Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы
1. Общие сведения о плазмидах бактерий . 8
2. Факторы переноса и другие конъюгативные плазмиды. 13
3. Неконъгогативные плазмиды. 21
4. Мобилизация на перенос конъюгативными плазмидами неконъюгативных. 27
5. Мобилизация и происхождение плазмид лекарственной резистентности бактерий. 34
ГЛАВА II Материалы и методы исследования
1. Штаммы бактерий. Плазмиды и фаги. 38
2. Питательные среды и реактивы. 39
3. Скрещивания. Выделение трансконъюгантов. 40
4. "Трехродительские" скрещивания. 41
5. Маркирование фактора рАР42 транспозоном Тп5. 42
6. Определение уровня резистентности бактерий к антибиотикам. 43
7.Выделение плазмидной ДНК. 43
8. Рестрикция плазмидной ДНК. 45
9. Электрофорез плазмидной ДНК. 45
10. Определение активности е-лактамазы ТЕМ-типа. 45
11. Изучение пилей, детерминируемых плазмидами. 47
12. Определение спонтанной элиминации плазмид. 47
13. Определение элиминации плазмид, индуцированной этидиум-бромидом. . 48
14. Определение стабильности коинтегративных плазмид. 48
15. Определение совместимости (несовместимости) . 48
16. Определение чувствительности бактерий к донорспецифическим фагам. 49
17. Определение колициногенности бактерий. 49
ГЛАВА III Результаты
1. Мобилизационная способность фактора рАР42 и его транспозонсодержащих вариантов рАР42::Tnl И рАР42::Тп9. 51
а) Определение частоты мобилизации фактором рАР42 неконъюгативных плазмид . 51
б) Определение частоты мобилизации фактором pAP42::Tnl неконъюгативных плазмид. 55
в) Определение частоты мобилизации фактором рАР42::Тп9 неконъюгативных плазмид. 60
2. Поиски и идентификация коинтегративных плазмидных структур в трансконъюгантах, селекционированных из "трехродительских" скрещиваний E.coii. 64
а) Определение донорской способности трансконъюгантов, содержащих мобилизующую и мобилизуемую плазмиды. 65
б) Спонтанная элиминация плазмид из клеток-трансконъюгантов, выделенных из "трехродительских" скрещиваний. 76
в) Индуцированная этидиум-бромидом элиминация плазмид из клеток-трансконъюгантов,
выделенных из "трехродительских" скрещиваний, 78
г) Определение совместимости (несовместимости) исходного фактора переноса с предполагаемыми коинтегративными плазмидами . 83
д) Природа инактивации маркера Тсг. 88
3, Свойства идентифицированных коинтегративных плазмид, 92
а) Определение молекулярных масс коинтегративных плазмид. 92
б) Изучение пилеобразования,контролируемого коинтегративной плазмидой рині. 98
в) Определение диапазона трансмиссивностикоинтегративных плазмид. Ю2
г) Определение уровня резистентности кампициллину. III
д) Определение активности fl-лактамазы,детерминируемой коинтегративными плазмидами. из
CLASS ГЛАВА ІV Обсуждение результатов Ш CLASS 129
Выводы
Литература
- Общие сведения о плазмидах бактерий
- Штаммы бактерий. Плазмиды и фаги.
- Определение частоты мобилизации фактором рАР42 неконъюгативных плазмид
- Определение совместимости (несовместимости) исходного фактора переноса с предполагаемыми коинтегративными плазмидами
Введение к работе
Актуальность темы. Одно из новейших направлений микробиологии связано с возникновением и развитием учения о плазмидах бактерий. В рамках интересов медицинской микробиологии существенный научный и практический интерес представляют плазмиды, которые детерминируют лекарственную резистентность (R-плазмиды), способ -ность синтезировать белки-бактериоцины (плазмиды бактериоциноге-нии), гемолизины (плазмиды Hly), энтеротоксины (плазмиды Ent) и некоторые другие свойства бактерий.
Многочисленные данные, которые опубликованы в последние 20 лет, с несомненностью свидетельствуют о том, что в возникновении и распространении лекарственной резистентности существенная роль принадлежит конъгогативным (трансмиссивным) R-плазмидам. Однако показано, что в детерминировании лекарственной резистентности бактерий принимают участие также и неконъюгативные (нетрансмиссивные) плазмиды лекарственной резистентности. В то время, как механизмы передачи (переноса) конъюгативных R-плазмид оказались в значительной мере выясненными, изучение механизмов передачи не-конъюгативных плазмид оказалось менее результативным.
Хотя установлено, что передача неконъюгативных плазмид от одних бактерий к другим обеспечивается мобилизацией их конъюга-тивными плазмидами, к началу наших исследований было неясно, ка* кова мобилизационная способность конъюгативных плазмид типа факторов переноса (подобных плазмиде р классического типа) и како -вы взаимоотношения между плазмидами типа факторов переноса и не-конъюгативными плазмидами лекарственной резистентности в процессе мобилизации последних на перенос. Наконец, было неизвестно также, способны ли факторы переноса и неконъюгативные плазмиды формировать коинтегративные структуры, сходные с природными конъ- югативными R-плазмидами, идентифицируемыми в штаммах кишечных и других бактерий, выделенных от здоровых и больных людей и животных. Между тем решение этих вопросов представляет существенный интерес для понимания механизмов формирования и распространения конъюгативных R-плазмид в популяциях бактерий, для выработки эффективной тактики и стратегии предупреждения или преодоления лекарственной резистентности бактерий, имеющих значение в инфекционной патологии.
Целью настоящей работы явилось изучение мобилизационной способности р-подобной плазмиды типа фактора переноса рАР42, идентифицированной на кафедре биологии и общей генетики Университета дружбы народов им.П.Лу.иумбы (Е.В.Губарь и др., 1981), и взаимоотношений этой плазмиды с неконъюгативными плазмидами резистентности в процессе мобилизации последних в Е.соїі. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи исследований:
Изучить способность плазмиды рАР42 мобилизовать на перенос НбКОНЪЮГаТИВНЫе ПЛазМИДЫ pMR5, pBR322, pACYCT84, RSFIOIO, RSF2I24 И pSCIOI.
Определить характер взаимодействия между мобилизующей (конъгогативной) и мобилизуемыми (неконъюгативными) плазмидами в процессе мобилизации последних на перенос и осуществить поиск коинтегративных плазмидных структур, формируемых мобилизующей и мобилизуемой плазмидами.
В случае идентификации плазмидных коинтегратов изучить их свойства.
Исследования выполняли в соответствии с программой "Плазмида".
Научная новизна. В результате выполненных исследований получен ряд новых данных. Изучена мобилизационная способность плазмиды рАР42 в Е.соїі и определены частоты мобилизации разных неконъюгативных плазмид. Показано, что мобилизация неконъюгативных плазмид, имеющих маркер резистентности к тетрациклину, сопровождается инактивацией последнего. Впервые установлено,что наряду с агрегатами, в процессе мобилизации фактором переноса рАР42 не -конъюгативных плазмид расїсі84, RSP2124 и pscioi в е.соіі формируются стабильные коинтегративные плазмиды, которые по основным свойствам сходны с R-плазмидами, идентифицируемыми в кишечных бактериях природных штаммов.
Практическая ценность. Данные о мобилизации на перенос не-конъюгативных плазмид конъюгативными и возможность формирования на их основе конъюгативных R-плазмид позволяют прогнозировать распространение лекарственной резистентности среди бактерий.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзном совещании по программе "Плазмида", г.Саратов,1983г.; на научном семинаре кафедр микробиологии и биологии и общей генетики УДН им.П.Лумумбы, 1984т.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
Общие сведения о плазмидах бактерий
Плазмиды - это кольцевые, автономно реплицирующиеся молекулы ДНК, которые существуют в бактериальных клетках обособленно от хромосомы последних.х Некоторые из плазмид способны включаться в хромосому клетки-хозяина, переходя из автономного состояния в интегрированное. Оба эти состояния альтернативны. Размеры плазмид различны. Молекулярная масса одной из самых мелких плазмид составляет около 1,5 мегадальтона (Coza-relly et al.,1968). Этого достаточно для кодирования, примерно, двух белков средней величины. Крупные плазмиды обнаружены в бактериях, принадлежащих к родам Pseudomonas и Rhizo-bium. Молекулярные массы этих плазмид составляют 200-300 ме-гадальтон (Beynon et al., 1980; Krol et al., 1980; Vincze et al., 1981). Идентифицированы также плазмиды, молекулярная масса которых превышает 450 мегадальтон (Rosenberg et al., 1982). В настоящее время показано, что плазмиды широко распространены среди бактерий различных видов, принадлежащих к родам Escherichia, Bacteroides, Salmonella, Shigella, Serratia, Proteus, Pasteurella, Erwinia, Pseudomonas, Streptococcus, Staphylococcus, Neisseria, Haemophilus, Klebsiella, Agrobacerium, Bacillus, Vibrio, Yersinia и многим другим. В бактериальных клетках плазмиды присутствуют в разных количествах плазмидных копий. Как правило, крупные плазмиды В обзоре литературы и в описании результатов собственных исследований использованы рекомендации по номенклатуре и терминологии в плазмидной проблематике (ciowes,I972; Novick et al., 1976). представлены одной или двумя копиями на клетку, тогда как количество мелких плазмид достигает 10 и более копий на клетку (Bazaral, Helinskl, 1970). Поскольку плазмиды присутствуют не во всех бактериальных клетках (штаммах) одного и того же вида, можно заключить, что они не несут генов, ответственных за жизненно важные функции бактерий, однако плазмиды оказывают влияние на выживаемость своих хозяев. Клетки, содержащие плазмиды, имеют дополнительные пищевые потребности, что проявляется в увеличении времени генерации, уменьшении массы бактериальных клеток. При выращивании на синтетической среде с пониженным содержанием источников энергии, снижается выживаемость клеток, содержащих плазмиды, по сравнению с бесплазмидными клетками (Goidwin, stater, I979J Klemperer et al., 1979} Zuncl, Lebek, 1980).
В то же время, присутствие плазмид в бактериях позволяет последним занимать определенные "экологические ниши" (Sher-ratt, 1982). Так, например, различные плазмиды обеспечивают успешное существование своих хозяев из рода Pseudomonas в совершенно необычных условиях в присутствии субстратов, таких как камфора, толуол, салициловая кислота (В.В.Кочетков, A.M. Воронин, 1981; Chakrabarty, 1976).
В настоящее время известно несколько типов плазмид. В медицинской микробиологии большое внимание исследователей привлекают R плазмиды, которые имеют очень важное значение по той причине, что они определяют устойчивость бактерий к антибиотикам и другим химиотерапевтическим веществам (Palkow s., 1975). Эти плазмиды бывают как конъюгативными, так и неконъюгативны-ми.
Широко известны плазмиды, кодирующие синтез бактериоци-нов. У кишечных бактерий они кодируют синтез колицинов (плаз - 10 миды Col). Среди этих плазмид также встречаются как конъюгатив-ные, так и неконъюгативные (Reeves, I972f Watson et al.,1981). В клетках штаммов E.coli, выделенных от людей и животных, установлены плазмиды Ent, ответственные за продукцию термостабильного и термолабильного энтеротоксинов (So et al., 1975а ) Известны плазмиды Vir, которые обнаружены в бактериях рода Salmonella. Эти плазмиды участвуют в контроле вирулентности бактерий OOrskov, 0rskov, 1966). Идентифицированы плазмиды ніу, детерминирующие синтез гемолизинов. У E.coli эти плазмиды контролируют синтез «Л, Ви/ гемолизинов. (Smith, Halls, 1967; Walton, Smith, 1969; Goehel, Schremph, I971). Выявлены плазмиды биодеградации ЗАЪ, САМ, тої», NAL и другие, обеспечивающие бактерии способностью расщеплять органические соединения - салициллаты, камфору, толуол (А.Л.Хейна-ру, 1979; В.В.Кочетков, A.M.Воронин, 1981; Chackraharty, 1976; Williams, Worsey, 1976} Konnors, Barnsley, 1982). У стрептомицетов - продуцентов антибиотиков, обнаружены плазмиды, принимающие участие либо в самом процессе образования антибиотика, либо в регуляции его образования (Hopwood, 1978). Известны плазмиды Ті, обеспечивающие Agrohacterium tume-faciens способностью вызывать у высших растений образование "корончатых галлов", представляющих собой злокачественные опухоли (Zaenen et al., 1974; Brummond, 1979). Установлены плазмиды, повышающие уровень мутагенеза у бактерий (Howarth, 1966; Mortelman, Stoker, 1976). Наряду сппазмидами, детерминирующими признаки бактерий, существуют так называемые критические плазмиды, значение которых для бактерий-хозяев пока не выяснено (В.И.Голубков и др., Sparks and Lacy, 1980; Callihan et al., 1983; Croft et al.,1983).
Современная классификация плазмид разных типов основана на учете их способности к самостоятельному переносу в процессе конъюгации, типа систем tra, несовместимости и других признаков (А.П.Пехов, 1978; Datta, 1977; Smarda, 1982). По признаку трансмиссивности плазмиды классифицируются на конъюгативные (трансмиссивные) и неконъюгативные (нетрансмис-сивные) (Hovick et al., 1976). Конъюгативными являются те плазмиды, которые способны осуществлять собственный перенос от одних клеток к другим в процессе конъюгации и придают им свойства генетических доноров. Среди конъюгативных плазмид различают факторы переноса, типичным представителем которых является плазмида Р, и коинтегративные плазмиды, например, R, Col v, Col в и многие другие (Е.В.Губарь, А.П.Пехов, 1982; Kontomi chalou et al., 1970). Неконъюгативные плазмиды не способны к самостоятельной передаче в реципиентные клетки и не придают им донорских свойств (Novick et al., 1976).Наиболее известными неконъюгативными плазмидами являются плазмиды СОІЕІ, съошчз, рмві и другие (lieze et al., 1969; Betlach et al., 1976). Различают р-подобные, l-подобные, N-подобные и другие конъюгативные плазмиды, которые характеризуются различиями в системах переноса и характере детерминиуемых ими пилей,синтезируемых на поверхности бактериальных клеток (Мейнелл, 1976; А.П.Пехов, 1978). В настоящее время большое внимание привлекает классификация плазмид по признаку их несовместимости. Под несовместимостью понимают явление, когда две плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной и той же бактериальной клетке. К одной группе несовместимости относят несовместимые между собой плаз - 12 миды. Напротив, если плазмиды совместимы, то их относят к разным группам несовместимости. Считают, что эта классификация отражает филогенетическое родство между плазмидами одной и той ЖЄ группы (Datta, 1975, 1977).
В пользу такого предположения свидетельствуют данные о корреляции между несовместимостью и другими свойствами бактерий. Установлено, что внутри каждой группы несовместимости степень гомологии последовательностей ДНК несовместимых плазмид достаточно высока, тогда как совместимых плазмид из разных групп -незначительна (Grindiey et al., 1973). Однако, иногда высокая гомология ДНК может иметь место у совместимых плазмид, а низкая ГОМОЛОГИЯ - у несовместимых (Taylor, Grant, I977;Willshaw et al 1978).
Штаммы бактерий. Плазмиды и фаги.
Скрещивания донорских и реципиентных клеток проводили по стандартной методике (ciowes, Hayes,1968) с некоторыми модификациями. Культуры доноров и реципиентов выращивали раздельно в МПБ в течение 18 часов при 37С. Затем из разводили в 10 раз в свежем теплом МПБ, подращивали 3 часа с аэрацией при 37С и смешивали в соотношении 1:4. Смеси помещали в термостат при 37С на - 41 2 часа, после чего их разводили в физиологическом растворе и по 0,1 мл из разведений высевали на чашки со средой,обеспечивающей селекцию различных классов трансконъюгантов. Посевы инкубировали 24-48 часов при 37С. Учет результатов проводили годсчи-тыванием количества выросших колоний-трансконъюгантов. Для контроля в каждом опыте на селективные среды, обеспечивающие отбор трансконъюгантов, высевали раздельно взвеси клеток скрещиваемых культур. Учитывали лишь те опыты, в которых клетки исходных штаммов не формировали колоний. Частоту передачи плазмидных маркеров определяли как число соответствующих трансконъюгантов в пересчете на I клетку донорского штамма конъюгационной смеси. Для осуществления межвидовых и-межродовых скрещиваний конъюгационные смеси готовили путем смешивания донорских и реци-пиентных клеток в соотношении 1:4 или 1:10, инкубировали 18 часов при 37С. 4. "Трехродительские" скрещивания "Трехродительские" скрещивания проводили по стандартной методике (А.П.Пехов и др., 1980), в соответствии с которой культуры донорских клеток, содержащих факторы переноса, и клеток "промежуточных" реципиентов, содержащих неконъюгативные плазмиды, выращивали раздельно в МПБ в течение 18 часов при 37С. Затем их разводили в 10 раз в теплом МПБ и подращивали 3 часа с аэрацией при 37С. После этого по 0,1 мл взвеси клеток донорских и реципиентных штаммов смешивали в 10 мл свежего МПБ и помещали в термостат при 37С на 18 часов (конъюгационная смесь I). 18 часовую культуру "окончательного" реципиента, т.е.бес - 42 плазмидного штамма, также разводили в 10 раз в МПБ и выращивали при 37С 3 часа с аэрацией. После этого в 10 мл теплого МПБ добавляли 0,1 мл конъюгационной смеси I и 0,4 мл взвеси клеток "окончательного" реципиента и помещали в термостат при 37С (конъюгационная снедь-И). Через 18 часов инкубирования производили высевы из соответствующих разведений по 0,1 мл конъюгационной смеси П на чашки с селективной средой. Посевы инкубировали 48 часов при 37С, после чего проводили учет выросших транс-конъюгантов.
Для контроля в каждом опыте высевали раздельно взвеси исходных скрещиваемых культур на аналогичные селективные среды. Кроме того, параллельно проводили контрольные скрещивания клеток "промежуточных" реципиентов, содержащих неконъюгативные плазмиды, с клетками "окончательного" реципиента. Частоту передачи фактора генетического переноса и частоту мобилизации неконъюгативных плазмид определяли как число соответствующих трансконъюгантов на I клетку "окончательного" реципиента. Трансконъюганты из всех скрещиваний очищали пересевом на идентичные селективные среды. С целью изучения их генетической структуры проводили анализ наследования неселективных маркеров, т.е. определяли устойчивость трансконъюгантов к антибиотикам путем пересева на МПА с добавлением соответствующих антибиотиков или сульфаниламида, а также проверяли их отношение к фагу MS2. В необходимых случаях определяли способность трансконъю-вантов к продукции колицина. 5. Маркирование фактора рАР42 транспозоном Тл5 Маркирование фактора переноса рАР42 транспозоном Тп5 (устойчивость к канамицину) проводили в "трехродительских" Nair, содержащие фактор переноса рАР42, "промежуточным" реципиентом служили клетки E.coii KSI324, содержащие транспозон Тп5, а "окончательным" реципиентом являлись клетки E.coii C600Rifr. Предполагалось, что транспозиция транспозона Тп5 с хромосомы клеток KSI324 на фактор переноса,обеспечит маркирование последнего. Селекцию трансконъюгантов вели на МПА с добавлением кана-мицина (100 мкг/мл) и рифампицина (50 мкг/мл). Идентифицированные трансконьюганты пересевали на идентичную среду и проверяли на чувствительность к фагу MS2. Включение транспозона Тп5 в плазмиду рАР42 проверяли путем передачи последней в реципиент-ные клетки E.coii APII5Nalr. 6. Определение уровня резистентности бактерий к антибиотикам С этой целью 0,1 мл культуры в стационарной фазе роста, разведенной в физиологическом растворе (4.103-6»103 бактериальных клеток), высевали на МПА, содержащий различные концентрации антибиотика. За уровень резистентности принимали минимальную концентрацию антибиотика, при которой не происходило видимого роста Через 18-20 ЧаСОВ ИНКубированИЯ При 37С (Barth e ai., 1978а). 7. Выделение плазмидной ДНК ДНК плазмид выделяли по методу Meagher с соавт. (1977) с некоторыми модификациями. Для этого 18 часовые культуры клеток осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 40 минут при 0С.Х Осадок ресуспендировали в 25 мл буфера TES х Все последующие процедуры до добавления CsCi проводили при 0С. - 44 (50mM NaCl5mM ЭДТА; ЗОтМ Трис; рН 8,0) и вновь центрифугировали в тех же условиях. Полученный осадок ресуспендировали в 10 мл 25% трис-сахарозы (рН 8,0) для образования сферопластов, после чего во взвесь прибавляли 2 мл лизоцима (в концентрации 10 мкг/мл) в 250шМ трис-нсі и смесь инкубировали 5 минут. Затем к смеси добавляли 0,5 мл 250шМ ЭДТА (рН 8,0) и после перемешивания инкубировали 15 минут. Затем добавляли 5 мл лизирующей смеси (10% раствор Тритона Х-100 - 3 мл; 250шМ ЭДТА - 75 мл; ІОООшМ Трис-нсі - 15 мл; Н0 - 7 мл), осторожно перемешивали, после чего лизат центрифугировали при 15000 об/мин в течение 60 мин. К надосадочной жидкости добавляли хлористый натрий до концентрации ІОООшМ. После растворения соли надосадочную жидкость смешивали с 1/3 объема 40% полиэтиленгликоля и оставляли на 18 часов при t6C. Препарат центрифугировали при 3000 об/ мин, образовавшийся осадок растворяли в 20 мл TES И добавляли хлористый цезий (csci) из расчета 1,1 г на I мл смеси. Центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут при 20С, сливали раствор из-под белкового слоя, добавляли этидиум-бромид до конечной концентрации 300 мкг/мл и доводили оптическую плот -ность препарата до значения 1,392-1,394 на рефрактометре. Препарат центрифугировали при 44 тыс.об/мин в течение 46 часов при tI8C.
После ультрацентрифугирования пробирки просматривали в УФ-свете. Из двух отчетливо различимых в УФ-свете полос отбирали нижнюю полосу, представляющую собой суперскрученную плазмидную ДНК. Этидиум-бромид удаляли четырехкратным экстрагированием равным объемом изопропилового спирта. К препарату добавляли 1/3-1/2 объема ацетата натрия, затем двойной объем этанола и оставляли на 10-12 часов при -20С. Плазмидную ДНК осаждали центрифугированием в течение 30 минут при +2С, подсушивали и раство - 45 ряли в 50 мкг раствора ТЕ (5тМ ЭДТА; ЗОшм Трис; рН 8,0). Хранили плазмидную ДНК в замороженном состоянии. 8. Рестрикция плазмидной ДНК Рестрикцию плазмидной ДНК и фага J. (контроль) осуществляли эндонуклеазой EeoRi. Реакционная смесь для эндонуклеазы EcoRI состояла из ІООшМ трис- нсі(рН 7,5), IOmM MgSO,. ДНК обрабатывали рестриктазами в течение 90 минут при 37С. Реакцию рестрикции останавливали путем прогревания проб при 65С в течение 5 минут или добавления 40 сахарозы, 0,15 мг/ мл бромфенолсинего в ІООпіМ ЭДТА (рН 8,0).
Определение частоты мобилизации фактором рАР42 неконъюгативных плазмид
Для определения частоты мобилизации фактором рАР42 неконъюгативных ПЛаЗМИД PMR5, pBR322, pACYCl84, RSF2I24, pSCIOI И RSPIOIO были осуществлены "трехродительские" скрещивания, в которых донорами являлись клетки E.coli APH5Nair, содержащие данный фактор переноса. "Промежуточными" реципиентами служили клетки Е.соїі ивібзб,содержащие неконъюгативную плазмиду рмн5 или pscioi и клетки E.coli сбоо, содержащие одну из неконъюгативных ПЛаЗМИД pBR322, pACYCI84, RSP2I24 или RSFIOI», а "конечными" реципиентами являлись клетки E.COli C600Rifr.CKpe 52 щивания проводили по стандартной методике (гл.II), при этом использовали среды, позволяющие осуществлять селекцию на каждый из маркеров неконъюгативной плазмиды, т.е. МПА с добавлением рифампицина (50 мкг/мл) и соответствующего антибиотика (25 мкг/ мл) или сульфаниламида (2000 мкг/мл).
В контрольных экспериментах осуществляли скрещивания клеток "промежуточных" реципиентов, содержащих одну из неконъюга-тивных плазмид, с клетками "окончательного" реципиента, а также производили контрольные раздельные высевы донорских и реци-пиентных клеток на селективные среды, обеспечивающие отбор трансконъюгантов.Результаты определения мобилизационной способности фактора рАР42 приведены в таблице I.
Как видно из этой таблицы, фактор переноса рАР42 способенно с разной частотой. Наиболее высокая частота мобилизации выявлена при мобилизации неконъюгативной плазмиды RSP2I24, детерминирующей устойчивость к ампициллину. Частота мобилизации в этом случае составляет величину порядка 8,6» 10 . Частота мобилизации плазмиды pBR322 (по маркерам Арг и Тс1) оказалась наиболее низкой (ІД.І0""6; 1,0.10-8). Что касается неконъюгативной плазмиды pscioi, имеющей единственный маркер (устойчивость к тетрациклину), то из скрещиваний, в которых изучали ее мобилизуемость плазмидой р АР42, выделить трансконъюганты не удалось.
Анализ результатов скрещивания показывает, что частота мо-билизацииодной и той же конъюгативной плазмиды, определяемая по частоте формирования трансконъюгантов при селекции последних на разные маркеры, оказалась неодинаковой. Так, частота мобилизации плазмиды рШ5, определяемая по частоте переноса ее мар - 53 Таблица I Мобилизационная способность фактора рАР42 частот мобилизации, определяемых по ее маркерам Арг и Кшг. На один порядок ниже была также частота формирования траноконъюгантов при селекции их- на устойчивость к тетрациклину в сравнении с частотой формирования траноконъюгантов при селекции их на устойчивость к ампи -циллину (плазмида pBR322) и к хлорамфениколу (плазмида pACYCi84).
Что касается плазмиды RSPIOIO, ТО частота переноса, учитываемая по переносу ее маркеров, детерминирующих устойчивость к стрептомицину и сульфаниламидам, оказалась практически одинаковой (1,9«10-3; 1,8 10 ).
Чтобы убедиться в том, что выделенные из "трехродитель-ских" скрещиваний трансконъюганты содержат как коныогативную (мобилизующую), так и неконъюгативную (мобилизуемую) плазмиды, мы определяли наличие у траноконъюгантов неселективных маркеров. С этой целью отбирали по 25 траноконъюгантов с разными фенотипами, идентифицированных в "трехродительских" скрещиваниях, очищали путем пересева их на идентичные среды и анализировали на устойчивость к соответствующим антибиотикам и чувствительность к донорспецифическому фагу MS2. Кроме того, транс - 5 коньюганты, полученные в результате мобилизации на перенос плаз-миды RSF2I24, проверяли на способность к продукции колицина, используя в качестве индикаторной культуры клетки штамма Е.СОІІТ. Результаты этих исследований приведены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, все трансконъюганты чувствительны к фагу MS2. Следовательно, они содержат фактор рАР42. Далее, 92% всех трансконъюгантов, селекционированных на устойчивость к ампициллину, а также 92% трансконъюгантов, селекционированных на устойчивость к канамицину, содержали фактор рАР42 и все маркеры антибиотикореэистентности неконъюгативной плазмиды. Остальные трансконъюганты этих классов (по 8%) были чув ствительны к тетрациклину, хотя неконъюгативная плазмида pMR5 контролирует устойчивость к данному антибиотику, В то же время, трансконъюганты, селекционированные по признаку устойчивости к тетрациклину, обладали всеми маркерами как коныогативной,так и неконъюгативной плазмид. Аналогичное явление наблюдалось и при анализе трансконъюгантов, полученных в результате мобилизации фактором рАР42 неконъюгативных плазмид pBR322 и pACYCI84 .
Анализ селективных и неселективных, маркеров трансконъюгантов, идентифицированных в скрещиваниях, где мобилизуемыми были плазмиды RSP2I24- и RSFIOIO, показал, что все они содержат одновременно маркеры конъюгативной и неконъюгативной плазмид. Обобщая полученные результаты, можно заключить, что фактор переноса рАР42 мобилизует на перенос неконъюгативные плазмиды pMR5, pBR322, PACYCI84, RSF2I24 И RSFIOIO С разной ЧаСТОТОЙ. Кроме того, мобилизация неконъюгативных плазмид pMR5, pBR322 и РАСТСТ84 может сопровождаться "потерей" трансконъюгантами резистентности к тетрациклину. б) Определение частоты мобилизации фактором рАР4-2::тпі неконъюгативных плазмид Некоторые плазмиды, в частности, факторы переноса, не имеют признаков, удобных для изучения этих плазмид. Поэтому подобные плазмиды маркируют транспозонами (В.Н.Решетникова и др., І98І; Finger, Crishnapiiiai,i980). Однако, в литературе имеются сведения о том, что включение транспозона может приводить к изменению свойств плазмиды (Э.В.Филькова, Н.Ё.Березкина, 1981; Л.В.Крашенинникова, А.Р.Федотов, 1983; Н.Й.Буянова и др., 1984; Seelke et al., 1982).
С целью определения возможного влияния транспозона Tni на мобилизационную способность фактора рАР42, мы проводили изу - 56 чение способности мобилизовать на перенос неконъюгативные плазмиды транспозонсодержащим вариантом этого фактора pAP42::Tnl.
Для определения частоты мобилизации неконъюгативных плаз-мид фактором рАР42::тпі также проводили "трехродительские" скрещивания, в которых донорами являлись клетки Е.сои АРИ5 Nair, содержащие изучаемый фактор переноса. "Промежуточными" реципиентами служили клетки Е.СОІІ ивібЗб, несущие неконъюга-тивную плазмиду PMR5 или pscioi, и клетки Е.СОІІ сбоо, содержащие ОДНУ ИЗ НеКОНЪЮГаТИВНЫХ ПЛаЗМИД pBR322, pACYCl84 или RSFIOIO. "Конечными" реципиентами являлись клетки штамма Е.СОІІ c600Rifr, использованные нами в предыдущих скрещиваниях.
Селекцию трансконъюгантов вели на селективных средах,используемых при изучении мобилизационной способности рАР42,но с добавлением ампициллина, так как плазмида pAP42::Tni несет маркер устойчивости к данному антибиотику. Поскольку неконъюгативная плазмида RSF2I24 и фактор рАР4-2::тП1 детерминируют устойчивость к одному и тому же антибиотику (ампициллину), мы не смогли определить в этих скрещиваниях мобилизуемость плазмиды RSF2I24 по частоте формирования трансконъюгантов на селективной среде, содержащей данный антибиотик. Следовательно, из этих экспериментов плазмида RSF2I24 была исключена. По этой же причине мы не выделяли трансконъюганты селекцией их на устойчивость к ампициллину при определении мобилизуемости неконъюгативных плазмид P R5 и pBR322, ограничившись выделением трансконъюгантов селекцией на резистентность к другим антибиотикам.
Определение совместимости (несовместимости) исходного фактора переноса с предполагаемыми коинтегративными плазмидами
Известно, что две близкородственные плазмиды (или характеризующиеся филогенетическим родством) не могут стабильно сосуществовать в одной и той же бактериальной клетке, что указывает на их несовместимость. Если в бактериальную клетку, содержащую плазмиду, ввести аналогичную или близкородственную плазмиду, то одна из них (вводимая или резидентная) элиминируется. Это явление, как известно, получило название несовместимости.
Руководствуясь представлениями о совместимости и несовместимости плазмид, мы предположили, что при введении исходного фактора переноса в трансконъюгантные клетки, содержащие мо - 84 билизующую и мобилизуемую плазмиды, возможны следующие исходы: 1. Вводимая плазмида и две резидентных (фактор переноса и неконъюгативная плазмида) стабильно сосуществуют в одной бактериальной клетке.Следовательно, все три плазмиды совместимы. 2. Из клетки удаляется вводимая плазмида (вводимый фактор переноса), а резидентные (фактор переноса+неконъюгативная плазмида) остаются. Это означает, что между вводимым и резидентным фактором переноса сохраняется несовместимость. 3. Из клетки элиминируются обе резидентные плазмиды. Это означает, что в клетках трансконъгоганта фактор переноса (мобилизующая) объединен с неконъюгативной плазмидой (мобилизуемой) в коинтеграт, в результате чего они и удаляются из бактериальной клетки одновременно.
С целью дальнейшего подтверждения коинтегративной природы структур, идентифицированных в трансконъюгантах АР6-42 и АР6-71 мы определяли совместимость (несовместимость) предполагемых коинтегратов pAP42::Tni/pACYCi84 и pAP42::Tn9/RSF2i24. Параллельно определяли совместимость (несовместимость) исходного фактора переноса с плазмидами, находящимися в агрегатном со -стоянии (трансконъюганты AP7-4I, API6-6I, API7-6I, АР4-64 и АР5-53). Для проведения экспериментов по определению совместимости (несовместимости) плазмид, мы предварительно маркировали фактор рАР42 транспозоном Тп5 (устойчивость к канамицину), используя методику, описанную в гл.П. Маркированный транспозоном Тп5 фактор переноса рАР42 был обозначен символами рАР42::
Определение несовместимости плазмид проводили по схеме, изложенной в главе П, в соответствии с которой фактор переноса рАР42::Тп5 вводили с помощью двухчасовых конъюгационных скрещиваний в реципиентные клетки E.coli c600Rifr, содержащие предполагаемые коинтегративные плазмиды или плазмидные агрегаты. Высевы конъюгационной смеси производили на МПА с добавлением канамицина (100 мкг/мл) и рифампицина (50 мкг/ мл) (для селекции по маркеру вводимой плазмиды). После предварительной очистки трансконъюгантов путем пересева на идентичную среду изучали клетки изолированных клонов на плазмидное содержание, т.е. проверяли на устойчивость к соответствующим антибиотикам, а в случае предполагаемого коинтеграта pAP42::Tn9/RSF2i24определяли способность продуцировать колицин. В контрольных экспериментах проводили определение несовместимости фактора переноса рАР42::Тп5 с плазмидами pAP42::Tnl и рАР42::Тп9.
Для получения данных о поверхностном исключении осуществляли контрольные скрещивания, в которых фактор переноса рАР42:: Тп5 вводили в клетки E.coli C600Rifr, лишенные плазмид. Частоту переноса плазмиды рАР42::тп5 в реципиентные клетки, содержащие исследуемые плазмиды или бесплазмидные клетки, определяли как число соответствующих трансконъюгантов в пересчете на I жизнеспособную донорскую клетку конъюгационной смеси. Индекс поверхностного исключения определяли как отношение частоты переноса вводимой плазмиды в бесплазмидные реципиентные клетки к частоте переноса вводимой плазмиды в реципиентные клетки, содержащие резидентную плазмиду.
Результаты проведенных экспериментов представлены в таблицеКак видно из этой таблицы, частота формирования трансконъюгантов при введении плазмиды рАР42::Тп5 в клетки, содержащие изучаемые плазмиды, была неодинаковой и колебалась от 2,68.10 до 5,8.10 3. Отсюда, индексы поверхностного исключения также были различны и их величины варьировали от 19 до 610.
Похожие диссертации на Изучение мобилизационной способности плазмиды (фактора переноса) рАР42
