Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Модели, используемые для анализа молекулярно-клеточных механизмов обучения 12
1.1.1. Выработка ассоциативного обучения у моллюска Pleurobranchaea caUfornica 13
1.1.2. Выработка различных форм обучения у моллюска Aplysia 14
1.1.3. Выработка ассоциативного обучения у моллюска Lymnaea stagnalis. '. 17
1.1.4 Выработка ассоциативного обучения у моллюска Hermissenda
crassicornis 18
1.2. Виноградная улитка (Helix) 19
1.2.1. Устройство ЦНС Helix 20
Церебральные ганглии 21
Париетовисцералъный комплес 24
1.2.2. Выработка неассоциативных и ассоциативных форм обучения у Helix 27
1. 3 Метаболизм и функции серотонина в ЦНС 29
1.4. Рецепторы 5-НТ. 33
1.4.1 Семейство 5-НТ1 33
Рецептор 5-НТ1А 34
1.4.2 Семейство 5-НТ2 36
1.4.3 Рецептор 5-НТЗ 37
1.4.4 Рецепторы 5-НТ4, 5-НТ6, 5-НТ7. 37
1.4.5 Семейство 5-НТ5 38
1.4.6 Рецепторы 5-НТу моллюсков 38
1.5. Участие митогенактивируемых (МАРК) каскадов в
механизмах нейрональной пластичности 39
1.5.1. Митогенактивируемый протеинкиназный каскад ERK1/2 41
Функции MAPK/ERK-каскада 42
1.5.2. Участие MAPK/ERK в механизмах пластичности у
позвоночных животных 44
1.5.3. Механизмы активации MAPK/ERK-сигнального каскада 46
1.5.4. Стрессовые протеипкиназы JNKup38 47
1.6. ДНК-связывающие транскрипционные факторы. 50
1.6.1. Транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов через SRE - элемент 51
1.6.2. Транскрипционные факторы семейства CRE 53
1.6.3. Транскрипционные факторы семейства АР-1 58
1.6.4. Транскрипционные факторы семейства С/ЕВР 61
2. Материалы и методы 63
2.1. Выработка условного оборонительного рефлекса . 63
2.2. Вестерн-блот анализ. 65
2.2.1 Экстракция белков. 65
2.2.2 Метод Вестерн блот анализа. 65
Микровариант Вестерн-блот анализа 66
2.3. Выделение РНК. 67
2.4. Синтез копии ДНК. Реакция обратной транскрипции (RT) 68
2.5. Полимеразная цепная реакция, ПЦР (PCR) 69
2.6. Иммуноцитохимический анализ. Модификация In home. 69
ГЛАВА 3. Результаты. 71
3.1. Сравнительный анализ экспрессии МАРК/ERIC в ЦНС виноградной улитки и высших позвоночных животных (крыса) 71
3.2. Анализ экспрессии и активации МАР-киназ ERK в функционально различных ганглиях ЦНС виноградной улитки при обучении 73
3.2.1. Анализ активации протеипкиназы MAPK/ERK при формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии в париетовисцеральном ганглии виноградной улитки в разные сроки после обучения 74
3.2.2 Анализ активации МАР-киназ ERK-к в париетовисцеральном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении после введения неиротоксина 5,7-ДОТ. 75
3.2.3 Исследование содержания и активации МАР-киназ ERK в педальном комплексе ганглиев виноградной улитки в разные сроки после обучения 77
3.2.4 Анализ активации MAPK/ERK в педальном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении после введения неиротоксина 5,7-ДОТ. 79
3.2.5 Исследование экспрессии и активации МАР-киназ ERK в церебральном ганглии виноградной улитки при обучении. 80
3.2.6 Исследование функционирования MAPK/ERK-каскада в идентифицируемых нейронах ЦНС виноградной улитки при обучении .85
3.3. Влияние серотонина на активацию MAPK/ERK в идентифицируемых нейронах виноградной улитки 89
3.4. Сравнение активации MAPK/ERK при обучении ювенилъных и взрослых Helix 91
3.5. Анализ активации транскрипционного фактора Elk-1 при формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии в париетовисцеральном ганглии Helix, у животных с нормальной и нарушенной способностью к обучению 93
3.6. Серотониновый рецептор 5-НТ1А (SR-1A) в ЦНС Helix 96
Заключение. 98
Выводы. 99
Список литературы 101
- Модели, используемые для анализа молекулярно-клеточных механизмов обучения
- Выработка неассоциативных и ассоциативных форм обучения у Helix
- Выработка условного оборонительного рефлекса
- Анализ экспрессии и активации МАР-киназ ERK в функционально различных ганглиях ЦНС виноградной улитки при обучении
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение молекулярно-генетических механизмов обучения и памяти является одной из основных задач фундаментальной нейробиологии. В последние годы было показано, что долговременные механизмы обучения определяются перестройками нейрональных сетей и увеличением эффективности синаптической передачи. При этом было выяснено, что формирование долговременных форм обучения невозможно без включения работы генома. В настоящее время в этой области ведется широкий фронт исследований. Обнаружен ряд белковых транскрипционных факторов (ТФ), регулирующих экспрессию генов, необходимых для формирования долговременной памяти, описаны некоторые пути их активации (Alberini et al., 1994; Martin et al., 1997; Davis et al., 2000). Однако в силу сложности устройства ЦНС, полученные сведения не столько решают проблему, сколько ставят все новые задачи.
Важнейшую роль в регуляции экспрессии генов играет митогенактивируемый протеинкиназный (MAPK/ERK, mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase) каскад. Этот каскад контролирует процесс выживания нейронов, регенерацию отростков и синаптический спраутинг (Lauder, 1993; Kaplan, Miller, 2000). Дисфункция MAPK/ERK каскада является причиной ряда нейродегенеративных заболеваний (Einat et al. 2003; Kyosseva, 2004). Свое влияние на экспрессию генов ERK-киназы, являющиеся конечным звеном MAPK/ERK каскада, оказывают через фосфорилирование нескольких ДНК-связывающих транскрипционных факторов, в том числе TCF, SRF и CREB (Herdegen and Leah, 1998; Orban et al., 1999; Thomas and Huganir, 2004). Активация MAPK/ERK каскада осуществляется широким спектром биологически активных веществ: факторами роста, гормонами, медиаторами, в том числе серотонином. Известно, что серотонин играет важную роль, как в функционировании взрослого мозга, так и в его развитии (Gaspar et al., 2003). Последние 10 лет в ведущих лабораториях мира интенсивно проводятся исследования по изучению вклада MAPK/ERK каскада в формирование долговременной памяти (Martin et al., 1997; Atkins et al, 1998; Sananbenesi et al, 2003; Thomas, Huganir, 2004). Тем не менее, регуляторные пути его активации и нижележащие процессы изучены еще недостаточно. Неизученным остается вклад MAPK/ERK-каскада в формирование механизмов долговременной памяти в онтогенезе.
Важную роль в исследованиях молекулярно-клеточных основ памяти играют моллюски (Литвинов и др. 1979; Кэндел, 1980; Nolen, Carew, 1994; Martin et al., 1997; Balaban, 2002). Моллюски имеют относительно просто устроенную центральную нервную систему (ЦНС) с большим числом гигантских нейронов, которые относительно легко идентифицируются. В нашей стране начало исследований на моллюсках (в основном на Helix) было положено Х.С. Коштоянцем, Е.Н. Соколовым и Д.А. Сахаровым. К настоящему времени у этих животных изучен достаточно богатый поведенческий репертуар, в том числе несколько форм условных оборонительных рефлексов (Балабан, Захаров, 1992; Никитин и др. 1992; Balaban and Stepanov, 1996). Идентифицированы нейрональные сети, лежащие в дуге этих рефлексов. Найдены ключевые локусы пластичности (в частности, увеличение возбудимости командных нейронов оборонительного поведения). Показано, что при выработке условных оборонительных рефлексов происходит увеличение содержания нейроспецифических белков, и это увеличение коррелирует со степенью вовлечения нейронов в дугу изучаемого рефлекса (Гринкевич, 1980; 1992). Описана важная роль серотонина в формировании данного рефлекса (Балабан, Захаров, 1992) и возможные пути индукции серотонином внутриклеточных регуляторных каскадов (Гринкевич и др., 2001). Обнаружено, что в обучение вовлекается каскад транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов через регуляторные элементы SRE, CRE и АР-1. Применение блокаторов вышележащих протеинкиназ показало, что активация данных ТФ связана с MAPK/ERK. каскадом (Гринкевич, Васильев, 1999; Гринкевич и др., 2001). Кроме того, у ювенильных животных, с незрелыми механизмами условных оборонительных рефлексов наблюдаются значительные различия в составе транскрипционных комплексов, регулирующих экспрессию генов через регуляторный элемент SRE. Так как индукция экспрессии генов через элемент SRE, МАРК-зависима, высказано предположение о важной роли этого каскада в формировании условных оборонительных рефлексов (Гринкевич и др., 2001). В связи с этим представлялось необходимым провести комплексные исследования экспрессии и активации МАР-киназ ERK в ЦНС Helix при обучении.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов, дисфункция которых приводит к неспособности животных к выработке условных оборонительных рефлексов и роль МАР-киназных каскадов в этих процессах. В связи с этим задачи работы включали:
1. Выявление экспрессии МАР-киназы ERK в ЦНС моллюска Helix hicorum.
2. Изучение динамики экспрессии и активации МАР-киназы ERK при обучении в париетовисцеральных, педальных и церебральных комплексах ганглиев Helix, играющих различную роль в формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии.
3. Изучение влияния нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых нейронов и редуцирующего выработку условных оборонительных рефлексов на активацию МАР-киназы ERK в функционально-различных ганглиях Helix.
4. Изучение экспрессии и активации MAPK/ERK в отдельных идентифицированных нейронах виноградной улитки, играющих различную роль в формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии.
5. Исследование влияния серотонина на экспрессию и активацию MAPK/ERK в отдельных идентифицированных нейронах виноградной улитки, играющих различную роль в формировании рефлекса пищевой аверзии.
6. Сравнение экспрессии и активации MAPK/ERK в ЦНС взрослых и ювенильных животных с незрелыми механизмами формирования условных оборонительных рефлексов, подвергнутых процедуре обучения.
Положения, выносимые на защиту,
1. В ЦНС Helix при обучении экспрессируется и активируется МАР-киназа ERK.
2. Степень активации MAPK/ERK отражает степень участия функционально различных ганглиев и отдельных идентифицированных нейронов в формировании условного рефлекса пищевой аверзии.
3. Дисфункция или незрелость серотонинэргической системы Helix, через дисфункцию внутриклеточного регуляторного каскада MAPK/ERK, определяет неспособность животных к формированию долговременных форм условных оборонительных рефлексов.
Научная новизна работы. Впервые показано, что в ЦНС у взрослых Helix экспрессируется МАР-киназа ERK и наблюдается ее значительная активация при выработке условного рефлекса пищевой аверзии. Степень активации MAPK/ERK в функционально разных ганглиях коррелирует со степенью их включения в дугу изучаемого рефлекса. Введение нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых терминалей и редуцирующего способность к выработке условных оборонительных рефлексов предотвращает активацию MAPK/ERK. Вышеприведенные данные свидетельствуют о важной роли серотонин-зависимой активации MAPK/ERK в формировании данного рефлекса. Впервые, при помощи микрохимического варианта метода Вестерн блот проведен анализ экспрессии и активации MAPK/ERK в отдельных идентифицированных нейронах при обучении. Показано, что максимальная степень активации MAPK/ERK наблюдается в командных нейронах оборонительного поведения ППа2/ППаЗ, являющихся основным пластическим звеном данного рефлекса, и в процеребруме, центральной обонятельной структуре, анализирующей информацию о запахах. Кроме того, впервые показано, что у ювенильных животных уровень активации MAPK/ERK крайне низок и, в отличие от взрослых, не активируется на ранних стадиях обучения. Исследования свидетельствуют о важной роли MAPK/ERK каскада в формировании долговременных форм пластичности оборонительного поведения.
Научно-практическая ценность. Полученные данные являются приоритетными и имеют важное теоретическое значение, так как позволяют глубже понять молекулярные механизмы лежащие в основе обучения и долговременной памяти. Прикладное значение имеют данные по возможности индукции MAPK/ERK каскада в изолированной ЦНС, что позволяет использовать ЦНС Helix в качестве тест-системы для скрининга биологически активных веществ, способных улучшить работу данного каскада, в частности, антидепрессантов.
Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались на III съезде ВОГиС - Генетика в XXI веке, Москва, 2004; I Съезде физиологов СНГ. Дагомыс, 2005; Международном симпозиуме "Механизмы адаптивного поведения", СПб, 2005. На конференциях молодых ученых: X Пущинской школе-конференции, Пушино. 2006; «Человек и его здоровье», СПб, 2007; «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды», СПб, 2007. XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова, Москва, 2007; П Съезде Общества клеточной биологии, СПб, 2007; Конференции «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов», СПб, 2007; PENS/Hertie winter school, «The design of neuronal Networks: Contributions from Invertebrates», Austria, Obergurgl, 2008.
Модели, используемые для анализа молекулярно-клеточных механизмов обучения
Одним из основных объектов исследования молекулярно-клеточных механизмов памяти являются моллюски. Они способны к выработке условных рефлексов, имеют крупные нейроны и жизнестойкую в условиях in vitro ЦНС, что позволяет изучать нейрональные сети, определяющие формирование условных рефлексов и моделировать простые формы обучения, создавая их клеточные аналоги. Так как среди различных форм поведения у моллюсков доминирующее место занимает пассивно-оборонительное поведение, в экспериментах широко используются выработка оборонительных рефлексов.
Наиболее распространенными объектами исследований являются морской жаберный моллюск Aplysia californica, пресноводная улитка Lymnae stagnalis, Hermissenda crassicomis и легочный моллюск Helix lucorum (виноградная улитка).
На хищном морском моллюске плевробранха {Pleurobranchaea californica) успешно проведены эксперименты по выработке условных рефлексов. В том числе и рефлекса отказа от пищи (Mpistos and Collins, 1975). Методика рефлекса пищевой аверзии разработана под руководством проф. Дэвиса из Калифорнийского университета и впоследствии она была модифицирована применительно к виноградной улитке (Максимова, 1980).
Стимулы наносились прикосновением стеклянной палочки, покрытой пюре из кальмара (естественный пищевой стимул) к околоротовой мантии плевробранхи. Такое одновременное предъявление условного (прикосновение) и безусловного (пища) стимулов вызывала пищевое поведение животного в 99% опытах. При этом только условный стимул (прикосновение чистой стерильной палочкой к околоротовой мантии животного) вызывал оборонительную реакцию животных (отдергивание) в 90 % экспериментов. Затем животных, с выработанной пищевой реакцией на прикосновение разделили на две группы - контрольную и экспериментальную и вырабатывали у экспериментальной группы избегательную реакцию на прикосновение. Ежедневно экспериментальной группе животных предъявляли 20 тактильных стимулов (с интервалом 60 секунд), прикасаясь стеклянной палочкой к околоротовой мантии животного. Если животное не проявляло оборонительного поведения (отдергивание) в течение пяти секунд, во время которых осуществлялась стимуляция, ему наносили аверзивный электрический стимул. Животные учились избегать шокового воздействия отдергиванием от палочки, которой осуществляли прикосновения. В результате обучения моллюски быстро вырабатывали реакцию избегания на прикосновение, которая сопровождалась снижением выработанной ранее пищевой реакции (Mpistos and Davis, 1973).
На Plenrobranchaea этот рефлекс также изучен на уровне нейронов (идентифицированы парацеребральные командные нейроны пищевого поведения). Показана роль этих нейронов в ассоциативном и неассоциативном обучении - у животных с выработанной реакцией пищевой аверзии снижается возбуждающий и усиливается ингибирующий ответ нейронов на пищевые стимулы (хемосенсорное и тактильное раздражение) (Davis et.al., 1983).
Аплизии свойственны различные формы поведения — от элементарных рефлексов до сложных комплексов действий (Кэндел, 1980). Этот моллюск обладает способностью к выработке неассоциативных и ассоциативных форм обучения. Нервная система аплизии относительно несложно устроена, содежит крупные нейроны, которые легко идентифицируются и характеризуются высокой жизнестойкостью в условиях in vitro, что позволило создать клеточные аналоги нескольких форм обучения (Carew et al., 1983; Byrne et al., 1989).
Значимые результаты были получены на аплизии Э. Кэнделом и соавторами при изучении неассоциативной формы обучения - сенситизации и ее клеточного аналога, долговременной фасилитации моносинаптической связи между сенсорными и моторными нейронами (Frost et al., 1985; Montarolo et al., 1986; Bailey etal., 1997).
Выработка неассоциативных и ассоциативных форм обучения у Helix
Из классических условных рефлексов у Helix наиболее хорошо изученными являются оборонительные и пищевые (Thomson, 1936; Литвинов и др., 1976, 1979; Гринкевич, 1980, 1993; Максимова, Балабан, 1983; Балабан, Захаров, 1992; Balaban, 1993). Так как у виноградной улитки отсутствуют другие формы защиты, кроме раковины, пассивно-оборонительное поведение занимает доминирующее место и широко используется для выработки условных оборонительных рефлексов. В качестве условных применяют пищевые стимулы, слабые тактильные раздражения и др. Безусловными стимулами служат ноцицептивные воздействия с помощью электрошока, или аппликации хинина. Как показано, ноцицептивные воздействия вызывают формирование поведенческой и клеточной сенситизации (Береговой и др., 1988; Максимова, Балабан, 1983; Балабан, Захаров, 1992; Никитин и др., 1992 а, б, Никитин, Козырев, 1993). Таким образом, выработка условных рефлексов на основе сенситизации приводит к возрастанию эффективности синаптических связей и усилению поведенческой реакции.
Изучение нейрональной организации поведения виноградной улитки позволило идентифицировать различные нейроны, участвующие в организации условно-рефлекторной сети оборонительных рефлексов: сенсорные, командные, модуляторные и моторные нейроны (Литвинов и др., 1976; Балабан и Захаров, 1992). Эти нейроны участвуют в формировании условно-рефлекторной сети оборонительных рефлексов и соответствуют трем уровням преобразования информации в данной рефлекторной дуге: анализирующему, принимающему решение и исполнительному (Рис. 4).
Запуск поведенческой реакции через мотонейроны осуществляют командные нейроны по закону «все или ничего». Обнаружено, что при ассоциативном обучении в одних и тех же командных нейронах оборонительного поведения возникают нейрофизиологические эффекты, характерные как для обусловливания, так и для сенситизации (Никитин и др.,
1992 б). При этом на ранних этапах формирования рефлекса наблюдается деполяризация плазматической мембраны и увеличение возбудимости командных нейронов (Литвинов, Логунов, 1979), а долговременные стадии сопровождаются пластическими изменениями синаптических компонентов этих нейронов.
При формировании условных оборонительных рефлексов у виноградной улитки в командных нейронах оборонительного поведения (ЛПаЗ) наблюдается значительное увеличение кислого мозгоспецифического белка с Rf = 1 (Гринкевич, 1980).
Показано, что модуляторные эффекты на командные нейроны оборонительного поведения Helix оказывают серотонинэргические нейроны педального ганглия. Командные нейроны не проявляют на серотонин непосредственной реакции, а изменяют свою возбудимость при активации модуляторных серотонинергических нейронов (Балабан, Захаров, 1992). Тела командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки окружены густой сетью серотонинергических терминалей, не имеющих специализированных синаптических мембранных структур, что говорит о несинаптическом, модуляторном действии на них серотонина (Vehovszky et al., 1993). РУС. 4. Упрощенная схема нервной сети оборонительной реакции моллюска. Безусловный стимул — ноцицептивное воздействие, условный — тактильный стимул. (Измененная схема из Балабан, Захаров, 1992) нт— Т й 5-НТ ТІ ЭФФЕКТОР ПСН — первично-сенсорный нейрон; КН — командный нейрон; CH — сенсорный нейрон; МН — моторный нейрон, (вмененная СЇРЧЯ балабан, Захаров. )992) У виноградной улитки, как и у аплизии, серотонин и цАМФ играют важную роль в пластичности оборонительного поведения (Чистякова, Балабан, 1988; Гринкевич, 1992; Шевелкин и др., 1997; Никитин, Козырев, 1999; Гринкевич и др., 2001). Нарушение работы серотонинергической системы ведет к нарушению формирования условных оборонительных рефлексов и их сохранения. Так, показано, что ингибирование синтеза серотонина введением животным 5,7-ДОТ (5,7-диокситриптамин) делает их неспособными к выработке долговременных форм оборонительного поведения (Балабан, Захаров, 1992).
С другой стороны, было обнаружено, что пластичность оборонительного поведения виноградной улитки изменяется в онтогенезе. До возраста 4 месяцев у этого моллюска поведенческая сенситизация еще не сформирована, а в возрасте 4-8 мес она выражена значительно слабее, чем у взрослых животных. У молодых улиток затруднена также выработка условных оборонительных рефлексов (Zakharov and Balaban 1983, 1987; Иерусалимский и др., 1997). При этом у ювенильных животных не детектируются нейроспецифические белки, содержание которых значительно увеличивается у взрослых животных при обучении (Гринкевич, 1993; Гринкевич, Васильев, 1999).
Было предположено, что причиной затруднения формирования пластичности оборонительного поведения может являться задержка формирования серотонинэргической системы модуляторных нейронов, играющих значительную роль в формировании сенситизации и условных оборонительных рефлексов у взрослых животных (Балабан, Захаров, 1992). Однако молекулярные механизмы этого явления все еще остаются недостаточно изученными.
Метаболизм и функции серотонина в ЦНС
Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-НТ) является одним из важнейших нейромедиаторов. Он содержится в самых разных органах и тканях животных. Предшественником серотонина, служит аминокислота триптофан. Первая зо стадия синтеза серотонина — превращение триптофана в 5-гидрокситриптофан (5-НТР) с помощью фермента триптофангидроксилазы — является лимитирующей. 5-НТР декарбоксилируется с образованием серотонина при участии декарбоксилазы ароматических L-аминокислот. Высвобождение 5-НТ из нейронов во время стимуляции вызывает повышение скорости преобразования триптофана в 5-гидрокситриптофан (Рис. 5).
Выработка условного оборонительного рефлекса
Перед электрофорезом белковые пробы кипятили с буфером для проб (50 мМ Трис, рН=6,8; 6% SDS; 20% глицерин; 8 % 2-меркаптоэтанол; 0,25% бромфеноловый синий) в отношении 1:1 в течение 5 мин. В качестве маркеров молекулярного веса использовали цветные белки "Novex". Экстракты нервных клеток, содержащие искомые белки, разделяли по системе Лэмли электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле. Состав разделяющего геля: 0,37 М Трис, рН=8,9; 10% акриламид; 0,1% SDS; 0,08% ПСА; 0,075% TEMED. Состав концентрирующего геля: 0,12 М Трис рН=6,8; 3,5% акриламид; 0,1% SDS; 0,04% ПСА; 0,15% TEMED. Электрофорезные буферы: трис-глициновый буфер I: (0,02М Трис; 1,3 М глицин; 0,1% SDS). Буфер II: (0,05 М Трис рН=7,5; 0,1% SDS). Длительность фореза составляла 2-3 часа при напряжении 150-190 V.
Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры с помощью аппарата для проведения полусухого блотинга. Время переноса составляло 1,5-2 часа при силе тока 1,5 мА на кв. см мембраны.
Для проверки качества переноса белков на мембрану в качестве контроля применяли окрашивание фильтров Ponceaus (разведенный в 5% уксусной кислоте). После проведения процедуры, уменьшающей неспецифическую сорбцию (инкубация с 5% Blocking reagent (обезжиренное сухое молоко) на TBS в течение 1 часа), фильтры отмывали в TBS. Затем нитроцеллюлозные фильтры последовательно инкубировали в растворах, содержащих первичные и вторичные (коньюгированные с пероксидазой хрена) антитела согласно рекомендации фирмы Amersham pharmacia biotech (протокол для работы с ECL - western blotting analysis system). Инкубацию с первичными антителами осуществляли в течение ночи при температре 4С. Для вторичного использования фильтры отмывали в глицине (0,2 М глицин-HCl, рН = 2,8; 20 минут при 55С), инкубировали 1 час в 5% обезжиренном сухом молоке и вновь инкубировали с антителами к тотальным формам MAPK/ERK.
Визуализацию и количественный анализ связывания антител проводили с использованием хемолюминесцентного метода (система ECL, фирма Amersham). Экспонирование мембран с рентгеновской плёнкой вели при комнатной температуре в течении 1-20 мин в зависимости от интенсивности свечения. Далее пленки сканировали. Количественный анализ осуществляли при помощи компьютерной программы GelPro 3.
Для исследования активации MAPK/ERK киназ использовали антитела к phospho-p44/p-42 МАР-киназам (Cell Signaling Technology, USA) Mouse-anti-P-ERK (1:1000) — Sheep-anti-mouse (1:2000). Для анализа содержания MAP-киназ ERK использовали поликлональные антитела против тотального белка -р44/р42 MAP kinase (Cell Signaling Technology, USA) в следующих разведениях: rabbit-anti-ERK (1:1000) — donkey-anti-rabbit (1:1500). Для анализа активации ТФ p-Elk в работе использовали первичные антитела к р-Е1к-1 фирмы "Santa Cruz", вторичные антитела фирмы "Amersham". Антитела применяли в следующих разведениях: Mouse - anti-p-Elk-1 (1:200) - Sheep-anti-mouse (1:2000); Rabbit -anti- Elk-1 (1:1000) - Donkey-anti-rabbit (GAR)(1:2500).
Микровариант Бестерн-блот анализа.
Микровариант метода разработали специально для работы с идентифицируемыми нейронами, так как его чувствительность позволяет работать с экстрактами белков из 2 -3 нейронов. Для работы использовали специальную камеру для микро-электрофорезов. Состав гелей и электрофорезных буферов такой же, как и для макро-варианта. Электрофорез, иммуноблоттинг и визуализацию проводили аналогично описанному выше для макро-варианта методу.
Статистическая обработка проводилась с использованием программы STASTISTICA 6 (t-критерий Стьюдента), применялся одно- и двухфакторный анализ ANOVA.
Выделение РНК. Исследование экспрессии МАРБС/ERK у Helix на уровне синтеза м-РНК проводили с использование метода ОТ-ПЦР (обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции) (Рис. 9). Начальным этапом этого исследования было выделение тотальной РНК из ЦНС улитки.
Выделение РНК проводили в стерильных условиях в отсутствии РНКаз. Все процедуры выполняли во льду. К гомогенизорованному в лизирующем буфере (50 мМ Трис, рН = 8,8; 150 mM NaCl; 5 тМ MgCl2; 1% SDS; 1 тМ EDTA, рН = 8,0) ганглию добавляли равное количество фенола, аккуратно перемешивали и вводили в состав хлороформ, смешанный с изоаминовым спиртом (22:1) + 1/Л объёма ранее добавленного фенола и осторожно перемешивали. Смесь центрифугировали 10 мин при 4000g. К водной фазе добавляли равный объем смеси фенола с хлороформом, смешанным с изоаминовым спиртом (3:1), перемешивали и центрифугировали 30 мин. Водную фазу осаждали 2,5 объемами этанола (96%) при -20С в течение ночи. После осаждения РНК вновь центрифугировали 30 мин, осадок высушивали и растворяли в 0,1М SSC. К растворенной РНК добавляли 4,5 М NaAc (2/3 і объема ранее добавленного SSC) и переосаждали в течение 3 часов на льду. Затем смесь центрифугировали, осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в воде, предварительно обработанной DEPC для удаления неспецифических РНКаз.
Анализ экспрессии и активации МАР-киназ ERK в функционально различных ганглиях ЦНС виноградной улитки при обучении
Известно, что серотонин играет значительную роль в формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения у моллюсков, опосредуя передачу подкрепляющего ноцицептивного стимула и участвуя в формирования механизмов сенситизации и условных оборонительных рефлексов (Балабан и Захаров, 1992, Шевелкин и др., 1997, Martin et al, 1997). Разрушение синаптических терминалей серотонинергических нейронов препятствует развитию долговременной потенциации, сенситизации и условных оборонительных рефлексов у улиток Helix (Балабан, Захаров, 1992, Малышев и др., 1997).
Чтобы определить зависимость активации MAPK/ERK каскада от серотонинэргической системы использовали улиток с разрушенными серотонинергическими терминалями. Для этого им вводили нейротоксин 5,7-ДОТ (диокситриптамин) в дозе 20 мкг на грамм веса животного в два этапа с интервалом 6 дней. Через 7 дней после последнего введения нейротоксина проводили обучение животных. Далее методом Вестерн блот-анализа сравнивали активацию МАР-киназ ERK у обученных животных, которым вводили физ. раствор и у обученных животных, которым вводили нейротоксин 5,7-ДОТ. Исследования проводили в разные сроки после обучения: 10 минут, 1 час, 2 часа и 4 часа.
Анализ активации MAPK/ERK в париетовнсцеральном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении, после введения 5,7-ДОТ. А. Репрезентативный иммуноблот с антителами к фосфорилнрованным (p-ERK) и тотальным (ERK) формам МАР-киназ ERK 1/2. Б. Относительное содержание фосфо-форм MAPK/ERK. Темные столбики - животные, которым вводили физиологический раствор; светлые — животные, которым вводили нейротоксин 5,7-ДОТ. Здесь и далее: по оси абсцисс — содержание фосфо-форм MAPK/ERK, отнесенное к содержанию тотальных форм в каждом образце и контролю. Контроль принят за единицу. Статистически значимое отличие от контроля, — р 0,05; — р 0,01; — р 0,001; # - статистически значимые отличия между группами, р 0,01. N=4.
Обнаружили, что разрушение серотонинергических терминален не сказывается на базальном уровне экспрессии MAPK/ERK (Рис. 13). Введение 5,7-ДОТ приводило к значительному снижению активации MAPK/ERK каскада спустя 10 мин после обучения (рис. 13) по сравнению с обученной группой, которой вводили физраствор (2,1±0,26), что свидетельствует о важной роли серотонина в регуляции активации этого каскада на ранних этапах формирования памяти. Спустя 2 ч у ДОТ-обработанных животных, как и у обученных животных, которым вводили физраствор, уровень активации MAPK/ERK падает ниже базального (0,73±0,08). Через 4 ч после обучения у ДОТ-обработанных животных, как и у интактных обученных, наблюдается рост содержания фосфорилированных форм ERK-киназ (Рис. 13).
Таким образом, введение 5,7-ДОТ, вызывающее снижение способности улиток к выработке условного рефлекса пищевой аверзии, приводит таюке к драматическому снижению активации MAPK/ERK каскада на ранних этапах формирования этого рефлекса.
Далее был проведен анализ активации MAPK/ERK спустя разные сроки после окончания процедуры обучения в педальном ганглии. Нейроны этого ганглия осуществляют модуляторные функции. Временные отрезки исследования аналогичны париетовисцеральному ганглию: 10 минут, 1 час, 2 часа и 4 часа.
В педальном комплексе ганглиев через 10 мин после обучения не наблюдали достоверного увеличения содержания p-ERK-киназ (1,3±0,4). Через 1 ч после процедуры обучения даже детектировали падение содержания p-ERK-киназ ниже контрольного (0,7]2±0,15) (Рис. 14). Через 2 ч происходило дальнейшее снижение содержания p-ERK-киназ ниже базального уровня (0,37±0,04; р 0,001). Затем, спустя 4 ч уровень ERK-киназ повышался, как и в париетовисцеральном комплексе и достоверно отличался от контроля (1,75±0,45; р 0,05). виноградной улитки при обучении после введении неыротоксина 5,7-ДОТ. А. Вестерн блот анализ с использованием антител к фосфорилированным и тотальным формам МАР-киназЕЮа/2. Б. Относительное содержание фосфорилированных форм MAPK/ERK. Темные столбики — интактные животные. Статистически значимое отличие от контроля: - р 0,05; p 0,001.N=4.
Таким образом, в отличие от париетовисцерального комплекса ганглиев, в педальном ганглии не происходит активации MAPK/ERK-киназ на ранних этапах обучения (через 10 минут и 1 ч.). Кроме того, наблюдается падение активации ниже базального уровня и через 1 час после обучения. Через 4 часа после обучения увеличение активации несколько сильнее, чем в париетовисцеральном ганглии.
Анализ активации MAPK/ERK в педальном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении после введения нейротоксина 5,7-ДОТ.
Чтобы определить зависимость активации MAPK/ERK каскада от серотонинэргической системы в педальном ганглии, также использовали улиток с разрушенными серотонинергическими терминалями (введение нейротоксина 5,7-ДОТ).
Обнаружили, что разрушение серотонинергических терминалей не сказывается на базальном уровне экспрессии МАР-киназ ERK (Рис. 15). Введение 5,7-ДОТ значительно не изменяло уровень активации MAPK/ERK каскада на ранних стадиях обучения, так как активация этого каскада практически не отличалась от контроля.
