Введение к работе
Актуальность работы
Ассоциативные микроорганизмы рода Azospirillum занимают особое положение в ряду почвенных азотфиксаторов. Впервые эти бактерии были выделены в Нидерландах более 80-ти лет назад (Beijerinck, 1925), однако в сферу интенсивного изучения попали после опубликования работы «Ассоциативный симбиоз у тропических трав...» (Dobereiner and Day, 1976), став одним из наиболее интенсивно исследуемых ассоциативных партнеров растений (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan etal, 2004).
Прогресс в исследовании азоспирилл в качестве экологически безопасных стимуляторов роста растений в значительной степени зависит от развития быстрых и надежных способов определения данных микроорганизмов в почве. Кроме того, значительный интерес при исследовании собственно феномена ассоциативности представляют качественный и количественный состав ассоциативной микрофлоры, их сезонные колебания, а также изменения, вызванные антропогенным воздействием. В целом, развитие подходов, позволяющих осуществлять мониторинг состава и численности ризосферных бактерий, представляется одной из актуальных задач современной экологической микробиологии.
Выявляющие системы на основе специфичных антител (Ат) являются весьма удобным средством мониторинга разнообразных микроорганизмов. В настоящее время методы иммуноанализа находят широкое применение в микробиологии, в первую очередь, при работе с патогенными бактериями. Эти методы занимают третье место по частоте и интенсивности использования, уступая «золотому» стандарту - методам, основанным на культивировании, и «серебряному» стандарту - молекулярно-генетическим приемам на основе полимеразной цепной реакции (Gracias, McKillip, 2004; Bhunia, 2006), при этом иммуноанализ является, безусловно, самым быстрым по исполнению в сравнении с двумя другими методами.
Кроме того, приходится учитывать, что для анализа представителей почвенной микрофлоры основанные на культивировании методы пригодны весьма ограниченно, поскольку всего небольшая доля от общей популяции бактерий в почве (оцененной микроскопическими методами) поддается культивированию (Skinner etal, 1952; Louw and Webley, 1959; Rovira etal, 191 A; Faegri etal, 1977; Lund and Goksoyr, 1980; Olsen and Bakken, 1987; Ogan, 1991; Pedersen and Jacobsen, 1993), а молекулярно-генетические подходы приобретают актуальность в том случае, когда для каждого объекта имеются наборы праймеров на соответствующие генетические локусы, обеспечивающие с высокой разрешающей силой дифференциацию штаммов или групп штаммов.
Одним из наиболее эффективных серологических подходов является иммуноферментный анализ (ИФА) - метод выявления антигенов (или антител), основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки. В настоящее время ничтожно мало количество работ, посвященных иммуноферментному выявлению микробных объектов в почве in situ, которая представляет собой чрезвычайно сложную среду для анализа благодаря присутствию в ней большого числа органических соединений, затрудняющих или в некоторых случаях делающих невозможной интерпретацию результатов. Вместе с тем, использование данного подхода весьма перспективно для
вырабатывания экологически приемлемых агробактериальных технологий.
Целью настоящей работы являлось развитие метода иммуноферментного анализа для in situ выявления ассоциативных бактерий рода Azospirillum в почве.
Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:
Оптимизировать условия твердофазного иммуноферментного анализа целых клеток бактерий рода Azospirillum с использованием антител на липополисахариды (ЛПС).
Провести идентификацию бактерий A. brasilense в инокулированной почве.
Оценить динамику выявления in situ соматического антигена интродуцированных в почву бактерий A. brasilense Sp245.
Провести скрининг коллекционных штаммов Azospirillum, выделенных из почв Саратовской области, методом ИФА с использованием антител на ЛПС модельных штаммов.
Оценить распространенность азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.
Научная новизна работы
В работе впервые предложен вариант твердофазного иммуноферментного анализа микроосадков почвенных суспензий с использованием антител на ЛПС азоспирилл, позволяющий проводить выявление соматического бактериального антигена в почве. Впервые на основе оптимизированного варианта ИФА изучена динамика выявления in situ соматического антигена интродуцированных в почву ассоциативных бактерий A. brasilense, а также выявлен значительный вклад азоспирилл серотипа Sp245, в сравнении с таковыми, представляющими серотип Sp7, в микробоценоз почв Саратовской области.
Практическая значимость работы
Разработан способ количественного иммуноферментного анализа бактериальных липополисахаридных антигенов в почве (заявка на патент РФ № 2009 120888 от 1.06.2009 г.), который может быть использован для оценки эффективности применения бактериальных удобрений и мониторинга почвенных микр обоценозов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Оптимизированный способ твердофазного иммуноферментного анализа микроосадка почвенных суспензий с использованием антител на соматический антиген азоспирилл позволяет оценивать динамику развития бактериальных популяций.
Максимальное количество специфического антигена A. brasilense Sp245 в образцах инокулированной этим штаммом почвы без растений и в прикорневой зоне инокулированной пшеницы ТгШсит aestivum cv. Саратовская 29 выявляется на 7-е и 14-е сутки, соответственно.
Для аборигенной микрофлоры почв Саратовской области характерно преобладание антигенов азоспирилл, относящихся к серотипу Sp245; чернозем южный отличается также более заметным присутствием антигенов азоспирилл серотипа Sp7.
Апробация работы
Основные положения диссертации были представлены в виде устных и
стендовых сообщений на 2-й и 4-й Региональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2004; 2008); 2-м и 3-м Агробиотехнологических Симпозиумах стран Балтии (Гамбург, Германия, 2006; Санкт-Петербург, Россия, 2007); Международной научной конференции молодых ученых «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); Международной конференции «Ризосфера - 2» (Монпелье, Франция, 2007), Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2008» (Саратов, 2008), а также на отчетной научной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, 2009).
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН 2 октября 2009 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников, содержащего 154 наименования. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 2 таблицы.
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. регистрации 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев СЮ.) и «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных биотехнологий» в рамках государственного контракта с Роснаукой № 02.445.11.7130 (ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы») (руководитель научной школы д.б.н., профессор Игнатов В.В.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ.
