Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Современные представления о структуре холерного токсина 13
1.2 Методы обнаружения холерогена in vitro 18
1.3 Моноклональные антитела к холерному токсину 28
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Бактериальные штаммы и условия их выращивания 33
2.2 Бактериальные токсины и антитоксические сыворотки 33
2.3 Ганглиозиды 40
2.4 Перевиваемые клеточные линии и их культивирование 40
2.5 Лабораторные животные 41
2.6 Гибридизация клеток 41
2.7 Культивирование гибридом in vivo и in vitro 42
2.8 Скрининг моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом 42
2.9 Клонирование гибридом 42
2.10 Криоконсервирование 43
2.11 GMl-иммуноферментный анализ (GMl-ИФА) 43
2.12 GM1-дот-иммунологический анализ (GMi-ДИА) 43
2.13 СНО-иммуноферментный анализ (СНО-ИФА) 44
2.14 Сэндвич-иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ) 44
2.15 Тест в культуре клеток 44
2.16 Иммуноблоттинг препаратов холерного токсина 45
2.17 Фотографирование 45
2.18 Статистическая обработка результатов 45
Глава 3. Монослойные клеточные линии в тестировании холерного токсина
3.1 Характеристика препаратов XT и антитоксических сывороток 46
3.2 Особенности тестированиясупернатантов ctxf штаммов V.cholerae 01, V.cholerae 0139 и V.cholerae поп 01/поп 0139 в культуре клеток СНО-К1 49
3.3 Тестирование супернатантов ctx" штаммов V.cholerae 01 в культуре клеток 53
Глава 4. Варианты иммуноферментного метода для выявления холерогена с использованием ганглиозидов GM1 и поликлональных антитоксических сывороток
4.1 Применение варианта GMl-ИФА для обнаружения и количественного определения XT 56
4.2 Отработка условий постановки дот-иммунологического анализа (ДИА) с использованием ганглиозидов GM1 и нитроцеллюлозной мембраны 61
4.3 Разработка твердофазного СНО-ИФА для обнаружения XT 65
Глава 5. Получение и характеристика моноклональных антител к холерному токсину
5.1 Получение гибридом- продуцентов МКА к XT и их первичный скрининг 68
5.2 Определение эпитопной направленности моноклональных антител к XT 71
5.3 Определение класса и подкласса моноклональных антител 73
5.4 Изучение специфичности и активности МКА к XT 75
5.5 Токсиннейтрализующие свойства МКА 75
5.6 Получение препаративных количеств МКА 76
5.7 Изучение способности МКА взаимодействовать с XT после его связывания с ганглиозидами GM1 77
5.8 Разработка ИФА с использованием МКА к холерному токсину (ИФА-2АТ) 79
5.9 Оценка чувствительности различных вариантов ИФА 81
5.10 Изучение влияния различных биологически активных веществ на специфичность ИФА 82
4 Глава 6. Аспекты применения методов in vitro для тестирования холерного токсина 6.1 Культура клеток в изучении биологической активности токсинов V.cholerae, продуцируемых рекомбинантными штаммами Escherichia coli 85
6.2. Изучение влияния условий хранения и обеззараживания препаратов холерогена на его активность с помощью ИФА и культуры клеток СНО-К1 91
6.3 Влияние условий культивирования на токсинопродуцирующую активность штаммов V.choleraeOX и V.cholerae 0139 93
6.4 Оценка качества очистки препаратов ХТ-0139 с использованием МКА к ЛПС-0139 96
Заключение 99
Выводы 108
Список литературы ПО
- Моноклональные антитела к холерному токсину
- Сэндвич-иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ)
- Применение варианта GMl-ИФА для обнаружения и количественного определения XT
- Изучение специфичности и активности МКА к XT
Введение к работе
Своевременное определение токсигенности холерных вибрионов имеет большое значение при определении рационального объема противохолерных мероприятий. В настоящее время в лабораторной практике для оценки эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae используют такие методы как ПЦР, ДНК-зондирование, тестирование на кроликах-сосунках, определение гемолитической активности по Грейгу и чувствительности к холерным фагам ctx+ и ctx" (М.У.4.2 1097-02. Лабораторная диагностика холеры, 2002).
Из вышеупомянутых методов достаточно широкое применение нашли молекулярно- генетические и, в частности, ПЦР-анализ, который за 3-4 часа позволяет проанализировать значительное число проб. Последний может быть использован в экспресс- диагностике для прямого выявления ДНК токсигенных штаммов от больных людей (Савельев В.Н. с соавт., 2002; Касина И.В. с соавт., 2003; Miyagi К. et al., 1999), как ускоренный метод для идентификации подозрительных колоний, а также в научных работах и ретроспективном анализе с целью получения информации о вирулентности изолятов путем детекции фрагментов генов ctx A, tcp A, tox R, hap A, RS (Кутырев В.В. с соавт., 2000; Ефременко В.И. с соавт., 2003; Куличенко А.Н. с соавт., 2003; Водопьянов СО. с соавт., 2006; Lyon W.J. et al., 2001; Karunasagar I. et al., 2003; Lipp E.K. et al., 2003; Rivera I.N. et al., 2003; Gubala A.J., 2006). Однако известно, что мутации в различных генах могут снизить и даже полностью исключить продукцию хо-лерогена (Gardel C.L.et al., 1996; Haralalka S. et al., 2003; Lauriano CM. et al., 2004). В лабораторной практике часто используют и такие методы, как определение гемолитической активности вибрионов и определение чувствительности к фагам ctx , ctx". В то же время известно, что среди нетоксигенных холерных вибрионов можно нередко обнаружить штаммы негемолитичные по фенотипу (Кюрегян А.А с соавт., 2002; Лобанов В.В. с соавт., 2004), а некоторые штаммы ctx" могут оказаться чувствительными к фагам ctx (Безсмертный В.Е. с соавт., 2004; Нановская Ы.Н. с соавт., 2004). В связи с этим эпидемический по-
7
тенциал штаммов подтверждают другими методами, например,
используя биологические модели, однако методы in vivo нестандартны, а получаемые результаты не всегда воспроизводимы ввиду индивидуальной реакции животных.
Альтернативой биологическим тестам считают культуру клеток. Установлены индикаторные для холерного токсина (XT) клеточные линии, которые позволяют по изменению морфологии клеток определять активность токсина с чувствительностью 10-30 пг/мл (Сальникова О.И., 1994; Guerrant R.L.et al., 1974). Однако в последнее время были обнаружены токсины, вызывающие удлинение клеток СНО-К1 подобно холерогену: Cef (CHO-cell elongating factor), S-CEP (secreted CHO elongating protein), W07 (novel toxin) (Sanial S.C. et al., 1984; Walia K. et al., 1999; McCardell B.A. et al., 2000; Bhattacharyya S. et al., 2004). Иммунологическое отличие этих токсинов от холерогена можно подтвердить только с помощью иммунохимических методов.
По мнению большинства исследователей, высокой специфичностью и чувствительностью отличаются некоторые варианты иммуноферментного анализа. Среди них можно выделить следующие: «двойной антительный» сэндвич, где выявляемый холероген, заключен между двумя слоями антитоксических антител (Bhadra R.K. et al., 1991), bead-ИФА - прямой метод выявления XT с применением полимерных носителей (Ramamurthy Т. et al., 1992,1996), GM1-ИФА с использованием в качестве твердой фазы планшетов, покрытых ганг-лиозидами GM1 (Honda Т. et al., 1984; Clark G.J. et al., 1988) и др. По данным зарубежных и отечественных авторов, чувствительность его колеблется от 1-30 пг/мл до 10-50 нг/мл. Поиск новых сорбентов привел к созданию новых улучшенных в практическом плане вариантов ИФА, где вместо полистироловых планшетов используются магнитные сорбенты (Покровский В.И. с соавт., 2000; Ефременко В.И. с соавт. 2003), пьезоэлектрические иммуносенсоры (Ewalt K.L. et al., 2001). Однако наиболее доступными в отечественной практике являются полимерные мембраны, в частности, нитроцеллюлозные (НЦМ). Последние очень удобны для проведения реакции, так как в порах из-за микроскопических размеров лучше происходят процессы массообмена, что во много раз ускоряет
8
кинетику реакции. Так, чувствительность дот-ИФА
относительно XT, по данным отечественных и зарубежных авторов, составляет от 10 до 160 нг/мл, а время проведения анализа сокращается до 2-3 часов (Федорова В.А. с соавт., 1996; Девдариани З.Л. с соавт., 1999; Beutin L. et al., 1984). К преимуществам иммуноферментного метода относятся также экспрессность, возможность тестирования большого числа проб одновременно, сравнительно невысокая себестоимость анализа.
Однако данные отечественных авторов относительно чувствительности и специфичности различных вариантов ИФА достаточно противоречивы, так как целенаправленных исследований по их сравнительной оценке не проводилось. Кроме того, мы не встретили отечественных публикаций, касающихся одновременного использования для тестирования холерного токсина культуры клеток и ИФА, как это принято в зарубежных лабораториях. Мало сведений и в отношении тестирования ctx" штаммов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 в культуре клеток СН0-К1. Заслуживает внимания также выяснение возможных причин появления ложно-положительных результатов при тестировании суперна-тантов ctx" штаммов холерных вибрионов как в ИФА, так и в культуре клеток СНО-К1.
Целью работы явилось изучение токсинопродуцирующей способности V.cholerae 01 и 0139 серогрупп с использованием комплекса методов in vitro, включающего варианты сэндвич иммуноферментного анализа и культуру клеток.
Задачи исследования 1. Отработать условия постановки различных вариантов сэндвич - ИФА на основе ганглиозидов GM1 и антитоксической сыворотки (GMl-ИФА, GM1-ДИА и СНО-ИФА) для тестирования XT, включающие подбор оптимального разведения антитоксической сыворотки и препарата XT, используемого в качестве положительного контроля, а также концентрации ганглиозидов и способа их адсорбции на полистироловом планшете и нитроцеллюлозной мембране.
2. Получить моноклональные антитела (МКА) к XT, оценить их специфичность и иммунохимическую активность.
3. Отработать и оптимизировать постановку сэндвич варианта ИФА-
2АТ на основе МКА к XT и антитоксической сыворотки (АТС) для определения токсинопродуцирующих свойств штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп.
Установить наиболее чувствительные монослойные клеточные линии в отношении цитотонического фактора Cef, токсина зонального поглощения (Zot) и гемагглютинин/протеазы (НА/Р) V.cholerae 01 и V.cholerae 0139.
Сравнить специфичность и чувствительность методов in vitro, используемых для тестирования XT, и оценить возможные аспекты их применения.
Научная новизна и теоретическая значимость
Получены приоритетные данные, свидетельствующие о возможности использования ганглиозидов GM1, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану, в качестве твердой фазы для разработки нового варианта дот - иммунологического анализа -GMl-ДИА, позволяющего выявлять XT на уровне 75 нг/мл.
Впервые для тестирования XT отработан новый вариант СНО-ИФА на основе клеток монослойной линии СНО-К1, богатых ганглиозидами, с чувствительностью около 1 мкг/мл.
Созданы гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела классов G и М, направленные к эпитопам В-субъединицы XT, расположенным вблизи ганглиозид - связывающего участка и блокирующие взаимодействие XT с рецептором GM1. В результате целенаправленного скрининга отобраны моноспецифические антитела, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям ИФА, на основе которых отработан и оптимизирован ИФА-2АТ с чувствительностью порядка 50 нг/мл.
Анализ в иммуноблоте с помощью АТС, МКА к XT и МКА к ЛПС спектра белковых и углеводных компонентов супернатантов атоксигенных штаммов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139, дающих ложноположительные результаты в ИФА, позволил выявить в их составе белковые соединения, вступающие в реакцию с антитоксическими антителами, по-видимому, из-за структурного сходства с отдельными эпитопами XT.
10 Получены новые данные о токсинопродуцирующей способности
штаммов V.cholerae eltor и V.cholerae 0139 из коллекции музея РостРГИПЧИ. Среди них выявлены активные продуценты, отличающиеся высокой стабильной продукцией холерогена in vitro независимо от срока их хранения.
Впервые на монослойных перевиваемых клеточных линиях, имеющихся в Ростовском ЫШТЧИ, изучен биологический эффект дополнительных токсинов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139, продуцируемых штаммами Escherichia col і, несущими рекомбинантные плазмиды со вставками генов cef, zot, гемагглютинин/протеазы. Установлены наиболее адекватные клеточные модели для их тестирования, а именно: L-929 и СН0-К1- для изучения цитотоническо-го фактора Cef (CHO-cell elongating factor), CaCo-2- токсина зонального поглощения (Zonula occludens toxin), a CH0-K1, L-929, M-HeLa, HEp-2, MDCK- re-магглютинин/ протеазы. Теоретическая и практическая значимость результатов исследований
По материалам диссертации составлены и утверждены на Ученом совете РостНИПЧИ методические рекомендации «Оценка способности холерных вибрионов продуцировать холерный токсин в условиях in vitro» (протокол №8 от 17.06.04), которые могут быть использованы для оценки токсинопродуци-рующих свойств штаммов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 .
Получены гибридомы- продуценты МКА к XT, из которых отобрано две, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям иммунофер-ментного анализа. Штамм гибридомы GCT-4F7, секретирующий МКА к XT, депонирован в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской Коллекции клеточных культур 3.03.1999 г. под номером РККК (П)654Д. 26.
Линии СНО-К1 и L-929 использованы для отбора рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих биологически активный цитотонический фактор Cef (CHO-cell elongating factor). Штаммы E.coli Jml03pCef61B, Jml03pCef69B, Jml03pCef49B, Jml03pCeBlB, экспрессирующие клонированные гены cef V.cholerae О J обоих биоваров, V.cholerae 013 и V.cholerae 0139 под контролем Pbad -промотора, депонированы в ГКПБ при Российском
11
НИПЧИ «Микроб» в качестве охраноспособных под номерами КМ
188, КМ189, КМ190, КМ191(2005).
Основные положения, выносимые на защиту
Различные варианты ИФА на основе ганглиозидов GM1 и АТС (GM1-ИФА, GMl-ДИА) позволяют выявлять XT с чувствительностью примерно 75 нг/мл.
Полученные гибридомы продуцируют моноклональные антитела к В-субъединице XT, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуноблоте и в тесте нейтрализации холерогена в культуре клеток СНО-К1.
На основе МКА к XT, в большей степени отвечающих диагностическим требованиям иммуноферментного анализа, разработан ИФА двойных антител (ИФА-2АТ) с чувствительностью 50 нг/мл.
Перевиваемые монослойные линии можно использовать для оценки биологического эффекта гемагглютинин/протеазы и таких дополнительных токсинов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 как Cef, Zot наряду с клетками СН0-К1, традиционно используемыми для обнаружения и количественного определения холерогена.
Совместное применение культуры клеток и ИФА позволяет одновременно определить иммунохимическую и биологическую активность препаратов холерогена, выявить наибольшее число токсинопродуцентов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на Всероссийских конференциях «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); на Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С.-Петербург, 1998); на конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 1999); на проблемных конференциях «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 1999-2003, 2005- 2007).
Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: «Особенности токсинопродукции холерных вибрионов 0139 серогруппы и конструирование на основе их холерогена - токсина препаратов и тест-систем для диагностики
12 холеры» (№ гос.регистрации 01.200.1 15555), «Антигены поверхностных структур холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения» (№ гос.регистрации 01.200.2 12989), «Совершенствование метода серологической идентификации холерных вибрионов не ОІ/не 0139 серогрупп» (№ гос.регистрации 01.200.2 12999), «Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия дополнительных токсинов (Zot и Асе) кассеты вирулентности холерных вибрионов» (№ гос.регистрации 01.20.03 11548).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы в соавторстве 23 научные работы.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 10 таблиц и 22 рисунка. Библиография представлена 254 отечественными и зарубежными источниками.
Моноклональные антитела к холерному токсину
До получения гибридом в иммунологии не было препаратов специфических антител такой степени гомогенности. Гибридомы живут in vitro, в условиях, где нет иммунной системы, и любые жизнеспособные мутанты могут выжить. В процессе клонирования они даже не конкурируют друг с другом, что создает богатый выбор для искусственного отбора, и поэтому при наличии наиболее совершенных методов анализа антигенсвязывающих и эффекторных свойств антител, можно выбрать очень интересные варианты. Например, были получены МКА, мутантные по С-региону при неизменной V-области, то есть не фиксирующие комплемент, а также МКА, отличающиеся аффинностью (Leicht L. et al., 1998). Существуют и биспецифичные антитела, продуцируемые квадромами - гибридомами второго порядка, имеющие два активных центра (Gupta S. et al., 2002). Комбинированные препараты из нескольких антител можно приготовить и с помощью химических соединений - N-сукцин-имидил-3-пропионата (Staerz U.D. et al., 1985). Используя иммунизацию in vitro, созданы и гибридомы- продуценты полиреактивных антител (McMahon M.J., O Kennedy R., 2001). Все перечисленное свидетельствует о возможности получения антител заданной специфичности и аффинности. МКА широко используются во всем мире для идентификации и очистки отдельных молекул и клеток, в качестве лечебных препаратов (Li J. et al., 2006; Weiner L.M. et al., 2006), для проведения иммуноанализов биологических жидкостей, а также в исследовании этиологии и патогенеза различных заболеваний.
В 80-е годы XX века были проведены первые работы по получению МКА к XT (Remmers E.F.et al., 1982; Robb M.et al., 1982; Lindholm L. et al., 1983; Holmes R.K et al., 1983; Svennerholm A.-M., 1986; Tsuyi T. et al, 1986). При использовании набора МКА к В-ХТ было установлено, что некоторые из них теряют способность связывать холероген после его взаимодействия с ганглиози-дом, по причине того, что они направлены либо непосредственно к ганглиозид 29 связывающему участку токсина, или к эпитопу, расположенному вблизи от него. Были проведены работы по расшифровке последовательности рецепторного участка XT, получению синтетических пептидных аналогов и получению к ним МКА. В результате был создан синтетический полипептидный антиген СТРЗ, к которому получили три типа антипептидных МКА-ТЕ32, ТЕЗЗ и ТЕ34. Изучение взаимодействия данных МКА и СТРЗ с помощью ядерного магнитного резонанса показало различие в структуре аминокислотных последовательностей их Fab-фрагментов, обеспечивающих различную прочность связывания с пептидом и нативным токсином. Так, ТЕ34 , в отличие от ТЕ32 и ТЕЗЗ, не были способны связываться с исходной молекулой холерогена (Anglister J. et al., 1988,1990). Однако и ТЕ32 и ТЕЗЗ вступали во взаимодействие с молекулой холерогена с аффинностью в 1000 раз меньшей, чем с собственным пептидом СТРЗ. Оказалось, что данные МКА узнают в основном денатурированные или деформированные эпитопы молекулы холерогена (Shoham М. et al.,1995), как, например, в случае сорбции XT на пластике, сопровождающейся его конфор-мационными изменениями. Холерный токсин, находящийся в растворе в свободном состоянии, данные МКА совершенно не узнавали (Spangler B.D., 1991). Таким образом, очевидно, что для получения МКА, выявляющих цельную молекулу XT, в иммунизациях необходимо использовать нативную молекулу холерогена, сохранившую свою исходную конформацию.
Учитывая, что при холере большое значение принадлежит местному иммунитету, были проведены работы по созданию гибридом- продуцентов IgA путем слияния клеток Пейеровых бляшек и мышиной миеломы. Оказалось, что в культуре клеток толстого кишечника человека Т84, МКА класса IgA блокируют С1-секрецию, вызванную холерным токсином, подтверждая важную роль в защите от холеры Ig класса A (Apter F.M. et al., 1993).
МКА к XT широко используют для изучения антигенной структуры холерогена. В частности, благодаря МКА к XT, было установлено сходство В-субъединиц XT V.cholerae classica, V.cholerae eltor, а затем и V.cholerae 0139 (Tamplin M.L. et al., 1989; Dubey R.S. et al., 1990; Nakashima K. et al., 1995). Используя МКА, были проведены работы по определению сходства в структуре XT и термолабильного энтеротоксина ЛТ E.coli. Так, Svennerholm et al. (1986) показали, что большинство МКА к XT не реагировало с ЛТ, свидетельствуя о значительных конформационных различиях между двумя токсинами, несмотря на очень большое сходство их В-субъединиц по последовательности аминокислот. Гомология между XT и ЛТ, по их данным, составила около 80%.
МКА к XT нашли свое место и в диагностике холеры, одним из ключевых этапов которой является оценка эпидемической опасности выделяемых штаммов V.cholerae, то есть определение способности продуцировать холероген. В 1988 г. разработан двойной сэндвич ИФА, для тестирования энтеротоксина E.coli, согласно которого токсин связывался с иммуноглобулинами кроличьей антитоксической сыворотки, которыми был покрыт пластик, а выявлялся с помощью МКА, меченных пероксидазой (Picard В. et al.,1988). В 1991 году этот вариант использовали для тестирования XT, при этом его чувствительность составила 10 нг/мл (Bhadra R.K. et al., 1991). В 1992 г. ИФА с использованием МКА был применен для непосредственного выявления холерогена в стуле больных (Bead-ELISA), чувствительность его составила примерно 26 пг/мл (Ramamurthy Т. et al., 1992, 1996; Uesaka Y. et al., 1992). МКА широко используют и в постановке GMl-ИФА, где в качестве специфических рецепторов для холерогена используются ганглиозиды GM1 (Honda Т. et al., 1984; Clarke G.J. et al., 1988; Qadri F. et al., 1999; Kim T.G. et al., 2003). В 80-90-е гг. XX века в России также были получены МКА к XT, которые с успехом были применены в различных иммунохимических методах. В 1986 г. И.Г. Сидорович для выявления XT разработал следующий вариант ИФА: в пластиковые планшеты, покрытые МКА, вносили исследуемый образец, содержащий холероген, и через 2 ча-са добавляли очищенный меченный I XT, который конкурировал с токсином из опытной пробы. Результаты реакции учитывали, используя у-счетчик. Т.В.Аленкина с соавт. (1994) на основе МКА к XT разработали метод РНИФ для выявления холерогена на поверхности бактериальных клеток после 3-6 часов роста. Возможность обнаружения холерогена в 3-6 часовой культуре вибрионов была предложена ими и в сэндвич- варианте дот- иммунологического анализа. Н.С. Бабицыным в 1991г. получены МКА к отдельным субъединицам XT и использованы в разработке практического варианта GMp ИФА для тестирования штаммов, выделяемых на территории России. В том же году В.И.Мареевым и Т.А.Славянской с соавт. были получены МКА к энтеро-токсину V.cholerae eltor. В.А. Федорова с соавт. (1996) предложили метод идентификации токсигенных штаммов, согласно которому, антитела антитоксической сыворотки наносили на НЦМ, и после внесения образцов, содержащих энтеротоксин, мембрану обрабатывали МКА к XT. Модификация этого метода привела к разработке нового экспресс- диагностического теста, а именно: антитела антитоксической сыворотки, нанесенные на НЦМ, улавливали токсин, находящийся в бактериальных лизатах, после чего он связывался с МКА к XT (Девдариани З.Л. с соавт., 1999). Чувствительность данного метода составила 16 нг/мл. В 2001 г. L.Alfonta с соавт. предложил ультрачувствительный метод обнаружения XT с использованием пьезоэлектрических иммуносенсоров. Мо-ноклональные антитела к В- субъединице XT иммобилизировали на кварцевой кристаллической пластинке. Холерный токсин связывался первоначально с МКА, а затем - на втором этапе -с GM1 - липосомами, содержащими перокси-дазу хрена. Образовавшийся комплекс окислял 4-хлорнафтол в присутствии Н2О2 с образованием продукта, изменяющего частотные характеристики кварцевой пластинки пропорционально количеству связавшегося вещества. Метод позволял обнаружить до 1.0 х 10 "13 М холерного токсина. Работы по получению высокоаффиннных и специфичных МКА к XT, которые предполагают использовать для разработки новых диагностикумов, ведутся и в настоящее время (Chou S.F. et al., 2004).
Сэндвич-иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ)
Суспензию клеток (106/мл), трижды отмытую в ФСБ, рН 7,2, вносили по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов и помещали в термостат до высыхания монослоя (в течение ночи). Затем отмывали лунки ФСБ, содержащим 0,01% Твин-20 и 0,5% БСА, добавляли токсиносодержащие препараты и инкубировали 2 часа при 37 С. После этого клетки отмывали вышеуказанным буфером, фиксировали в течение 7 минут 0,25% раствором глютарового альдегида, и вносили 1% раствор БСА. Через 30 минут раствор удаляли, лунки однократно промывали ФСБ. Далее анализ проводили по вышеописанной схеме GMl-ИФА.
Раствор МКА, разведенных в 0,05М КББ в концентрации 5 мкг/мл вносили в лунки планшетов и оставляли в течение 2 часов при 37 С и затем - в течение ночи при 4 С. Блокировали свободные сайты на пластике 1% раствором БСА в течение 30 минут, после чего вносили токсиносодержащие препараты, разведенные в ФСБ до 1:2-1:10. Через 1 час инкубации при 37С лунки отмывали ФСБ рН 7,2, содержащим 0,01% Твин-20 и 0,5% БСА. Далее анализ проводили по выше описанной схеме GMl-ИФА.
Исследуемые образцы токсина или супернатанта бульонной культуры вибриона титровали в культуральном 96-луночном планшете в объеме 0,05 мл бессывороточной среды, затем в каждую лунку добавляли 0,05 мл свежеприготовленной суспензии клеток линий СНО-К1, L-929, НЕр-2, HeLa, MDCK и СаСо-2 из расчета 5-Ю тыс. клеток в лунку (для формирования монослоя различной плотности). Панель инкубировали в течение ночи в С02-инкубаторе. Учет реакции клеток проводили, сравнивая морфологию опытных 2.10 Криоконсервирование
По 5x106 жизнеспособных гибридных клонов разливали по ампулам и замораживали в криозащитной среде, состоящей из 40% среды RPMI-1640, 50% СПК и 10% глицерина. Ампулы хранили в сосудах Дюара с жидким азотом.
2.11 GMl-иммуноферментный анализ (GMl-ИФА) 1 мг сухого препарата ганглиозидов первоначально растворяли в 1 мл 70% этанола, после чего раствор GM1 разводили до 5 мкг/мл в 0,05М карбонат-бикарбонатном буфере (КББ), рН 9,6, вносили в лунки планшета в объеме 100 мкл и оставляли при в течение 18 часов. Затем планшеты отмывали буфером (ФСБ-0,01% твин-0,5% БСА) и вносили 1% раствор БСА, через 30 минут раствор удаляли и вносили супернатанты, разведенные в ФСБ до 1:2-1:10. Через 2 ч инкубации при 37С лунки промывали и вносили АТС в подобранном
рабочем разведении (1:10000) на 60 минут. Через час лунки трижды промывали указанным буфером и добавляли анти кроличий пероксидазный конъюгат в разведении 1:1500 (ин-т им. Н.Ф.Гамалеи, Москва). Через 45 минут инкубации при 37 С раствор удаляли, отмывали планшеты дистиллированной водой и вносили субстратную смесь (0,4 мг/мл ортофенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,0, содержащем 0,0015% Н202) на 20 минут. Реакцию останавливали с помощью 2М FbSO,) и результаты реакции учитывали с помощью фотометра (Uniskan, В ел и кобритания).
2.12 GMl-дот-иммунологический анализ (GMl-ДИА) 1 мг сухого препарата ганглиозидов растворяли в 1 мл 70% этанола, после чего разводили в ФСБ, рН 7,4, до концентрации 5 мкг/мл. Нитроцеллюлозную мембрану (Владипор, Россия; Schleiher& Schuell, Германия) погружали в подготовленный раствор ганглиозидов на 2 минуты, после чего высушивали. Отмывали однократно ФСБ, содержащим 0,01% Твин-20 и 0,5% БСА и блокировали свободные места на мембране в течение 30 минут 1% раствором БСА. После этого НЦМ отмывали 3 раза по 5 минут вышеуказанным буфером, подсушивали. Затем точечно, по 2 мкл, наносили токсиносодержащие образцы, разведенные в ФСБ до 1:5-1:10. После этого мембрану отмывали и вносили собирали центрифугированием, надосадочную фракцию удаляли. Осадок ресуспендировали в 40 мл полной ростовой среды RPMT-1640, содержащей 1x10" М гипоксантина, 4x10" аминоптерина, 1,6x10" тимидина (ГАТ). Суспензию клеток разливали в лунки 96-луночные микропланшетов, в которые накануне были внесены перитонеальные макрофаги (фидер). Клетки инкубировали при 37С в СОо -инкубаторе («Sanyo», Япония). 2.7 Культивирование гибридом in vivo и in vitro
Гибридомы культивировали на среде RPMI-1640, содержащей 15% СПК, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл гентамицина, lxlO"5 М гипоксантина и 1,6x10" тимидина.
Для получения асцитных жидкостей вводили 10 гибридных клеток в брюшную полость мышей BALB/c, обработанных пристаном (0,5 мл). При образовании асцитной опухоли асцитическую жидкость извлекали, клетки осаждали центрифугированием и вводили следующей партии мышей, асцитные жидкости замораживали и хранили при -20 С.
2.8 Скрининг моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом Скрининг МКА к XT проводили с помощью твердофазного варианта иммуноферментного анализа с использованием ХТ-01 и ХТ-0139, очищенных на КМЦ и ХТ-01 («Calbiochem»), клеток бактерий V.cholerae Ol и V.cholerae 0139, ЛПС-ОІ и ЛПС-0139, полученных по методу O.Westphal (1965). 2.9 Клонирование гибридом
Для клонирования использовали метод предельных разведений на 96 луночных планшетах с фидером. Гибридомы суспендировали в 1 мл среды и определяли концентрацию жизнеспособных клеток в камере Горяева в тесте с трипановым синим. Затем суспензию разводили полной ростовой средой с таким расчетом, чтобы в лунку попало 1-2 гибридные клетки, и в объеме 50 мкл вносили в лунки панелей. культивировали на среде ДМЕМ с 10% СПК, 2 мМ глютамина, 2мМ пирувата и 50 мкг/мл гентамицина. Пересевы клеток линий СНО-К1, НЕр-2 и L-929 осуществляли 2 раза в неделю с помощью 0,25 % раствора трипсина («Serva»). Пересевы СаСо-2, MDCK осуществляли с помощью раствора, содержащего 0,25% трипсин и 0,02% ЭДТА («Serva», ФРГ) в соотношении 1:3 (Методы культивирования клеток: Сб. науч. тр. -Л.,1988).
Для получения гибридом использовали перевиваемую клеточную линию мышей BALB/c-NSO/І, дефектную по гену гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ). Клетки культивировали на среде RPMI-1640 («Flow», Великобритания), содержащей 15% СПК, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл гентамицина и пересевали 2-3 раза в неделю с кратностью рассева 1:4-1:5.
Применение варианта GMl-ИФА для обнаружения и количественного определения XT
Наиболее часто в работах зарубежных и отечественных исследователей для тестирования холерного токсина используется метод на основе ганглиозидов GM1, которые являются естественными рецепторами холерогена. Согласно методу GMl-ИФА, фиксированные на пластике ганглиозиды GM1 взаимодействуют с находящимися в исследуемом образце молекулами XT, затем последовательно вносят в лунки кроличьи антитоксические антитела и антивидовые иммуноглобулины, меченные ферментом, в результате чего образуется комплекс, который выявляется колориметрически при добавлении субстратной смеси.
Для постановки метода GMl-ИФА были использованы препараты XT-Ol «Calbiochem», XT-Ol, очищенный на D-галактозе, ХТ-01 и ХТ-0139, очищенные путем бач - адсорбции на КМЦ, а также антитоксическая сыворотка АТС-01 (сер. 581), полученная к ХТ-01, очищенному по методу J.D. Clements (1979).
При отработке метода первоначально установили наиболее оптимальные условия сенсибилизации микропланшетов ганглиозидами GM1. Сенсибилизацию последних проводили в растворе КББ (рН 9,0), как это было использовано в ряде работ (Clements R.L. et al.,1979; Clarke G.J et al., 1988; Dawson, 2005). Ганглиозиды фирмы «Serva» и полученные в Ростовском ТГИПЧИ по методу А.-М. Svennerholm (1986), растворяли в КББ до 1 мг/мл и титровали в объеме 50 мкл в диапазоне концентраций от 500 мкг до 0,1 мкг/мл, после чего оставляли на ночь при 25С. Затем определяли чувствительность метода, используя препарат ХТ-569, очищенный на D-галактозе, так как, согласно характеристике, он был более активен, чем XT «Calbiochem» и не содержал в своем составе примесей других белков (электрофоретически чистый), в концентрациях 150, 100, 75, 35, 20 и 10 нг/мл. Согласно результатам, представленным на рис. 9, минимальное количество XT, которое может быть выявлено в GMl-ИФА в случае использования ганглиозидов GM1 в концентрациях 100-500 мкг/мл и 1,0 -ОД мкг/мл составляло 100-150 нг/мл. Лучшие результаты были получены при условии сенсибилизации планшетов ганглиозидами GM1 в дозе 5-10 мкг/мл. Чувствительность метода в этом случае составила примерно 75 нг/мл. Другими словами, с помощью GMl-ИФА можно выявлять в токсиносодержащих образцах не менее 75 нг XT.
Рисунок 9. Влияние на чувствительность GMl-ИФА сенсибилизирующей дозы
ганглиозидов по оси ординат - минимальное количество XT, выявляемое в ИФА; по оси абсцисс - концентрация GM1.
Для того чтобы было возможным количественно определять содержание XT в культуральных жидкостях холерных вибрионов, нами был построен калибровочный график относительно препарата ХТ-569В (рис. 10). Для этого в лунки планшета с ганглиозидами GM1 (5 мкг/мл) внесли препарат XT в различных концентрациях (от 0 до 600 нг/мл), после чего анализ провели по обычной схеме. ОП, 450 нм 1 :-0,8-0,6--0,4:-0,2: 0- 0 35 75 150 300 600 XT, нг/мл
Рисунок 10. Калибровочный график относительно препарата ХТ-569В
Для оценки специфичности GMl-ИФА использовали супернатанты холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп и культуральные жидкости 11 штаммов гетерогенных микроорганизмов: 3 Escherichia coli, 2 Yersinia pestis, 2 Yersinia enterocolitica, 2 Yersinia pseudotuberculosis, 2 Shigella. Установлено, что ни один из гетерологичных штаммов не дал положительных результатов в GMl-ИФА.
С помощью GMl-ИФА исследовали наличие токсина в надосадочных жидкостях 19 штаммов V.cholerae ellor (17ctx и 2 ctx") из коллекции музея РостНИПЧИ. Штаммы выращивали на среде АКЇ с активным аэрированием по M.Iwanaga (1986). Супернатанты разводили 1:10 и 1:2, после чего тестировали в GMl-ИФА. Как следует из результатов, приведенных в таблице 2, холероген был выявлен в семи из 10 супернатантов штаммов V.cholerae eltor, выделенных от человека, и в двух из 7 супернатантах V.cholerae eltor, выделенных из воды. Как видно, нам удалось выявить холероген в надосадочных жидкостях 64,7% штаммов. Максимальное количество XT, на уровне 3,6-6 мкг/мл, было зарегистрировано в надосадочных жидкостях штаммов V.cholerae classica 569В, V.cholerae eltor 1781, V.cholerae eltor 18826, V.cholerae eltor 18847. В супернатантах некоторых вибрионов холероген содержался в концентрации менее 150 нг/мл. Очевидно, что условия и продолжительность хранения вибрионов существенно сказываются на их способности продуцировать холероген и, соответственно, на эффективности выявления токсинопродуцентов.
Ложноположительные реакции были зарегистрированы при тестировании отдельных ctx" штаммов вибрионов обеих серогрупп, что дает основание предполагать наличие в супернатантах биологически активных веществ (БАВ), вступающих во взаимодействие с иммуноглобулинами АТС. Снизить их концентрацию попытались путем разведения супернатантов более чем в 10 раз, однако при этом уменьшился процент выявления токсинопродуцирующих штаммов, тогда как неспецифические результаты продолжали регистрироваться на уровне до 15%. Таким образом, очевидно, что разведение супернатантов способствовало повышению специфичность анализа, но при этом наблюдается снижение его чувствительности.
Изучение специфичности и активности МКА к XT
Известно, что холероген состоит из 2-х субъединиц - А (27,5 кД) и В5-ХТ (58 кД). Для того чтобы определить, к какой из них направлены полученные нами МКА, был проведен иммуноблоттинг. Препарат ХТ-01, был разделен в SDS-ПААГ, перенесен на НЦМ и затем обработан МКА к XT и ATC-Ol (Рис.15). G. J. Clarke et al. (1988) при постановке иммуноблоттинга с помощью антитоксической сыворотки выявили зоны, соответствующие В5-ХТ, на уровне 62 кД и В4-ХТ - на уровне 44 кД. В.А.Федоровой с соавт. (1996) было показано, что МКА к В-субъединице окрашивают область в препарате XT примерно на уровне 56кД. Аналогично в нашем эксперименте МКА 2СЗ, 4ЕЗ и 4F7 выявляли общую полосу в районе 56-60 кД, которую можно отнести к зоне пентамера В5- XT, а также линию на уровне 44кД, принадлежащую, по-видимому, к В4-субъединицам XT.
ATC-Ol, помимо этого, окрашивает зону в области 26-29 кД. Учитывая, что молекулярная масса А-субъединицы XT составляет примерно 27-28кД (Clarke G.J. et al., 1988; Williams J.P. et al., 2006), мы полагаем, что эта полоса принадлежит А-субъединице холерогена. Принимая во внимание результаты иммуноблота, можно сказать, что полученные нами МКА направлены к В-субъединице XT.
5.5 Токсиннейтрализующие свойства МКА к XT Токсиннейтрализующие свойства МКА к XT оценивали по нейтрализации цитотонического действия XT на культуру клеток СНО-К1. В лунках титровали ХТ-01 в объеме 50 мкл, затем в каждую вносили по 100 мкл свежеприготовленной суспензии клеток СНО-К1 (5000 клеток на лунку), планшеты помещали в СОг-инкубатор на сутки. Реакцию оценивали с помощью инвертированного микроскопа по изменению морфологии клеток. Под действием XT клетки СНО-К1 вытягивались, приобретали веретенообразную форму, на концах появлялись игольчатые отростки. Для оценки нейтрализующих свойств МКА в различных разведениях (от цельного до 1:50) инкубировали с токсином в течение часа при 37 С, а затем в лунки вносили суспензию клеток в количестве 5000 на лунку. Учет
результатов проводили на следующие сутки, сопоставляя морфологию клеток СНО-К1 в опытных и контрольных пробах. Было установлено, что все МКА в разведении до 1:50 нейтрализуют действие холерогена, поскольку специфического удлинения клеток не наблюдалось.
Рисунок 15. Иммуноблоттинг препарата ХТ-01. 1. Маркеры молекулярных масс; 2-4. МКА к XT 5.6 Получение препаративных количеств МКА
Концентрация иммуноглобулинов в культуральной жидкости гибридом невелика и колеблется от 10-500 мкг/мл, тогда как асцитические жидкости могут содержать от 5 до 10 мг/мл иммуноглобулинов. Поскольку в задачи исследования входила разработка диагностических тест-систем, а это требует значительных количеств МКА, нами было проведено изучение способности гибридных культур индуцировать асцитообразование.
Для получения асцитов на каждую гибридому брали по 10 мышей. За неделю до инъекции гибридных клеток проводили интраперитонеальную инъекцию 0,5 мл пристаном, после чего вводили гибридомы в количестве 107 на мышь. Оказалось, что линии гибридом 4F7, ЗВ7, 4ЕЗ «приживались» в мышах и через 15-20 дней формировали асцитные опухоли. Активность полученных асцитных жидкостей колебалась в пределах от 1:25000 до 1:100000 (таблица 6). В то же время пассирование гибридомы 2СЗ in vivo сопровождалось образованием опухоли только солидного характера. Гибридома же ЗН10 не индуцировала образование опухолей вообще.
Так как нам не удалось получить асциты при прививке гибридомы ЗН10, а объемы полученных асцитов оказались незначительными (2-3 мл), то мы использовали другой способ накопления МКА - преципитацию сульфатом аммония из культуральной жидкости (КЖ). Из таблицы 6 видно, что концентированные сульфатно-аммонийные препараты XT были активны до 1:5000-1:10000.
Известно, что после связывания XT с ганглиозидом в молекуле последнего происходят конформационные изменения, затрагивающие обе субъединицы XT, что может привести к утрате способности МКА взаимодействовать с токсином в методе GM1 -ИФА. Кроме того, показано, что большинство МКА к В-ХТ, перестают связываться с холерогеном в результате того, что эпитопы, к которым они направлены, локализованы вблизи ганглиозидсвязывающего сайта или частично перекрывают его (Адамов А.К., 1981; Lucas G.P.et al.1989; Tamplin M.L. et al., 1989).
Мы предполагали использовать полученные нами МКА в GMl-ИФА, поэтому изучили их способность вступать в реакцию с XT после его взаимодействия с ганглиозидами GM1.
Для этого 96-луночные планшеты в течение ночи сенсибилизировали ганглиозидами GM1 («Serva»), затем блокировали свободные сайты 1% раствором БСА, после чего в каждую лунку планшета вносили по 50 мкл раствора ХТ-01. Через 1 час инкубации планшеты отмывали и вносили раствор МКА к XT, разведенных в ФСБ. После промывания лунок вносили раствор антимышиного конъюгата и далее анализ проводили по обычной схеме. Оказалось, что МКА не взаимодействовали с холерным токсином после его связывания с ганглиозидами, по-видимому, из-за направленности их к эпитопам, расположенным близко к рецепторному участку. Таблица
Полученные результаты свидетельствуют, что иммунизация мышей препаратами XT, очищенными на КМЦ, не позволила получить мышиные АТС с высоким титром антител в отношении XT. Установлено также, что сыворотки содержат иммуноглобулины к ЛПС, их пул значителен особенно в случае ЛПС-0139. Однако использование препаратов XT-Ol и ХТ-0139 позволило получить 5 гибридом- продуцентов МКА к XT, специфичность которых была определена в ИФА, иммуноблоттинге и тесте нейтрализации холерогена в культуре клеток СНО-К1. Показано, что эпитопы, которые узнают МКА, локализованы вблизи ганглиозид - связывающего участка, и поэтому они не могут вступать в реакцию с XT после его взаимодействия с ганглиозидом. При дальнейшем выборе методов обнаружения токсигенных штаммов, где могут быть применены МКА, мы остановились на варианте сэндвича, так называемом ИФА двойных антител. 5.8 Разработка ИФА с использованием МКА к холерному токсину (ИФА-2АТ)
Двойной антительный сэндвич иммуноферментный анализ (ИФА-2АТ) для детекции термолабильных энтеротоксинов был предложен в 1977 г. R.H. Yolken. Суть метода состоит в том, что выявляемый холероген оказывается заключенным между двумя слоями специфических иммуноглобулинов. В 1996 г. В.А. Федорова с соавт. отметили наиболее высокую специфичность следующего варианта ИФА-2АТ: нитроцеллюлозную мембрану сенсибилизировали иммуноглобулинами специфической антитоксической сыворотки, а после связывания XT добавляли МКА к холерогену. В связи с этим первоначально именно этот вариант и был нами апробирован.
