калия ( к3?е(си)6 ) восстанавливается в ферроцианид ( K4Pe(CN)6 ). Величину активностей ферментов определяют спектрофотомет-рически по убыли оптической плотности (Я =417 нм) и выражают в мкмолях восстановленного феррицианида калия на I грамм белка за 20 минут при 25С. Калибровочный график для о -кетоглутаратдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы одновременно строится по величинам оптических плотностей проб, содержащих известные количества ферринианида калия и остальных компонентов инкубационной смеси, за исключением субстратов пировиноградной и 2-оксоглута-ровой кислот. Белок определяется колориметрически С Л = 750 нм) по биуретовой реакции (Lowry .Rosenbrougch ,Parr a.oth. , 1951). Количество белка выражается в граммах и рассчитывается из калибровочного графика, построенного по сывороточному альбумину. Пируватдегидрогеназный комплекс коры надпочечников быка выделялся из митохондрий надпочечных желез крупного рогатого скота (Струмило, Сенкевич, Виноградов, 1980), очищался от эндогенного TDP до 1% остаточной активности и рекомбиниро-вался с 0-дифосфорным эфиром тт . Скорость ферментативной реакции пируватдегидрогеназного комплекса оценивалась по восстановлению HAD при 340 нм и 30 С на спектрофотометре UV Vis Specord . Константа ингибирования TTDP -ом активности митохонд-риального пируватдегидрогеназного комплекса коры надпочечников крупного рогатого скота рассчитывалась графическим методом (Диксон, Уэбб, 1982, с.481). Данный экспериментальный этап проведен совместно с младшим научным сотрудником 0Р0В АН БССР Сенкевичем СБ. Токсичность препаратов выражалась значениями ы и рассчитывалась в мг химического соединения на I кг веса животного. Белым разнопородным мышам обоего пола весом 18-20 г однократно внутрибрюшинно вводились разные количества IT,TTMP, TTDP ,ТТТР в объеме 0,2 мл водного раствора с рН 5,0-6,0. Для тт наряду с внутрибрюшинным применен подкожный способ введения. С каждым препаратом исследуются 7 доз, на каждую дозу используется по б животных. На изучение токсичности тт и его фосфорилированных производных израсходовано 168 животных. Цифровые данные обрабатывались по методу Литчфильда и Уилкоксона (Беленький, 1963). С целью оценки вклада фосфорнокислых групп фосфатов в фармакологическое действие препаратов нами введен критерий молярной токсичности ( LD50 : Мол.вес). В эксперимент по определению влияния исследуемых препаратов на величину активноотей транскетолазы, пируватдегидро-геназы, о( -кетоглутаратдегидрогеназы, уровня свободного и общего тиамина в тканях брались белые разнопородные мыши обоего пола весом 18-20 г. Контрольные и опытные животные содержались одинаково в виварии на стандартном рационе. В контрольной и опытной группах находилось по 7 животных. Животные забивались декапитацией. Исследуемые ткани гомогенизировались на холоде (0С) с 0,85$ раствором хлористого натрия при определении активности транскетолазы в печени, почках, селезенке, сердце, скелетной мышце, мозгу.
Обоснование методов изучения антивитаминной активности тетрагидротиамина и его фосфорилированных производных
ТТМР -не влиял подобно тг на уровень свободного тиамина в печени (Табл.23), увеличение активности дегидрогеназ-2-оксокислот в печени через I час после введения препарата не наблюдалось (Табл.22), стимуляция активности транскетолазы в печени (I час) незначительна (Табл.24). К 12 часам уровень общего тиамина в печени ниже контрольного на 29$ (Табл.23). К первым суткам действия препарата снижена транс-кетолазная активность не только в печени (на 17$), но и в других тканях (почки, сердце), крови (Табл.24); угнетена активность дегидрогеназ-2-оксокислот в печени (Табл.22), -кетоглутаратдегидрогеназы в мозгу (Табл.22).
TTDP через I и 24 часа после подкожного введения вызывает уменьшение активности транскетолазы в печени (Табл.25). К 12 часам опыта величина активности фермента в данной ткани соответствует контрольным значениям, в то же время в крови наблюдается увеличение величин транскетолазнои активности на 28$, в мозгу - на 16$, в селезенке - на 10$ (Табл.25).
В целом, первые сутки после введения препарата характеризуются увеличением активности транскетолазы крови при пониженном уровне общего тиамина в печени. Статистически определен коэффициент корреляции двух указанных переменных: г -0,99+0,08, Р 0,0001, свидетельствующий о "девитамини-зирующем" действии TTDP в короткие сроки опыта на ткань печени.
Уровень общего тиамина в печени падает на 24% к 12 часам (Табл.16), к этому же сроку снижается активность с -кето-глутаратдегидрогеназы печени на 21$. Однако, к 24 часам активность о -кетоглутаратдегидрогеназы увеличивается на 28$ по отношению к контрольному значению (Табл.22).
Столь резкие колебания активностей дегидрогеназ 2-оксо-кислот под воздействием введенных препаратов не обязательно связаны с уровнем кофермента в тканях, - они могут быть результатом влияния исследуемых соединений на соотношение активной и неактивной форм о( -кетоглутаратдегидрогеназного (Северин, Гомазкова, Красовская и др., 1978), и пируватдеги-дрогеназного комплексов (Струмило, Сенкевич, Виноградов, 1981). Основанием к такому выводу является зависимость величины активности аденозинтрифосфатазы (КФ 3,6.1.3.) от тт. (Галицкий, Островский, 1968). Фермент участвует в окислительном фосфорилировании митохондрий; как и у пируватдегид-рогеназного комплекса (Гл.1), процессы дефосфорилирования и фосфорилирования определяют состояние активности энзима (Райхман, Машковский, 1975).
Возвращаясь к общей оценке данной серии экспериментов, следует подчеркнуть, что увеличение дозыТТ и его производных до 400 мг/кг в короткие сроки опыта при одном способе введения (подкожном) позволило определить вероятный вклад фосфорнокислого остатка в антивитаминное действие фосфорнокислых производных тт на фоне их вмешательства в механизмы физиологического транспорта и эксреции самого витамина.
В ряду TTTMPTDP способность стимулировать ферментативную активность транскетолазы, пируватдегидрогеназы и оС -кетоглутаратдегидрогеназы уменьшается от тт к TTDP а с увеличением фосфорнокислого радикала и времени опыта незначительно, но нарастают антивитаминные эффекты (Табл.26).
Короткие сроки опыта при введении больших доз препаратов разными способами создают различные варианты проявления антивитаминных свойств тт и его производных: из трех препаратов более заметным антивитаминнын действием при внутриже-лудочном введении обладает тт , при внутрибрюшинном - ТТМР при подкожном - TTDP.
Первый препарат, не фосфорилируемый АТР :тиаминпирофос-фотраноферазой (Воскобоев, Черникевич, Островский, 1976) и как более гидрофобный конкурент Вх при пассивной диффузии через слизистую кишечника, по-видимому, вмешивается только в механизмы всасывания Bj из кишечника, физиологического транспорта и оксреции витамина.
Второй - ТТМР,проявляет себя при внутрибрюшинном введении как возможный конкурент ТМР в крови, т.е. на этапах межорганного транспорта витамина (ТоцкиЙ, Халмурадов, 1980).
Наконец, результаты с TDP позволяют думать, что незначительная часть препарата без гидролиза до тт и ТТМР , как и в некоторых случаях с TDP (Леус, 1974, Карпов, Розанов, 1977), все же достигает уровня апоферментных белков. Малая эффективность тт и его фосфорных эфиров как антиметаболитов тиамина в предыдущих условиях эксперимента, побудила нас перейти к введению больших количеств исследуемых соединений на более длительные сроки действия.
Как уже указывалось (Гл.І), в механизмах транспорта и протеидизации витамина и его аналогов в животном организме особая роль принадлежит процессам их длительной рециркуляции. В случае с окситиамином происходит постепенное накопление антиметаболита в протеидизированной форме (Островский, Воскобоев, Горенштейн и др., 1979). Приведенные выше факты послужили обоснованием в исследовании отдаленных эффектов действия высокой дозы (400 мг/кг) ТТ и его производных. Активность тиаминовых ферментов и уровень свободного и общего тиамина измерялись через суточные интервалы (I-I5 суток) после разового подкожного введения препаратов животным.
Последействие высоких доз тетрагидротиа-мина, его монофосфорного и дифосфорного эфиров при подкожном введении
В настоящее время у биохимиков, фармакологов и клиницистов заметно возрос интерес к биохимически активным веществам, в том числе, - к витаминам, их антагонистам. Эти соединения (природные, их синтетические аналоги) перспективны как в теоретическом плане при изучении процессов обмена веществ живого организма, так и в плане использования их для нужд народного хозяйства нашей страны.
Дифосфат тетрагидротиамина - антикоферментный аналог тиаминдифосфата, - известен более прочным связыванием по сравнению с нативным аналогом очищенным из дрожжей тиаминза-висимым апоферментным белкам- пируватдекарбоксилазой и тран-скетолазой.
В опытах на животных тетрагидротиаминдифосфат и другие фосфорилированные производные тетрагидротиамина до настоящего времени не исследовались.
Монофосфат, дифосфат и трифосфат тетрагидротиамина получены в препаративных количествах, идентифицированы как индивидуальные вещества.
Изучены физико-химические, фармакологические свойства и влияние полученных соединений на активность основных тиамин-зависимых ферментов в тканях животных (транскетолаза, пируват-дегидрогеназа и оС-кетоглутаратдегидрогеназа), уровень свободного и общего тиамина в ткани печени.
Незначительная и сходная биологическая активность 0-моно-фосфорного, О-дифосфорного эфира тетрагидротиамина и тетрагидротиамина, постоянный уровень общего тиамина в печени при достоверном изменении содержания свободного тиамина в той же ткани животных отражают объективные процессы, протекающие в животном организме под влиянием исследуемых соединений.
На наш взгляд суть данных процессов заключается в дефос-форилировании 0-фосфорных эфиров тетрагидротиамина и последующем влиянии вводимых соединений (в виде тетрагидротиамина) на физиологические механизмы транспорта витамина Bj.
Таким образом, отсутствие у тетрагидротиамина, тетрагид-ротиаминмонофосфата и тетрагидротиаминдифосфата выраженных антивитаминных свойств, реализуемых через антикрферментную по отношению к тиаминдифосфату активность, показало неперспективность использования указанных соединений в качестве антивитаминов тиамина при работе на животных Только трифосфат тетрагидротиамина, являясь новым химическим соединением, представляет собой высокоактивное соединение, обладающее рядом преимуществ по сравнению с известными антивитаминами тиамина - Авторское свидетельство № 792893 (СССР), Препарат эффективен в малых дозах (10 мг/кг), угнетает активность пируватдегидрогеназы в печени через 3 часа после подкожного введения на 58$, активность пируватдегидрогеназы в сердце - на 40$.
Тетрагидротиаминтрифосфат сравнительно мало токсичен, в организме животных не накапливается, обладает сильным антивитаминным эффектом лишь в короткие сроки опыта, не оказывая антивитаминного действия на транскетолазу и о -кетоглутарат-дегидрогеназу в тканях животного Механизм антивитаминного действия тетрагидротиаминтри-фосфата основан на дефосфорилировании последнего при прохождении различного рода биомембран. Образующийся при этом, дифосфат тетрагидротиамина, обладает сильным антикофермент-ным действием. Результати исследований с данным соединением на очищенном пируватдегидрогеназном комплексе из митохондрий коры надпочечников крупного рогатого скота подтверждают высокую антивитаминную активность тетрагидротиаминдифосфата, обнаруженную в 1971 году на дрожжевой пируватдекарбоксилазе.
Процесс дефосфорилирования трифосфата тетрагидротиамина является частным случаем общей ситуации/ поскольку транспорт нуклеотидов через биомембраны также происходит путем временного отщепления концевого гамма-фосфата.
Короткие сроки антивитаминного действия тетрагидротиамин-трифосфата свидетельствуют о дальнейшем гидролизе образующегося " de novo п тетрагидротиаминдифосфата до монофосфата тетрагидротиамина и тетрагидротиамина.
Избирательность действия тетрагидротиаминтрифосфата на тиаминзависимые ферменты животных тканей определяется свойствами самих ферментных систем.
Полученные с тетрагидротиаминтрифосфатом результаты позволяют рекомендовать новый антиметаболит тиамина как специфический агент для витаминологических исследований, в случае быстрого эффективного торможения активности пируватдегидро-геназы без повреждения других тиаминовых ферментов.
Тетрагидротиамин и его фосфорилированные производные широко применяются в экспериментальной практике Отдела регуляции обмена веществ АН БССР г.Гродно:при исследовании высоко-очищенных дегидрогеназных систем 2-оксокислот надпочечных желез крупного рогатого скота (акт внедрения от 18.01.1983г.), при исследовании уровня коферментной формы витамина Bj в тканях белых крыс (акт внедрения от 19.01.1983 г.), при изучении уровня эндогенного эталона у белых крыс (акт внедрения от 20.01.1983 г.), при изучении обмена липидов у белых крыс (акт внедрения от 19.05.1983 г.). 0-фосфорные эфиры тетрагид-ротиамина и нефосфорилированный тетрагидротиамин нашли приме-нение в Киевском институте биохимии им.А.В.Палладина АН УССР при изучении механизмов регуляции активности пируватдегидро-геназного комплекса и механизмов взаимодействия производных тиамина с возбудимыми мембранами животных клеток (акт внедрения от 20.03.1984 г.).
Теоретические положения исследования антивитаминных свойств тетрагидротиамина, моно-, ди- и трифосфата тетрагид-ротиамина используются в курсе лекций по биологической химии и медицинской физике для студентов Гродненского медицинского института при изучении Bj-патологических состояний, различных видов обмена веществ (акт внедрения от II.05.1983 г.).
