Содержание к диссертации
Введение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования 52
2.2. Методы исследования 58
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Первичный скрининг цитостатиков морских беспозвоночных и особенности их биологической активности 86
3.2. биологическая активность полифенольных соединений растений и морских беспозвоночных 110
3.3. биологическая активность и механизм действия тритерпеновых и стероидных гликозидов 125
3.4. Вторичные метаболиты как составная часть биологически активных добавок (БАД) 174
4.3АКЛЮЧЕНИЕ 192
5.ВЫВОД Ы '. 193
6.ЛИТЕРАТУРА
- Объекты исследования
- Методы исследования
- Первичный скрининг цитостатиков морских беспозвоночных и особенности их биологической активности
Введение к работе
До настоящего времени основным источником биологически активных веществ (БАВ), биологически активных добавок (БАД) и лекарственных средств остается растительный и животный мир нашей планеты. Лекарственные средства природного происхождения и их аналоги занимают около половины всех используемых в медицинских целях препаратов, и их доля в последнее десятилетие имеет тенденцию к постоянному увеличению. В связи с этим направленный скрининг новых БАВ из различных природных объектов и изучение их механизма действия представляют собой одну из важнейших задач современной биохимии и биотехнологии. Особый интерес вызывает поиск новых соединений, обладающих высокой противоопухолевой активностью и имеющих необычный механизм действия на опухолевую клетку. Этот интерес подкрепляется надеждой выхода на новые необычные структуры и разработку на их основе нового поколения препаратов, эффективно останавливающих рост различных видов резистентных опухолей.
Наряду с традиционными источниками лекарств - флорой и фауной поверхности суши -поистине колоссальный мир обитателей Мирового океана открыл перед современными исследователями еще большие перспективы и возможности, поскольку значительная часть морских гидробионтов все еще остается не обследованной на наличие БАВ. Многие метаболиты, вьщеленные из морских гидробионтов, относятся к тем же структурным классам соединений, что и вторичные метаболиты растений. Однако большинство соединений морского генеза имеют необычное химическое строение и уникальный механизм биологического действия.
Условия обитания в морской среде сильно отличаются от таковых для обитателей суши, что оказывает значительное влияние на процессы биосинтеза и метаболизма в этих объектах. Своеобразие биосинтетических процессов связано с использованием компонентов морской среды. Морская вода содержит много различных катионов и анионов, в том числе 19 г/л хлорид-аниона, 1-3 г/л сульфат- и нитрат-анионов, 0,065 г/л бромид-анионов и других. Галогенирование и сульфатирование часто встречается в различных группах терпеноидов, алкалоидов, фенольных и хиноидных соединений морского генеза. Поэтому вторичные метаболиты морских гидробионтов составляют предмет особого интереса со стороны химиков, биологов и медиков, исследующих возможности выделения БАВ, а также пути и способы создания на их основе новых лекарственных средств.
Предпринятые в последние годы усилия по реализации национальных программ по поиску лекарственных средств из растений и морских гидробионтов привели к открытию интересных в фармакологическом и структурном отношении соединений природного происхождения. К настоящему моменту число выделенных и охарактеризованных низкомолекулярных метаболитов природного происхождения составляет около 200 тысяч соединений. Из них около 12 тысяч - вторичные метаболиты морских гидробионтов. Многие природные соединения используются в чистом виде как лекарственные средства. Однако большинство выступают как "лидерные молекулы", на структурной основе которых получают новые эффективные лекарственные и биохимические препараты. Так, противоопухолевые средства растительного происхождения на основе таксола (паклитаксель) ,. и камптотецина, созданные в 90-е годы прошлого столетия, находят все более широкое применение в клинической практике для лечения резистентных опухолей. Препараты из морских асцидий - экстеинасцидин (ЕТ-723) и асцидидемин, прошли все стадии клинических испытаний на около 1000 онкологических больных, и их массовое применение планируется с 2003 года.
На данном этапе можно выделить три наиболее актуальные и важные направления исследований природных вторичных метаболитов и их аналогов: 1) эффективный поиск и %* изучение спектра биологической активности индивидуальных низкомолекулярных БАВ, включая выяснение их биологической роли в организме-продуценте; 2) исследование механизма биологического действия на клеточном и молекулярном уровнях с выходом на селективные рецепторы-мишени и 3) разработка новых лекарственных средств и БАД на основе вторичных метаболитов растений и морских гидробионтов.
Исходя из вышесказанного, цель настоящей работы состояла в изучении биологической активности и некоторых сторон механизма действия вторичных метаболитов растений и морских беспозвоночных с использованием различных биологических и модельных систем, а также разработка и изучение медико-биологических свойств новых БАД, созданных на основе природных источников получения вторичных метаболитов.
В задачу исследования входило:
1. Провести скрининг экстрактов из растений и морских беспозвоночных для определения вторичных метаболитов, обладающих противоопухолевой, антимикробной, цитотоксической, алкопротекторной, гепатопротекторной и другими видами биологической активности.
Изучить спектр биологической активности вторичных метаболитов растений и морских беспозвоночных и определить основные принципы и индивидуальные особенности их действия на различные биологические и модельные системы.
Разработать новые БАД на основе лекарственных растений и морских беспозвоночных, действующими началами которых являются вторичные метаболиты.
Провести оценку лечебно-профилактических свойств этих БАД с использованием экспериментальных моделей.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 38 рисунков и 26 таблиц; диссертационный материал изложен на 221 странице. Список литературы содержит 343 источника, в том числе 252 иностранных.
Основные результаты исследований являются частью плановой научно-исследовательской работы, проводившейся в лабораториях биоиспытаний (зав. лаб., д.б.н. Анисимов М.М.), лечебно-профилактических технологий (зав. лаб., д.б.н. Лоенко Ю.Н.) и в группе по изучению биологически активных добавок Тихоокеанского института биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН.
Объекты исследования
При исследовании противоопухолевой активности были использованы следующие опухолевые штаммы мышей: лимфоидная лейкемия (L1210), эпидермальная карцинома легкого Льюиса (LLC), меланома В16 (М-ВІ6), солидный и асцитный варианты карциномы Эрлиха (тетраплоидный штамм) и саркомы 37. Все перечисленные штаммы получены из ВОНЦ РАМН (г. Москва). Клетки карциномы Эрлиха, адаптированные для роста in vitro, - из Института по изысканию новых антибиотиков РАМН (г. Москва).
Эксперименты проводились на аллогенных белых мышах, линейных мышах C57BL/6, DBA/2, СВА, СЗН, BALB/C и мышах-гибридах BDF, (C57BL х DBA/2). В специальных исследованиях использовались такие лабораторные животные как крысы и кролики.
Биологическими тестами для изучения активности вторичных метаболитов служили также клетки дрожжей Saccharomyces carlsbergensis, оплодотворённые яйцеклетки морского ежа Strongylocentrotus intermedius и S. nudus, культуры грамположительных (Staphilacoccus aureus) и грамотрицательных {Escherichia coli) бактерий, патогенных и условно патогенных грибов (Candida albicans, Trichophyton mentagraphytes, Trichophyton rubrum), различные культуры опухолевых клеток, клетки эритроцитов барана и мышей, первичные культуры мышиных лимфоцитов и макрофагов.
Методы исследования
Цитотоксическое действие исследуемых веществ оценивали методом исключения
красителя, позволяющим по окрашиванию опухолевых клеток трипановым синим или эозином дифференцировать погибшие и живые клетки (Клаус, 1990). В опытах использовали клетки карциномы Эрлиха, взятые от мышей на 7-й день после перевивки. К 1 мл суспензии клеток (3 х 106 кл./мл в растворе Хэнкса) добавляли испытуемые вещества. Клетки инкубировали при 37С в течение 1 ч. После инкубирования в соотношении 1:1 к взвеси клеток добавляли 0,1%-й раствор эозина или трипанового синего и под микроскопом определяли количество окрашенных и неокрашенных клеток.
Для установления спектра противоопухолевого действия вторичных метаболитов растений и морских гидробионтов использовали ряд аллогеиных и сингенных штаммов опухолей: L-1210, LLC, меланома В16, саркома 37 и карцинома Эрлиха. Перевивку и поддержание штаммов осуществляли по методике, принятой в ВОНЦ АМН РФ (г. Москва) (Софьина и др., 1980). Мыши содержались в стандартных условиях вивария, корм и воду получали без ограничений (ad libitum). Вещества растворяли в стерильных водных, водно-спиртовых растворах. Для растворения гидрофобных веществ в качестве растворителя использовали 10%-ные и ниже растворы диметилсульфоксида (ДМСО) или этанола. В зависимости от поставленных задач исследуемые вещества вводили различными способами (подкожно, перорально, внутрибрюшинно или внутривенно). Контрольным животным вводили соответствующие количества растворителя. Обычно лечение начинали через 24 ч после перевивки. Результаты экспериментов с солидными формами опухолей оценивали путем сравнения их средних объемов у мышей-носителей в леченной и контрольной группах. Асцитную опухоль Эрлиха поддерживали серийными пассажами на аллогенных мышах. Указанную опухоль трансплантировали путём подкожной инокуляции по 5 х 106 асцитных опухолевых клеток в 0,2 - 0,5 мл физраствора.
Первичный скрининг цитостатиков морских беспозвоночных и особенности их биологической активности
По количеству известных типов структур природные соединения - самый богатый источник продуктов вторичного метаболизма и потенциальных лекарственных средств. Несмотря на такую проблему, как заготовка сырья, наземные растения и морские организмы представляют статистически наиболее вероятный источник новых веществ, эффективно ингибирующих рост опухолевых клеток и развитие канцерогенеза (Faulkner, 1984; Cassady et al., 1990; Molinski., 1993; Dumontet, 2000). Интерес к вторичным метаболитам из растений и морских гидробионтов стимулируется открытием большого количества новых соединений, ингибирующих пролиферацию опухолевых клеток в очень низких концентрациях (Ding et al., 1999; Urban et al, 2000; Higa et al., 2000).
Поскольку всё возрастающей проблемой химиотерапии опухолей является множественная лекарственная резистентность, то особые надежды возлагаются на оригинальные природные соединения, выделяемые из морских гидробионтов. Это связано с тем, что до последнего времени арсенал противоопухолевых средств природного происхождения пополнялся за счет растений. С расширением поиска БАВ среди морских организмов и совершенствованием методов их скрининга увеличивается вероятность обнаружения специфических веществ с необычными механизмами противоопухолевого действия (Dassonnville et al., 2000; Erba et al., 2001). Кроме того в настоящее время наблюдается большая потребность в веществах, которые специфически взаимодействуют с различными внутриклеточными мишенями и могут быть использованы как средства изучения механизмов функционирования ключевых биохимических путей как в нормальных, так и в опухолевых клетках, т.е. в качестве так называемых "биохимических зондов" (Soni et al., 2000; Gachet є/а/., 2001).
Используя уникальную возможность сбора различных видов морских гидробионтов во время экспедиционных рейсов научно-исследовательских судов (НИС) "Профессор Богоров" и "Академик Опаршг" был проведен масштабный и направленный скрининг более чем 1000 экстрактов из морских гидробионтов различных районов Тихого и Индийского океанов. Результатом этого скрининга стало выявление новых эффективных ингибиторов пролиферации опухолевых клеток. Основное внимание уделялось экстрактам из морских беспозвоночных, содержащим вещества, которые эффективно ингибируют включение [3Н]-тимидина в кислотонерастворимую фракцию опухолевых клеток in vitro и проявляют противоопухолевую активность in vivo. На каждой стадии фракционирования отобранных экстрактов мы осуществляли направленное биотестирование. Ингибирующее действие (ИД) оценивали по дозе вещества в образце (ИД50, мкг/мл), вызывающей 50%-ное ингибирование включения [3Н]-тимидина в биосинтез нуклеиновых кислот, по сравнению с контролем. В качестве тест-системы использовали штамм асцитных опухолевых клеток Эрлиха, адаптированный к росту in vitro, и широко применяемый для первичного отбора потенциальных противоопухолевых соединений (Макухо, Волколупова, 1981). Экстракты, имевшие при первичном тестировании величину ИД50 20 мкг/мл, рассматривались как потенциально перспективные. Индивидуальные соединения, полученные в результате направленного биотестирования, у которых ИД50 было 10 мкг/мл, проходили испытания на противоопухолевую активность.
При первичном отборе БАВ в качестве биологических тестов, помимо опухолевых клеток, мы использовали нормальные первичные культуры - клетки эритроцитов и лимфоцитов (спленоциты). Эти модели позволили in vitro отобрать вещества, обладающие первичным цитотоксическим, мембранотропным, иммунотропным действием, и определить степень селективности цитотоксической и антипролиферативной активности исследуемых экстрактов в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальным контролем.
Для предварительного тестирования противоопухолевых свойств экстрактов и индивидуальных соединений in vivo использовали опухоль Эрлиха (асцитный и солидный вариант), которая чувствительна приблизительно к 90% клинически эффективных противоопухолевых средств (Софьина и др., 1980). Вещества, лечение которыми приводило к увеличению продолжительности жизни более чем на 30%, рассматривались как перспективные для дальнейших расширенных испытаний на различных видах асцитных (лейкозы L1210 и К388) и солидных (карцинома легкого Льюиса и меланома В-16) опухолей.
Такой селективный скрининг позволил осуществить выделение и установление структуры индивидуальных веществ, обладающих либо мощной антипролиферативной активностью в отношении опухолевых клеток in vitro, либо противоопухолевой активностью in vivo. Большинство видов гидробионтов, обладающих указанными выше активностями, являются представителями асцидий (тип Tunicata), губок (тип Spongia), моллюсков (тип Mollusca), мшанок (тип Brizoa) и кишечнополостных (тип Coelenterata). Необходимо отметить, что «активные агенты» этанольных экстрактов отдельных видов мшанок, оболочников, асцидий и морских губок (около 20 объектов), которые проявили при первичном тестировании высокую цитостатическую активность, не были выделены в индивидуальном виде, и их структура не была установлена. В одних случаях, это произошло из-за недостаточного количества исходного сырья, в других, - из-за трансформации или распада нативных веществ в процессе выделения.
Проведение скрининга морских беспозвоночных в различных точках Мирового океана показало, что сильные цитостатики биосинтезируются, в основном, в клетках и тканях морских беспозвоночных, которые обитают в теплых водах. Однако они также встречаются в теле различных видов, обитающих в замерзающих морях. Например, сравнительное изучение цитотоксического потенциала некоторых видов губок и асцидий, собранных в относительно холодных водах района Курильских островов и в теплых водах тропических районов Тихого и Индийского океанов, в обоих случаях выявило наличие соединений с высокой цитотоксической активностью. Тем не менее, доминирующее число видов морских беспозвоночных, которые синтезируют сильные цитостатики, сосредоточено в тропической зоне Мирового океана.
