Активация транскрипционных факторов STAT, индуцированная активными формами кислорода Гончар Илья Васильевич

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 9

2.1.Эпидермальный фактор роста и его рецептор 9

2.2. Фосфорилирование рецептора ЭФР и его тирозинкиназная активность 14

2.3. Пути передачи сигнала с рецептора ЭФР 15

2.4. STAT-путь передачи сигнала 20

2.5. Транскрипционные факторы STAT1 и STAT3 23

2.6. Механизм активации STAT1 и STAT3 под действием ЭФР 30

2.7. Лиганд-независимая активация рецептора 34

2.8. Роль АФК в активации рецептора ЭФР и факторов STAT 36

2.8.1. Системы генерации АФК и поддержания внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса 36

2.8.2. Роль внутриклеточных АФК в процессе активации рецептора ЭФР и факторов STAT 41

2.8.3. Активация рецептора ЭФР и факторов STAT под действием экзогенных АФК 46

2.9. Активация нерецепторных тирозинкиназ под действием АФК 49

3. Материалы и методы 52

3.1. Клеточные линии 52

3.2. Обработка клеток ингибиторами 52

3.3. Стимуляция клеток и приготовление тотальных клеточных лизатов 53

3.4. Иммунопреципитация 54

3.5. Электрофорез и иммуноблоттинг 55

3.6. Антитела 56

4. Результаты 57

4.1. Динамика НгОг-зависимого фосфорилирования рецептора ЭФР и факторов STAT1 и STAT3 57

4.2. Участие рецепторной тирозинкиназы в процессе НгОг-индуцированной активации рецептора ЭФР

и факторов STAT1 и STAT3 60

4.3. Участие тирозинкиназ семейства Src в процессе активации рецептора ЭФР и факторов STAT1 и STAT3 65

4.4. Изучение роли тирозинкиназы JAK2 в активации рецептора ЭФР и факторов STAT1 и STAT3 71

4.5. Изучение влияния окислительно-восстановительного статуса клетки на уровень активации рецептора ЭФР и факторов STAT 76

4.6. Роль внутриклеточно генерируемых АФК в активации рецептора ЭФР и факторов STAT 80

Обсуждение 83

Выводы 101

Список литературы 102

• Фосфорилирование рецептора ЭФР и его тирозинкиназная активность
• Роль АФК в активации рецептора ЭФР и факторов STAT
• Стимуляция клеток и приготовление тотальных клеточных лизатов
• Участие тирозинкиназ семейства Src в процессе активации рецептора ЭФР и факторов STAT1 и STAT3

Введение к работе

Эпидермальный фактор роста (ЭФР) относится к семейству полипептидных ростовых факторов. В зависимости от типа клеток действие ЭФР может приводить к пролиферации, остановке клеточного цикла, дифференцировке или апоптозу. Рецептором ЭФР является крупный (170 кД) трансмембранный белок, который обладает тирозинкиназной (ТК) активностью и имеет пять сайтов автофосфорилирования на своем цитоплазматическом С-конце. Процесс ЭФР-опосредованной активации рецептора хорошо изучен. Связывание ЭФР с рецептором приводит к димеризации последнего, стимуляции его ТК активности и быстрому автофосфорилированию С-концевых тирозиновых сайтов, с которыми затем связываются различные белки, содержащие SH2 домены. Физиологический эффект ЭФР определяется именно набором белков, связавшихся с рецептором в процессе его активации, к числу которых относятся тирозинкиназы семейств JAK и Src, белки семейства STAT, адапторные белки (Grb2, She), фосфатидилинозитол-3 киназа (PI-3-K), белок СЫ, а также тирозинфосфатазы.

Однако активация рецептора ЭФР может происходить не только за счет взаимодействия со своим специфическим лигандом, но и в ответ на действие лигандов, активирующих другие клеточные рецепторы. ЭФР-независимую активацию рецептора ЭФР называют трансактивацией. Было показано, что трансактивация рецептора ЭФР необходима как для митогенного эффекта лизофосфатидиловой кислоты (LPA) и ангиотензина II (Ang II) (Cunnick et al., 1998; Ushio-Fukai et al., 2001), так и для TNF-a-зависимого понижения чувствительности клеток к действию инсулина (Наші et al., 2002). Действие стрессовых факторов окружающей среды (УФ-излучение, окислители, алкилирующие агенты и т. д.) также приводит к трансактивации рецептора ЭФР (Huang et al., 1996; Knebel et al., 1996), происходящей за счет повышения уровня внутриклеточных активных форм кислорода (АФК). АФК, в частности перекись водорода (Н₂0₂) и

супероксид анион (Ог"), являются продуктами одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Они интенсивно генерируются в тканях организма при различных патологических состояниях, таких как ишемия, атеросклероз, сепсис, воспаление. Образование АФК сверх способности систем клетки справиться с ними или истощение пула антиоксиданта приводит к окислительному стрессу. В течение многих лет биологическую роль АФК видели в их токсическом влиянии на клетки, связанном с изменениями функциональной активности белков и повреждениями ДНК, которые способствуют возникновению различных болезней и дегенеративным процессам (старение, канцерогенез, иммунодефицит). Однако последние исследования показали, что АФК выполняют во внутриклеточных сигнальных процессах также и регуляторную функцию (см. обзор: Gamaley, Klyubin, 1999). Стимуляция профессионально-нефагоцитирующих клеток разнообразными лигандами, включая цитокины и факторы роста, приводит к временному и быстро проходящему возрастанию уровня внутриклеточных АФК, которые играют важную роль в регуляции фосфорилирования белков по тирозину (Sundaresan et al., 1995; Bae et al., 1997). Крайне мало известно об изменении под действием АФК активности рецептора ЭФР, хотя по современным представлениям ему отводится центральная роль в ЭФР-зависимой , а также в лиганд-независимой передаче сигнала. Так показано, что экзогенные АФК вызывают фосфорилирование остатков тирозина на рецепторе ЭФР (Gamou, Shimizu, 1995; Goldkorn et al., 1998) с последующим связыванием фосфолипазы Су1, адапторного белка She и комплекса Grb2-SOS (Rao et al., 1996). Это позволяет предполагать, что при трансактивации функциональная активность рецептора ЭФР такая же, как и при стимуляции ЭФР. Несмотря на возрастающий интерес к этой проблеме и многочисленные публикации, пока неизвестны конкретные белки-мишени действия НгОгна поверхности и внутри клетки; в частности, нет ответа на вопрос является ли сам рецептор ЭФР редокс-чувствительной молекулой.

К числу белков, участвующих в передаче сигнала от рецептора ЭФР и чувствительных к действию экзогенных АФК, относятся и транскрипционные факторы семейства STAT, активация которых описана в фибробластах, лимфоцитах, эндотелиальных и тироидных клетках (Simon et al., 1998; Carballo et al., 1999; Kim et al., 2001; Madamanchi et al., 2001). Сведения об активации STAT-белков под действием Н2О2 в эпителиальных клетках немногочисленны и поверхностны (Simon et al., 1998). Механизм лиганд-независимой активации факторов STAT практически не исследован, в то время как процесс их активации при действии ЭФР достаточно полно охарактеризован. ЭФР-индуцированное фосфорилирование STAT по тирозину осуществляется на активированном рецепторе ЭФР за счет собственной тирозинкиназы рецептора при участии тирозинкиназ семейств JAK и Src. Киназа c-Src и рецептор ЭФР при взаимодействии активируют друг друга (Sato et al., 1995; Biscardi et al., 1999). Важно подчеркнуть, что киназы семейств Src и JAK активируются при действии на клетки Н2О2 (Brumell et al., 1996; Simon et al., 1998). Известно, что киназа JAK2 может вовлекаться в активацию факторов STAT при действии АФК (Бурова и др., 2001; Madamanchi et al., 2001), а киназа c-Src опосредует АФК-зависимую трансактивацию рецептора ЭФР (Abe et al., 1997; Chen et al., 2001; Ushio-Fukai et al., 2001). Исследования на опухолевых клетках выявили зависимость конститутивной активации STAT3 от активности киназ Src и JAK2 (Garcia et al., 2001). Эти факты позволяют рассматривать киназы семейства Src и киназу JAK2 в качестве основных кандидатов на роль посредников в активации рецептора ЭФР и факторов STAT под действием Н2О2.

Важным фактором в модуляции активности тирозинкиназных каскадов является внутриклеточный окислительно-восстановительный статус. Известно, что генерируемые клеткой АФК окисляют SH-группы цистеина, необходимые для функционирования компонентов восстановительного буфера клетки (глутатиона и тиоредоксина) и для ферментативной активности тирозинфосфатаз. Это ведет к инактивации тирозинфосфатаз, отмене осуществляемого ими негативного контроля

активности ряда сигнальных белков и активации тирозинкиназ, в том

числе и рецептора ЭФР (Lee et al., 1998). С другой стороны, обратимая

активация фосфатаз зависит от уровня внутриклеточных антиоксидантов »

и блокирования в клетке систем генерации АФК. Существует несколько

работ, в которых исследовано влияние антиоксиданта N-ацетилцистеина,

предшественника глутатиона в его ферментативном синтезе, на лиганд-

зависимую активацию рецептора ЭФР (Kamata et al., 2000; Ushio-Fukai et

al., 2001). Зависимость активации сигнальных путей с участием факторов

„ STAT от восстановительных свойств цитоплазмы была изучена в клетках

разных типов (Simon et al., 1998; Schieffer et al., 2000; Kim et al., 2001;

» Madamanchi et al., 2001a). Однако в эпителиальных клетках влияние

окислительно-восстановительного баланса на ЭФР-индуцируемую активацию STAT-белков до сих пор не исследовано.

В связи со всем сказанным выше, в настоящей работе представлялось актуальным изучить механизмы, регулирующие проведение клеточного сигнала в условиях окислительного стресса на примере рецептора ЭФР и транскрипционных факторов STAT1 и STAT3.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эпидермальный фактор роста и его рецептор.

Передача сигнала с клеточных рецепторов на геном представляет
' собой одну из наиболее актуальных и интенсивно развивающихся

областей клеточной и молекулярной биологии. Известны десятки факторов роста и разнообразных цитокинов - интерферонов, интерлейкинов и т.п., охарактеризованы их рецепторы, открыты многие сигнальные белки. Большую роль в развитии этой области сыграли исследования рецепторов ростовых факторов, на примере которых были впервые показаны многие молекулярные механизмы передачи сигнала в клетке. Ростовые факторы являются разнообразной и широко

представленной группой секретируемых полипептидов, регулирующих
рост, дифференцировку и метаболический гомеостаз индивидуальных
типов клеток. Большая группа факторов роста действует на клетки через
специфические мембранные рецепторы, обладающие тирозинкиназной
(ТК) активностью, которая является наиболее существенной для
проведения сигнала в клетку (Schlessinger, Ullrich, 1992). В эту группу
входят инсулин, фактор роста, выделяемый тромбоцитами (PDGF),
фактор роста фибробластов (FGF)h эпидермальный фактор роста (ЭФР).
Наиболее исследованы сигнальные пути, запускаемые ЭФР, который
регулирует пролиферацию и дифференцировку различных типов тканей.
t Нарушения регуляции этих путей являются причиной возникновения и

прогрессии многих онкозаболеваний (Hynes, Stern, 1994). ЭФР был впервые выделен Коэном из гомогената подчелюстных желез мыши (Cohen, 1962). Он обнаружил, что ЭФР оказывает стимулирующее действие на эпидермальные ткани, вызывая преждевременное открывание глаз и прорезывание зубов у новорожденных мышей. Установлена аминокислотная последовательность ЭФР мыши, крысы и человека (Savage, Cohen, 1972). ЭФР мыши - одноцепочечный полипептид, который состоит из 53 аминокислотных остатков (АО) и имеет

'4

молекулярную массу 6045 Да. Эта молекула представляет собой глобулярную структуру, стабилизированную тремя дисульфидными мостиками (Мауо, 1995). Ее характерной особенностью является: полное отсутствие аланина, фенилаланина и лизина, наличие двух триптофанов,

* а также высокое содержание тирозина.

К семейству ЭФР принадлежит, по крайней мере, 8 различных гормонов: сам ЭФР, TGF-a, HB-EGF, амфирегулин, эпирегулин, бетацелулин, неорегулины и глиальный фактор роста (Riese, Stern, 1998). Большинство белков этого семейства синтезируются как трансмембранные предшественники, которые могут образовывать растворимую форму после протеолиза или функционировать в мембране. Они состоят всего из

» 50 АО и имеют общий домен, который необходим и достаточен для

связывания с рецептором (Chang et al., 1997).Особенностью этого домена

является наличие б цистеинов, образующих 3 дисульфидных мостика, формируя, таким образом, вторичную структуру молекулы гормона.

Гормоны семейства ЭФР связывааются на поверхности клетки с рецепторами семейства ЕгЬВ. В настоящее время описано 4 типа рецепторов, относящихся к этому семейству: ЕгЬВ1 (рецептор ЭФР), ЕгЬВ2; ЕгЬВЗ и ЕгЬВ4, структуру которых мы рассмотрим на примере рецептора ЭФР.

Как и другие клеточные белки, рецептор ЭФР синтезируется в

, эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и состоит из трех основных

доменов: экстраклеточного, трансмембранного и цитоплазматического

(рис. 1).Экстраклеточный домен состоит из 621 аминокислоты, в составе которых 12 аспарагинов, представляющих потенциальные места для гликозилирования. Отличительной чертой этого домена является богатство цистеинами (51 остаток цистеина). При этом локализация цистеинов ограничивается двумя областями, на основании чего было выдвинуто предположение о двухлопастной структуре внешней части рецептора, образующей некую «клешню» для захвата лиганда - ЭФР. Позднее было выдвинуто предположение о четырехдоменной организации внешнего участка молекулы рецептора ЭФР, которое основывалось на электронно-микроскопическом исследовании очищенного рецептора, а также на основании функционального анализа лиганд-связывающего (экстраклеточного) домена в опытах с "химерными" рецепторами (Ullrich, Schlessinger, 1990). Согласно этой модели

субдомены 2 и 4 содержат участки, богатые цистеинами, а последовательности, которые ответственны за связывание с лигандом, локализованы в субдоменах 1 и 3.

Трансмембранный домен рецептора выполняет пассивную функцию в проведении сигнала, что было подтверждено многочисленными заменами АО в результате точечных мутаций (Kashles et al., 1988). Можно предположить, что трансмембранный участок обеспечивает лишь

* "заякоривание" рецептора в плазматической мембране.

Цитоплазматический домен рецептора ЭФР включает 542 АО. Он имеет домен, обладающий протеинкиназнои активностью, а также участок связывания АТФ, который гомологичен АТФ-связывающим последовательностям известных протеинкиназ, таких как src-белок и сАМФ-зависимая протеинкиназа (Basu et al., 1984). Протеинкиназа рецептора обладает способностью к автофосфорилированию, зависимому от связывания ЭФР. Причем протеинкиназа специфична по тирозину, т.е. является тирозиновой протеинкиназой, способной фосфорилировать по тирозину белковые мишени и тирозиновые остатки прилегающих областей рецептора. Также были идентифицированы несколько остатков серина и треонина, которые локализованы в подмембранном домене и являются дополнительными сайтами фосфорилирования протеинкиназы С (РКС) (Carpenter, 1992).

Связывание лиганда с рецептором ЭФР приводит к димеризации рецепторов (Sorkin, Carpenter, 1991). В целом, димеризация рецепторов представляется основным свойством всех рецепторов факторов роста. Она необходима для автофосфорилирования рецептора и последующего фосфорилирования им внутриклеточных белковых субстратов (Riese, Stern, 1998). Существует несколько механизмов димеризации лиганд -рецепторных комплексов (Klemm et al., 1998). Такие факторы роста, как PDGF, являются димерными молекулами, и димеризация их рецепторов опосредуется мостиком, которым служит лиганд. Рецептор инсулина представлен на клеточной поверхности дисульфидно-связанным гетеродимером, состоящим из а и b субъединиц. Инсулин, таким образом, активирует свой рецептор, вызывая аллостерические изменения предсуществующей димерной структуры. Димеризация рецептора ЭФР идет по другому механизму, так как с одной молекулой ЭФР связывается один рецептор. Показано, что ЭФР-зависимая димеризация рецептора вызвана конформационными изменениями экстраклеточного домена, которые стабилизируют взаимодействия между двумя занятыми молекулами рецептора.

Помимо активации тирозинкиназы рецептора ЭФР запускает рецептор-опосредованный эндоцитоз (Warren, 1990). После связывания лиганда димеры рецептора ЭФР кластеризуются в окаймленных ямках и быстро интернализуются в эндосомы (Pastan, Willingham, 1981; Корнилова и др, 1987). В дальнейшем ЭФР - рецепторные комплексы обнаруживаются в районе транс - Гольджи в составе мультивезикулярных эндосом и затем деградируют в лизосомах.

Рецепторы семейства ЕгЬВ обладают различной специфичностью к каждому из гормонов семейства ЭФР. Следует отметить, что в большинстве клеток экспрессируются почти все члены семейства ЕгЬВ, что подразумевает достаточно сложные конкурентные взаимоотношения, которые недостаточно хорошо изучены к настоящему времени. Кроме того, возможна кросс-активация различных членов семейства ЕгЬВ. Так ЭФР не способен связываться с ЕгЬВ2, но способен индуцировать автофосфорилирование как рецептора ЭФР, так и ЕгЬВ2 посредством образования гетеродимеров (Stern, Kamps, 1988). Кроме того, активация рецептора ЭФР и ЕгЬВ2 приводит к синергичному действию на трансформацию фибробластов (Alimandi et al., 1995).Подобные гетеротипические взаимодействия характерны для всех рецепторов этой группы. Внутриклеточная судьба гомо- и гетеродимеров различна, однако, данные относительно конкретных димеров достаточны противоречивы (Kornilova et al., 1992; Lenferink et al, 1998).Таким образом, присутствия одиночного рецептора, способного связываться с гормоном, вполне достаточно для активации почти всех членов ЕгЬВ семейства. Поэтому биологический эффект ЭФР определяется количеством и уровнем активности как гомодимеров, так и образовавшихся гетеродимеров рецепторов.

2.2.Фосфорилирование рецептора ЭФР и его тирозинкиназная активность

После димеризации рецептора ЭФР происходит активация его ТК домена, который осуществляет автофосфорилирование рецепторных субъединиц по межмолекулярному механизму (Carpenter et al., 1978; Schlessinger, Ullrich, 1992), а также фосфорилирует различные сигнальные белки. ТК домен имеет высокую гомологию с аналогичным доменом тирозинкиназы c-Src (Downward et al., 1984). Наиболее важную роль для стимуляции ТК активности рецептора ЭФР играет лизин 721. Было показано, что при замене лизина 721 на фенилаланин наблюдалось полное нарушение ТК активности рецептора как in vitro, так и in vivo (Chen et al., 1987; Honneger et al., 1987). На концевом участке цитоплазматического домена рецептора ЭФР расположены пять сайтов ЭФР-зависимого автофосфорилирования по тирозину: три основных (Y1068, Y1148 и Y1173) и два минорных (Y992 и Y1086). Этот участок имеет молекулярный вес около 20 кДа и легко отщепляется под действием протеаз (Margolis et al., 1989). По-видимому, в результате автофосфорилирования рецептор приобретает особую конформацию, при которой облегчается его взаимодействие с внутриклеточными субстратами. В цитоплазматическом домене рецептора были обнаружены еще два функциональных участка. Один, состоящий из 164 АО (1022-1186), можно охарактеризовать как ингибиторный домен, поскольку его делеция приводит к увеличению ЭФР-зависимого фосфорилирования внутриклеточных субстратов рецептора ЭФР (рис. 1). Этот домен взаимодействует с ТК рецептора, маскируя при этом последовательность с 973 по 1022 АО, составляющих второй домен - "домен интернализации". Автофосфорилирование трех тирозинов на ингибиторном домене приводит к конформационным изменениям, при которых освобождается ТК домен и домен интернализации. Кроме того, в домене интернализации была обнаружена последовательность из 18 АО (973 - 991), необходимая как для интернализации, так и для увеличения концентрации цитозольного кальция. Авторы назвали этот участок "Cain", подчеркивая его связь с

регуляцией потоков кальция и интернализацией (Chen et al., 1989).Из внутриклеточных белковых мишеней, которые фосфорилирует протеинтирозинкиназа рецептора ЭФР, в настоящее время известны GAP (GTP-аза активирующий белок) - регулятор активности продукта протоонкогена c-ras, фосфолипаза Су1 (PLCyl), PI-3-K и некоторые другие (Boonstra et al., 1995).

Как уже упоминалось выше, кроме автофосфорилирования по
остаткам тирозина, рецептор ЭФР может фосфорилироваться другими
протеинкиназами по остаткам треонина и серина. Например, треонин 654,
локализованный в подмембранным участке, является сайтом
» фосфорилирования РКС, что в конечном счете приводит к ингибированию

собственной киназной активности рецептора и потере им способности связывать ЭФР (Davis, 1988). Всего сейчас известно семь сериновых остатков и один остаток треонина, по которым может фосфорилироваться рецептор ЭФР (Nesterov et al., 1994). Считается, что они регулируют протеинкиназную активность рецептора ЭФР.

В подмембранной части рецептора ЭФР был идентифицирован сайт связывания актина (Boonstra et al., 1995). Возможно, взаимодействие с подмембранным актином помогает в отшнуровывании ранних эндосом от плазматической мембраны в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза (Lamazeetal., 1997).

2.3. Пути передачи сигнала с рецептора ЭФР.

В проведении сигнала с рецепторов ростовых факторов участвует
, множество разнообразных белков, организованных в сложные цепочки,

каскады и даже сети. Сигнальные белки, непосредственно активируемые
данной группой рецепторов, имеют специальные домены. Среди них
охарактеризованы SH2 и SH3, а также РН, РТВ и PDZ домены (Kuriyan,
Kowburn, 1997), которые не имеют ферментативной активности, а
опосредуют специфические белок-белковые взаимодействия. Эти домены
* обеспечивают одновременную активацию разных систем в одной точке,

например, на рецепторе ЭФР. Практически все белки, непосредственно

связывающиеся с рецептором ЭФР, содержат SH2 и SH3 домены, гомологичные второму и третьему домену белка Src, соответственно. SH2 домен, состоящий примерно из 100 АО, связывается с участками, содержащими фосфотирозин. Именно за счет этого домена сигнальные белки ассоциируют с определенными фосфотирозиновыми сайтами на активированном рецепторе ЭФР. Исключением является лишь белок She, который взаимодействует с рецептором через домен РТВ. Домен SH3 содержит 50-70 аминокислот и обладает сродством к участкам белка, богатым пролином. Этот домен опосредует взаимодействие различных сигнальных белков, хотя и не нужен для посадки последних на рецептор ЭФР.

Некоторые из связывающихся с рецептором ЭФР белков практически полностью состоят из SH2 и SH3 доменов и являются адаптерами или регуляторными субъединицами специфических ферментов. К ним относятся Grb2, Nek, c-Crk и регуляторная субъединица Pl-З-К р85. Другие белки, помимо того, что содержат SH2 и SH3 домены, обладают еще и ферментативной активностью. В их число входят фосфолипаза Су1, белок-активатор СТРазной активности онкогена Ras (Ras-GAP), тирозинкиназа c-Src, тирозинфосфатаза SH-PTP2 и белок СЫ (убиквитин-лигаза рецептора ЭФР). Эти ферменты активируются после ассоциации с рецептором ЭФР. Позже других были открыты факторы семейства STAT - еще один класс белков, связывающихся с рецептори ЭФР. Они содержат SH2 и SH3 домены и, не являясь ферментами или адаптерными белками, инициируют транскрипцию ряда генов.

Следует отметить, что в клетках разных типов с рецептором ЭФР связываются не все вышеперечисленные белки, а лишь некоторые из них. Физиологический эффект ЭФР как раз и определяется набором белков, связавшихся с рецептором в процессе его активации. Эти белки запускают различные сигнальные пути, основные из которых мы вкратце рассмотрим.

Одним из белков-мишеней, непосредственно активируемых рецептором ЭФР, является фосфолипаза Су1 (PLCy1) (Singer et al., 1997).

Она обладает повышенным сродством к фосфорилированным тирозинам рецептора в положениях 992 и 1068. Связавшись с этими сайтами через свои SH2 домены, Р1_Су1 фосфорилируется тирозинкиназой рецептора, что приводит к активации ее ферментативной активности. Расщепляя фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат, PLCyi образует два вторичных мессенжера - инозитолтрифосфат, запускающий высвобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо, и диацилглицерол, активирующий Са²⁺ -зависимую РКС. Она, в свою очередь, фосфорилирует множество разнообразных белков, в том числе Na⁺/H⁺ обменник плазматической мембраны, ERK1.2 и рецептор ЭФР.

Другой путь передачи сигнала с рецептора ЭФР в клетку заключается в активации PI-3-K (Fruman et al., 1998). РІ-З-К состоит из двух субъединиц: регуляторнои (р85) и каталитической (р110). р85 через свой SH2 домен взаимодействует с фосфорилированным рецептором ЭФР, что приводит к активации р110 с последующим фосфорилированием фосфатидилинозитолов по D-3 позиции. Это приводит к появлению целой группы вторичных посредников, оказывающих многостороннее воздействие на клетку. Например, эти посредники регулируют переход поздних эндосом в лизосомы в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза и активируют серин-треониновую киназу АКТ/РКВ, способствующую предотвращению апоптоза и выживанию клетки. Есть данные о важной роли РІ-З-К в реорганизации актинового цитоскелета, хотя не ясно, каким образом осуществляется это влияние. Предполагают, что РІ-3-К действуют на малые GTPa3bi, такие как Rac и члены ARF-семейства, через факторы обмена гуанозинин-нуклеотидов (GEFs) и белки, активирующие вТРазу (GAPs).

Еще одним путем реализации действия ЭФР в клетке является активация каскада серии - треониновых протеинкиназ с участием продукта протоонкогена c-ras. Эта цепочка взаимодействий начинается с присоединения адапторного белка Grb2 через свой SH2 домен к фосфорилированному тирозину 1068 рецептора ЭФР (McCormick, 1993). Взаимодействие Grb2 с рецептором ЭФР может происходить также и

через адаптерный белок She, который имеет РТВ домен и фосфорилируется ТК рецептора (Batzer et al., 1995). Своим SH3 доменом Grb2 связывается с богатыми пролином участками белка Sos1, являющегося регулятором активности Ras (Guglielmo et al., 1994). Ras является мембранносвязанным белком массой 21 кДа. Он имеет ЄТРазную активность и относится к суперсемейству Ras малых GTP-аз. Под действием Sos1 Ras обменивает связанный GDP и превращается в Ras-GTP, который является активной формой Ras. С активированного Ras сигнал далее передается на каскад серин-треониновых протеинкиназ, первая из которых является продуктом клеточного протоонкогена c-raf. Она представляет собой белок молекулярной массой около 72 кДа. Киназная активность c-Raf повышается при связывании его регуляторного домена с активированным Ras. После этого активированный Raf фосфорилирует другой белок массой 45 кДа, называемый МЕК или киназой MAP киназы. Тот, в свою очередь, фосфорилирует МАР киназу ERK1.2, которая фосфорилирует p90rsk (р90 ribosoma! S6 kinase), MAP (microtubule associated protein) и транскрипционные факторы комплекса АР-1 (Wiesmuller, Wittinghofer, 1994).

При активации рецептора ЭФР происходит также фосфорилирование по тирозину протоонкогенного белка СЫ (Levkowitz et al., 1996). Несмотря на идентификацию различных белков, взаимодействующих с СЫ, таких как Grb2, Crk, Nek и р85, основная функция СЫ еще не определена, хотя есть данные, позволяющие рассматривать СЫ как негативный регулятор передачи сигнала с рецепторных ТК (Thien, Langdon, 2001). Однако существуют противоположные данные. Например, с-СЫ увеличивает пролиферацию и выживаемость через PI-3-К-зависимый путь после стимуляции цитокинового рецептора (Grishin, 2000) и усиливает активацию MAP киназы в ответ на стимуляцию Met рецептора (Garcia-Guzman et al., 2000). В адипоцитах с-СЫ предпочитает в качестве субстрата Fyn, а не инсулиновый рецептор, что говорит о его возможном участии в регуляции глюкозного транспорта (Mastick, Saltiel, 1997). Сходное заключение было

сделано в результате исследования роли с-СЫ в миграции остеобластов, где с-СЫ выступал в качестве ключевого субстрата и эффектора Src (Meng, Lowell, 1998).

ЭФР ЭФР

Рис. 1. Схема основных путей передачи сигнала с рецептора ЭФР.

2.4. STAT-путь передачи сигнала.

Позже других был открыт прямой путь передачи сигнала с рецепторов на геном. Было установлено, что в клетке существуют латентные цитоплазматические транскрипционные факторы, получившие название STAT (signal transducers and activators of transcription), которые активируются при действии интерферонов (IFN) а и у (Schindler et al., 1992; Fu, 1992).

После этого произошел "информационый взрыв" в исследовании

« STAT, и в течение 2-3 лет была установлена основная картина передачи

сигнала через эти белки. Оказалось, что существует целое семейство

* STAT-факторов. Выяснилось также, что STAT белки активируются не

только интерферонами, но и другими цитокинами, а также разными факторами роста, включая ЭФР, PDGF, NGF и др. (Рис.2).

*

Рис. 2. Цитокины и факторы роста, активирующие STAT-белки. EGF - epidermal growth factor, NGF - nerve growth factor, PDGF -platelet-derived growth factor, GM-CSF - granulocyt macrophage colony-stimulating factor, GH - growth hormone, CNTF - ciliary neurotrophic factor, LIF-1 - leukemia inhibitor factor, OSM - oncostatin M.

Важно отметить, что два представителя семейства STAT - STAT1 и STAT3 активируются широким спектром указанных факторов. Таким образом, эти STAT-белки оказались точкой пересечения сигнальных каскадов с цитокиновых рецепторов и рецепторов факторов роста (Darnell, 1997).

О 1О0 200 300 AQQ SO0 60О 700

г-н—I—t—i—і j J Т ' Г ' ] » Г і

STAT DNA SJH3 SH2 I I

Dimerization Binding ~Y S _

Domain Dorrtafti 42 43

Рис. 3. Схема строения белков семейства STAT. Отмечено положение сайтов фосфорилирования по тирозину и серину. Сверху - масштаб, в аминокислотных остатках, (по Leonard, OShea, 1998).

Первоначальная модель STAT-пути передачи сигнала предполагала, что до стимуляции эти факторы находятся в цитоплазме клеток в неактивном состоянии. После стимуляции они фосфорилируются по тирозину активированными рецепторами ростовых факторов или ассоциированными с рецепторами цитокинов тирозинкиназами семейства JAK. Это приводит к димеризации и активации факторов STAT, которая заключается в приобретении способности транспортироваться в ядро клетки и связываться с регуляторными элементами генов-мишеней, регулируя их транскрипцию. Тогда же было постулировано, что данный путь передачи сигнала на геном является быстрым, однокаскадным и не зависит от других сигнальных путей (Darnell, 1997). Главным признаком, по которому STAT-белки объединили в одно семейство, явилось сочетание у них сразу двух функций - сигнальной и транскрипционной. Полагали, что такое сочетание обеспечивает быстроту и целенаправленность передачи сигнала. Действительно, уже через 1-5 мин

после стимуляции клеток ЭФР активированный STAT1 обнаруживается в ядре, где взаимодействует с промоторами генов раннего ответа (Fu, Zhang, 1993).

STAT

STAT

Nucleus

Cytosol

-fTTCNNNGAAr- ffigff "НІЙ}

Рис. 4. Схема проведения сигнала с рецепторов цитокинов через STAT-факторы (по Leonard, O'Shea, 1998).

Считалось, что STAT-путь характерен только для млекопитающих, однако, открытие STAT-белков у Drosophila, а затем и у низшего гриба Dictyostelium discoideum показало, насколько древней является в действительности эта молекулярная система регуляции транскрипции (Darnell, 1997b). Исследования последних двух-трех лет поставили под сомнение постулат о прямом и независимом пути передачи сигнала через STAT-белки и значительно изменили наши представления о механизме этого процесса. Участие многих цитоплазматических тирозиновых и сериновых киназ в регуляции активности STAT-белков, а также

зависимость других сигнальных каскадов от активности факторов STAT свидетельствует о взаимосвязанности всех клеточных процессов.

2.5. Транскрипционные факторы STAT1 и STAT3

Транскрипционные факторы STAT1 и STAT3 состоят из 760 и 770 АО и имеет молекулярные массы 91 кДа и 93 кДа соответственно. Для STAT1 известна укороченная форма - STAT10, продукт альтернативного сплайсинга, лишенный 38 С-концевых АО (Schindler et al., 1992b). Факторы STAT содержат несколько консервативных доменов. Консервативный N-концевой участок служит для кооперативного взаимодействия STAT-белков с ДНК. В средней части молекулы находится ДНК-связывающий домен. Ближе к С-концу расположен SH2 домен, обеспечивающий первоначальную связь STAT-белков с фосфорилированными по тирозину участками различных рецепторов. После связывания факторы STAT фосфорилируются по С-концевым остаткам тирозина. Для STAT1 и STAT3 это тирозины 701 и 705, соответственно. Далее SH2 домены двух молекул STAT связываются с фосфотирозином друг друга и образуют стабильный димер, в виде которого эти факторы транспортируются в ядро и активируют транскрипцию определенных генов (Shuai et al., 1994).

Первоначально полагали, что в нефосфорилированном состоянии факторы STAT1 и STAT3 существуют в виде мономеров. Однако оказалось, что каждый из этих факторов образует в цитоплазме свои комплексы с молекулярной массой 200-400 кДа и 1-2 МДа, названные "statosome I" и "statosome II", соответственно (Ndubuisi et al., 1999). Кроме STAT-факторов в этих комплексах были обнаружены как структурные (виментин и актин) так и сигнальные (Grb2, She, SHP-1, Vav) белки (Yeung et al., 1998), а также члены семейства шаперонов (GRP58) (Ndubuisi et al, 1999). Оказалось, что STAT1 и STAT3 в нефосфорилированной форме могут образовывать в цитоплазме гомо- и гетеродимеры (Stancato et al., 1996; Lackmann et al., 1998; Haan et al., 2000). В нашей лаборатории также

была подтверждена возможность существования латентных комплексов STAT1 и STAT3 (Евдонин и др., 1998а), в состав которых могут входить такие сигнальные молекулы, как фосфолипаза Су1 и МАР-киназа.

Роль этих комплексов в передаче сигнала остается неясной. Возможно, они облегчают синхронность активации основной массы сигнальных белков (Yeung et al., 1998). С другой стороны, эти комплексы могут препятствовать активации STAT-белков. Возможно, именно по этой причине только 10%-30% всего клеточного STAT1 активируется и транслоцируется в ядро в ответ на стимул, а остальная часть недоступна для взаимодействия с рецепторами (Ndubuisi et al, 1999). Транспорту в ядро STAT3 может препятствовать его связывание с циклином D (Bienvenu et al., 2001). Механизмы удерживания STAT3 в цитоплазме изучены недостаточно, хотя показано, что на этот процесс может влиять фосфорилирование STAT3 по серину, которое предотвращает его тирозиновое фосфорилирование и транспорт в ядро (Woetmann et al., 1999; Yamaguchi et al., 1999).

Исследования последних лет выявили еще одну функцию комплексов факторов STAT с другими белками. Оказалось, что нефосфорилированный STAT1 транспортируется в ядро и в комплексе с белком IRF1 активирует транскрипцию одних генов (каспаза 1, 2, 3, 11, LMP2, винкулин) и подавляет транскрипцию других (Bcl-X_L, hsp70) (Chatterjee-Kishore et al., 2000; Lee et al., 2000). Это согласуется с более ранними данными о наличии нефосфорилированного STAT1 в ядрах нестимулированных клеток (Schindler et al., 1992; Василенко и др., 1997). Механизмы транспорта нефосфорилированных STAT-белков в ядро, как и механизмы взаимодействия с промоторами конститутивно-регулируемых генов, неизвестны. Непонятно, образуют ли факторы STAT в ядре димеры или связываются с промоторами в мономерной форме. Пока продемонстрировано только, что нефосфорилированный STAT1 взаимодействует с участком промотора, отличающимся от сайта связывания активного димера STAT1 (Chatterjee-Kishore et al., 2000).

Фосфорилирование по тирозину STAT1 и STAT3 может осуществляться не только рецепторными тирозинкиназами и киназами JAK. В этом процессе могут участвовать также представители семейства Src - Src, Lck, Fyn, и другие цитоплазматическине киназы, такие как АЫ, Fes, и относящаяся к Tec-семейству киназа BMX/Etk, (Saharinen et al., 1997; Bromberg et al., 1998; Nelson et al., 1998; Lund et al., 1999; Olayioye et al., 1999; Vignais, Gilman, 1999; Wen et al., 1999). Однако неясно, зависит ли состав киназ, участвующих в активации STAT-белков, от типа активированного рецептора, или определяющим фактором является тканеспецифичность.

Кроме фосфорилирования по тирозину факторы STAT1 и STAT3 также могут фосфорилироваться и по серину 727. На роль сериновых киназ в этом случае претендуют MAP киназы - ERK, JNK и р38, а также протеинкиназа С и PKR, но и в этом вопросе пока нет должной ясности (Wen et al., 1995; Goh et al., 1999; Gollob et al., 1999; Jain et al., 1999; Lim, Cao, 1999). Сериновое фосфорилирование повышает транскрипционную активность STAT1, но само по себе недостаточно для его активации (Wen et al., 1995). Относительно роли фосфоосеринового остатка в связывании димеров STAT1 и STAT3 с ДНК существуют различные мнения. Согласно одним данным замена серина 727 на аланин не влияет на ДНК-связывающую активность STAT1 и STAT3 (Wen, Darnell, 1997). В других исследованиях показана необходимость фосфосерина для связывания факторов STAT с промоторами генов (Zhang et al., 1995), особенно с низкоафинными сайтами (Eilers., Decker, 1995). Интересно также отметить, что возможен процесс серинового фосфорилирования STAT3, предшествующий и препятствующий тирозиновому фосфорилированию, и, соответственно, ингибирующий активацию (Jain et al., 1998).

Неожиданные данные получены относительно возможности активации STAT3 при действии инсулина. Было показано инсулин-зависимое сериновое фосфорилирование STAT3, но тирозиновое фосфорилирование обнаружено не было (Ceresa et al., 1996). При этом STAT3 транспортируется в ядро и обладает транскрипционной

активностью, в частности в отношении c-fos (Coffer et al., 1997). Безусловно, каждый тип белков STAT-семейства отвечает за регуляцию определенных функций и в зависимости от типа клеток и характера воздействия на них может доминировать только один тип клеточного ответа.

Механизм транспорта активированных STAT-белков в ядро пока еще не установлен. Дело в том, что в структуре факторов STAT не обнаружено последовательности ядерной локализации (NLS), необходимой для транспорта многих белков в ядро. Установлено лишь, что димеры STAT1 могут образовывать комплекс с одним из представителей семейства а-кариоферинов (Sekimoto et al., 1997). Следует напомнить, что а-кариоферины были открыты как белки, отвечают за связывание в цитоплазме транспортируемых в ядро молекул и обеспечивающие транспорт в ядро коньюгатов, содержащих NLS (Gorlich, 1998). В нашей лаборатории была продемонстрирована возможность связи STAT-белков с элементами цитоскелета (Василенко и др., 1998b; и др., 1998; Поспелова и др., 1998) и эндосомами (Бурова и др., 1996). Совсем недавно показано, что транспорт активированного STAT3 в ядро зависит от нормального протекания эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов (Bild et al., 2003). Это говорит о том, что транслокация STAT-белков от мембранных рецепторов до ядра не является простым диффузионным процессом и состоит из определенных этапов взаимодействия с эндосомами и другими внутриклеточными структурами.

В отличие от других короткоживущих транскрипционных факторов, STAT белки имеют длительное время полужизни. Активированные молекулы STAT не деградируют, а инактивируются фосфатазами и возвращаются к латентному состоянию в цитоплазме (Haspel et al., 1996). Интересно, что была показана инактивация STAT1 ультрафиолетом, которая зависила от клеточных фосфатаз (Aragane et al., 1997). Известен и ряд специфических ингибиторов STAT-белков. Во-первых, это группа белков SOCS/SSI (suppressor of cytokine signalling/STAT-induced STAT

inhibitor), которые предотвращают активацию STAT-белков, препятствуя активации JAK киназ рецепторами цитокинов (Schindler et а!., 1999). Во-вторых, было открыто семейство белков PIAS (protein inhibitor of activated STAT), которые препятствуют связыванию активированных димеров STAT-белков с ДНК (Chung et al., 1997; Liu et al., 1998; Liao et al., 2000). Необходимо подчеркнуть, что остается слабо изученным ряд аспектов, в частности, тканеспецифичность систем негативной регуляции STAT-белков.

Многие вирусные и клеточные онкогены могут содействовать онкогенезу через активацию STAT-белков. Так, все v-Src-трансформированные клеточные линии имеют конститутивно активированный STAT3 (Bowman et al., 2000). В свою очередь, доминантно-негативные мутанты STAT3 обращают Src-трансформацию, индуцируя остановку клеточного цикла и апоптоз.

Активированные факторы STAT участвуют в регуляции различных клеточных функции, включая иммунные процессы, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Тот факт, что мыши с нокаутом по STAT3 гибнут на ранней стадии эмбрионального развития, свидетельствует о жизненной необходимости этого фактора для всего организма (Darnell, 1997). При нокауте же STAT1 наблюдается лишь подавление иммунитета (Durbin et al., 1996). Поэтому, злокачественная трансформация чаще сопровождается конститутивной активацией фактора STAT3, нежели STAT1. В случае ряда сарком именно постоянная активация STAT3 тирозинкиназой Src приводит к трансформации клеток, возможно, за счет активации транскрипции c-myc (Smith et al., 1998; Kiuchi et al., 1999). Хотя в опухолях не найдены онкогенные мутации STAT3, искусственно активированный STAT3 непосредственно вызывает трансформацию клеток и образование опухолей, что позволяет классифицировать STAT3 как протоонкоген (Bromberg et al., 1999).

Было показано, что активируемый STAT1 взаимодействует с CREB-связывающим белком СВР/рЗОО семейства транскрипционных коактиваторов, причем взаимодействует по тому же домену, что и

аденовирусный белок Е1А. Комплекс Е1А и СВР/рЗОО регулирует транскрипцию генов при вирусной репликации; таким образом, антивирусное действие IFNy может частично основываться на конкуренции STAT1 с Е1А за СВР/рЗОО (Zhang et al., 1996). Сходная конкуренция была показана и на макрофагах, где активированный при действии IFNy STAT1 конкурировал за СВР/рЗОО с АР1 комплексом, активируемым МАР киназой, что приводило к подавлению транскрипции SR-A (scavenger receptor A) (Horvai et al., 1997).

Чаще всего активация STAT1 и STAT3 происходит параллельно в ответ на различные факторы роста и цитокины. Непосредственно после фосфорилирования STAT1 и STAT3 совместно активируют транскрипцию генов раннего ответа - c-fos, c-jun, причем могут связываться с промоторами этих генов как в виде гомодимеров, так и гетеродимеров. Различия в функциях STAT1 и STAT3 выявляются лишь на длительных сроках активации.

Долговременная активация STAT3 стимулирует пролиферацию и подавляет апоптоз. Регуляция пролиферации осуществляется в первую очередь путем усиления экспрессии циклинов D, с-тус и киназы Pim-1, а также транскрипционных факторов АР-1 (c-fos и junB). Наиболее важными антиапоптотическими мишенями STAT3 являются белки семейства Bcl-2: BcI-Xl, реже МсМ и Bcl-2 (Bromberg et al., 1999; Bowman et al., 2000). Особую значимость передачи сигнала через STAT3 подчеркивают последние работы на эмбриональных стволовых (ES) клетках. Именно активация STAT3 в ответ на LIF подавляет дифференцировку ES клеток и обеспечивает их плюрипотентность (Niwa et al., 1998; Matsuda et al., 1999).

Долговременная активация STAT1, наоборот, приводит к торможению пролиферации, а в некоторых случаях к апоптозу. Антипролиферативный эффект STAT1 связан с усилением экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ - белка p21^waf1(Chin et al., 1996). STAT1 также активирует транскрипцию гена каспазы 1 (члена семейства протеаз, вызывающих апоптоз) (Chin et al., 1997) и генов Fas и FasL - активаторов системы каспаз (Xu et al., 1998). При апоптозе, индуцированном TNF-oc, STAT1

участвует в конститутивной экспрессии других представителей семейства
каспаз - Срр32, lch-1 и Ice (Kumar et al., 1997). Однако в этом случае
экспрессия осуществляется, по-видимому, комплексом

нефосфорилированного STAT1 с другими транскрипционными факторами (Schindleretal., 1998).

Биологические эффекты STAT1 и STAT3 тканеспецифичны, и эти белки могут играть прямо противоположную роль в пролиферации и выживании клеток. Так, в лимфоцитах периферической крови STAT1 необходим для IFNy-зависимой активации Raf-1 - первого компонента каскада серин/треониновых протеинкиназ (Ras-Raf-Mek-ERK), приводящего к активации ERK 1,2, которая стимулирует пролиферацию (Stancato et al., 1998). Вероятно, в этом случае STAT1 играет роль адаптора, предоставляя свой фосфотирозиновый сайт и SH2 домен. STAT3 способен индуцировать экспрессию супрессоров клеточного роста, таких как p27^kip, p19INK4d и уже упоминавшийся выше p21^waf - мишень STAT1 (Sinibaldi et al., 2000). Кроме того, физиологический апоптоз при инволюции молочной железы также опосредуется STAT3 (Chapman et al., 1999). В клетках лимфоидной и миелоидной природы STAT3 обычно передает сигнал к пролиферации и выживанию от IL-6 (Takeda et al., 1998). В то же время в нормальных В-лимфоцитах и клетках лейкимии М1 STAT3 отвечает за остановку клеточного цикла и терминальную дифференцировку (Nakajima et al., 1996), а в пре-В-лимфоцитах линии 1А9-М IL-6 вызывает апоптоз (Oritani et al., 1999). Эти примеры показывают возможность противоположного ответа при активации данного сигнального пути в зависимости от типа клеток и от набора уже имеющихся в клетке активированных сигнальных белков.

STAT3, также как и STAT1, может выполнять роль адапторного белка. Так, STAT3 участвует в зависимой активации PI-3-K, являясь посредником между субъединицей рецептора IFN-a - IFNAR1 и р85, субъединицей PI-3-К. Причем вслед за этим активированная PI-3-K фосфорилирует сам STAT3 по серину (Pfeffer et al., 1997).

Взаимосвязи и сигнальных путей с участием STAT1 и STAT3 подробно разработаны для систем, в которых доминирует активация одного пути, как, например, в случае интерферонов. Главные эффекты IFN-y - противовирусный ответ, торможение пролиферации и апоптоз -связаны с активацией STAT1. При этом стимулируется экспрессия IRF-1 и подавляется экспрессия c-myc (Sato et al., 1997; Ramana et al., 2000). Фосфорилирование STAT1 по серину, необходимое для его максимальной активации, в этом случае зависит от активности PI-3-K и Akt (Nguyen et al., 2001). Однако при выключении STAT1 за счет введения доминантно-негативной конструкции у IFN-y проявляется способность параллельно активировать пути, приводящие к противоположному эффекту: в этом случае IFN-y вызывает экспрессию c-myc и пролиферацию клеток (Asao, Fu, 2000). Экспрессия конститутивно-активного STAT3 в фибробластах также предотвращала вызванный IFN-y апоптоз, несмотря на активацию STAT1 (Shenetal.,2001).

2.6. Механизм активации STAT1 и STAT3 под действием ЭФР

Активация STAT1 и STAT3, происходящая под действием ЭФР, требует наличия интактной тирозинкиназы рецептора ЭФР (Leaman et al., 1996). Зависимость этого процесса от наличия сайтов автофосфорилирования рецептора неоднозначна - известны предпочтительные сайты посадки STAT-белков на С-конце рецептора, делеция которых, однако, не препятствует активации STAT1 и STAT3 в ответ на ЭФР (Coffer, Kruijer, 1995). В клетках с делецией четырех сайтов автофосфорилирования в рецепторе ЭФР факторы STAT по-прежнему активируются в ответ на ЭФР (David et al., 1996). Даже при удалении из рецептора ЭФР всех пяти автофосфорилируемых остатков тирозина или при замене последних на фенилаланин уровень активации факторов STAT1 и STAT3 остается выше контрольного уровня (Silvennoinen et al., 1993). Активация этих факторов полностью подавляется лишь в том

случае, когда клетки экспрессируют рецептор ЭФР с неактивной тирозинкиназой (Leaman et al., 1996).

Роль тирозинкиназ семейства JAK, как первых из описанных киназ STAT-белков также исследовалась в ЭФР-зависимой активации STAT1 и STAT3. Различные киназы JAK-семейства активируются рецепторами факторов роста (Leaman et al., 1996; Vignais, Gilman, 1999). Однако хотя киназы JAK1 и активировалась при действии на клетки ЭФР, ее активность никак не влияла на передачу сигнала через STAT-белки (David et al., 1996; Leaman et al., 1996). Исследования, проведенные в нашей лаборатории, продемонстрировали независимость активации STAT1 при действии EGF от активности киназы JAK2 (Василенко и др., 2001).

Однако результаты исследований последних лет подверг сомнению постулированный вначале однокаскадныи путь передачи сигнала от рецептора в ядро по схеме "фосфорилирование тирозинкиназой рецептора - образование димеров - транслокация в ядро" (Darnell, 1997). Так в эпителиальных клетках, оверэкспрессирующих рецептор ЭФР, рост которых зависит от рецепции аутокринно-секретируемого TGF-a, посредником в обеспечении постоянного уровня фосфорилированного STAT3 является c-Src, активирующийся рецептором ЭФР (Kami, 1999; Olayioye et al., 1999). Таким образом, в этом случае передача сигнала от рецептора ЭФР осуществляется через Src-STAT3 путь (см. рис. 4).

Механизм регуляции активности STAT1 и STAT3 за счет фосфорилирования по серину 727 еще до конца не выяснен. Некоторые исследователи считают, что сериновое фосфорилирование STAT-белков необходимо для образования гомодимеров и взаимодействия с ДНК (Zhang et al., 1995). В других работах доказывается, что сериновое фосфорилирование STAT1, которое преобладает над тирозиновым фосфорилированием в таких клетках как моноциты, повышает сродство этих факторов к определенным промоторным областям, в особенности к сайтам с низкой афинностью связывания (Eilers, Decker, 1995). Существуют также и данные о том, что сериновое фосфорилирование STAT1 и STAT3 в ответ на факторы роста, в том числе и на ЭФР, не

оказывает влияния ни на димеризацию, ни на связывание с ДНК (Wen, Darnell, 1997).

В настоящее время наибольшее признание получила точка зрения, согласно которой сериновое фосфорилирование STAT1 и STAT3 необходимо для их максимальной транскрипционной активности. Так, для

активации антивирусного эффекта в ответ на IFN-y необходимо фосфорилирование STAT1 не только по тирозину 701, но и по серину 727, которорое наблюдается и при действии PDGF (Wen et al., 1995). Было установлено, что при действии ЭФР фосфорилирование STAT1 и STAT3 по серину 727 осуществляется киназой ERK (Ihle et al., 1996). Согласно более поздним исследованиям, сродство активной ERK к STAT1 как к субстрату фосфорилирования на два порядка меньше, чем к STAT3 (Chung et al., 1997). По-видимому, фосфорилирование STAT1 по серину 727 производится другими цитоплазматическими киназами (Zhu et al., 1997). Появились данные, что сериновое фосфорилирование STAT3 может негативно регулировать его активность. Так фосфорилирование STAT3 по серину 727 МАР-киназой JNK понижает ЭФР-индуцируемое тирозиновое фосфорилирование этого фактора и его транскрипционную активность. Интересно, что конститутивная активация STAT3 в некоторых Т-клеточных лимфомах подавляется в результате серинового фосфорилирования этого фактора, которое негативно регулируется серин-треониновой фосфатазой РР2А (Woetmann et al., 1999).

Физиологическая роль STAT3 в передаче сигнала, инициируемого ростовыми факторами, изучена недостаточно. Показано, что в ряде опухолей и клеточных линий STAT3 является необходимым компонентом стимуляции роста при действии ЭФР (Zushi et al., 1998; Kami et al., 1999; Grandis et al., 2000). С другой стороны, STAT1 не только не участвует в передаче стимулирующего рост клеток сигнала, а наоборот, является основным медиатором антипролиферативного ответа. В клетках, экспрессирующих высокий уровень рецептора ЭФР, таких как А431, именно STAT1 отвечает за ЭФР-индуцируемую остановку роста (Chin et al., 1996) и апоптоз (Chin et al., 1997). Напротив, в других клетках, таких как HeLa или РС12, ЭФР стимулирует пролиферацию. Причиной разного эффекта ЭФР является мембранный ингибитор активации STAT1, связанный с рецептором ЭФР, который есть в клетках HeLa и РС12, но отсутствует в А431 (Iwamoto et al., 1998). Поэтому на большинство клеток ЭФР оказывает пролиферативное действие, а на клетки А431 -

антипролиферативное из-за активации STAT1 в отсутствие указанного ингибитора.

Необходимо учитывать, что влияние активации STAT1 и STAT3 на судьбу клетки существенно осложняется параллельной активацией других путей передачи сигнала. Например, при действии эпидермального фактора роста в клетке происходит активация МАР-киназ, PI-3-K, PLCyl, факторов STAT1, STAT3, STAT5 и NF-кВ, генерация АФК. При этом активация одних и тех же путей может наблюдаться при пролиферации, блоке клеточного цикла и апоптозе. По нашему мнению, именно сочетание и сопряжение путей передачи сигнала, зависящее от клеточного "контекста", приводит к тому или другому клеточному ответу. Все-таки остается неясным, как при действии факторов роста и ряда цитокинов могут запускаться не просто разные, а даже взаимоисключающие по конечному результату пути передачи сигнала, такие как STAT1 с одной стороны, и МАРК, STAT3 или PI-3-K с другой.

2.7. Лиганд-независимая активация рецептора.

Несмотря на то, что некоторые аспекты ЭФР-индуцируемой передачи сигнала остаются невыясненными, можно сказать, что механизм активации рецептора ЭФР под действием его физиологических лигандов исследован достаточно полно. Однако в середине 90-х годов было показано, что активация рецептора ЭФР может происходить также в ответ на действие лигандов, активирующих другие клеточные рецепторы. ЭФР-независимую активацию рецептора ЭФР называют трансактивацией. Без сомнения, исследования процессов активации рецепторов ростовых факторов, в том числе рецептора ЭФР, получили новый импульс именно благодаря открытию явления трансактивации, которое имеет важное биологическое значение. Так, было показано, что за счет трансактивации рецептора ЭФР осуществляется ERK-зависимая стимуляция пролиферации клеток в ответ на такие митогенные факторы, как LPA

(Cunnick et al., 1998) и Angll (Eguchi et al., 1998). Эти лиганды, как известно, связываются с рецепторами, ассоциированными с G-белками, после чего происходит трансактивация рецептора ЭФР. При действии на клетку такого цитокина, как TNF-a, также происходит трансактивация рецептора ЭФР (Hami et al., 2002), с последующим TNF-a-зависимым понижением уровня активации сигнальных путей, запускаемых инсулином. Лиганд-независимая активация рецептора ЭФР была обнаружена также в ответ на действие стрессовых факторов окружающей среды, таких как УФ-излучение, алкилирующие агенты, различные окислители и т. д. (Huang et al., 1996; Knebel et al., 1996). Интересно, что трансактивация рецептора ЭФР в ответ на самые различные воздействия сопровождается генерацией внутриклеточных или экстраклеточных АФК (Griendling et al., 1994; Huang et al., 1996; Peus et al., 1999). Стимуляция профессионально-нефагоцитирующих клеток разнообразными лигандами, включая цитокины (Meier et al., 1989), пептидные ростовые факторы (Sundaresan et al., 1995; Bae et al., 1997) и лиганды рецепторов, сопряженных с G-белками (Griendling et al., 1994), приводит к временному и быстро проходящему возрастанию уровня АФК в клетке. Эти результаты привели к пересмотру взглядов на биологическую роль АФК, которые в течение многих лет рассматривали лишь как токсические агенты, негативно влияющие на различные клеточные процессы и способствующие возникновению различных болезней и дегенеративным процессам (старение, канцерогенез, иммунодефицит) (Janssen et al., 1993). Исследование трансактивации рецептора ЭФР показали, что АФК выполняют во внутриклеточных сигнальных процессах также и регуляторную функцию (см. обзор Gamaley, Klyubin, 1999). Оказалось также, что АФК-индуцируемая активация свойственна различным нерецепторным тирозинкиназам (Abe et al., 1999) и МАР-киназам (Guyton et al., 1996; Peus et al., 1999; Chen et al., 2001). Внеклеточные АФК вызывают фосфорилирование остатков тирозина на рецепторе ЭФР (Gamou, Shimizu, 1995; Goldkorn et al., 1998), с которыми затем могут связываться PLCyl, адапторный белок She и комплекс Grb2-SOS (Rao et al., 1996). Это

позволяет предполагать, что при трансактивации функциональная активность рецептора ЭФР такая же, как и при стимуляции ЭФР. Несмотря на возрастающий интерес к этой проблеме и многочисленные публикации, пока неизвестны конкретные белки-мишени действия различных АФК на поверхности и внутри клетки; в частности, нет ответа на вопрос является ли сам рецептор ЭФР редокс-чувствительной молекулой. Между тем, учитывая важную роль рецептора ЭФР в физиологическом ответе клетки на действие различных лигандов и факторов внешней среды, выяснение механизма трансактивации рецептора ЭФР становится особенно важной проблемой. Трансактивация рецептора ЭФР, особенно в клетках, экспрессирующих его в больших количествах, может являться ключевым моментом в определении дальнейшей судьбы клетки.

2.8. Роль АФК в активации рецептора ЭФР и факторов

STAT.

Как следует из предыдущей главы, для лучшего понимания механизма регуляции активности рецептора ЭФР и факторов STAT1 и STAT3, присходящей как в ответ на физиологический лиганд, так и лиганд-независимо, необходимо рассмотреть природу АФК и способы их образования в клетке. В следующем разделе мы затронем проблему биогенеза АФК, и более подробно остановимся на тех системах генерации АФК, которые играют важную роль в активации сигнальных путей от рецепторов ростовых факторов и цитокинов.

2.8.1. Системы генерации АФК и поддержания внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса.

Активные формы кислорода (промежуточные продукты одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода) могут быстро вызывать окислительные повреждения липидов, ДНК, белков и

боковых цепей ключевых аминокислот, что приводит к образованию связей между белками, нарушению структуры полипептидной цепи и фрагментации белка. Полагают, что это может приводить к дегенеративным процессам, которые лежат в основе старения, канцерогенеза и многих болезней, в частности, ишемии, болезни Паркинсона, атеро- и кардиосклероза (Janssen et al., 1993).

Однако в клетке постоянно синтезируются различные АФК как побочные продукты окислительно-восстановительных реакций. Уровень этих внутриклеточных АФК в норме очень низок благодаря тому, что в цитоплазме клетки существует восстановительный буфер, устраняющий опасные окислители и свободные радикалы. Основным компонентом этого буфера является глутатион - трипептид у-глутамилцистеинилглицин, содержащий в своем составе цистеин, имеющий сульфгидрильную группу, которая выступает в качестве донора электронов. Глутатион является основным внутриклеточным антиоксидантом. Благодаря активности глутатионпероксидазы осуществляются сопряженные процессы окисления глутатиона и переноса электронов с его сульфгидрильной группы на различные электрофильные соединения, к которым относятся и АФК. Помимо глутатиона в клетке также присутствуют такие антиоксиданты, как ферритин, которые хелатируют ионы переходных металлов, не позволяя им катализировать генерацию АФК.

Полное восстановление молекулы Ог происходит в митохондрях за счет осуществляемого цитохромоксидазой четырехэлектронного переноса. Однако в результате неполного восстановления Ог могут образовываться различные реакционноспособные соединения. При переносе одного электрона на Ог образуется супероксид анион (Ог'"). который затем очень быстро превращается в НгОг. В присутствии ионов переходных металлов (Fe²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺) НгОг по реакции Фентона превращается в более реакционноспособный гидроксил радикал (ОН). Для защиты от повреждающего действия этих АФК существуют такие ферменты, как супероксиддисмутаза (SOD) (восстанавливает Ог" до

H2O2), каталаза и глутатионпероксидаза. Состояние клетки, при котором скорость генерации АФК превышает скорость их восстановления ферментативными системами, или истощается пул внутриклеточных антиоксидантов, характеризуют как окислительный стресс.

АФК могут генерироваться как ферментативными системами, так и без участия ферментов. Образование свободных радикалов может сопровождать практически любую реакцию, осуществляемую электрон-переносящим ферментативным комплексом. В физиологических условиях митохондрии являются основным источником АФК в клетке. Например, 1-2% Ог, потребляемого митохондриями, превращается не в НгО, а в различные АФК, в первую очередь в Ог". Из-за высокого уровня митохондриальной SOD внутриклеточная концентрация 0₂" поддерживается на очень низком уровне, и этот анион, скорее всего, не проникает в цитоплазму (в отличие от НгОг). В последние годы было обнаружено, что митохондриальные АФК играют важную роль в запуске апоптоза (Banki et al., 1999).

Другим источником АФК являются системы ферментов, связанные с мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭПР), в основном гладкого ЭПР. Наиболее хорошо изучена система цитохрома Р-450 и семейство ферментов Ьб. Они катализируют окисление ненасыщенных жирных кислот, жирорастворимых лекарственных веществ и токсинов, отнимая у них электроны, которые восстанавливают 0₂ до Ог" или H₂0₂ (Capdevila et al., 1981). Генерируемые таким образом АФК, вероятно, не участвуют в регуляции сигнальных путей, активируемых рецепторами ростовых факторов, а выполняют важную роль в процессе сворачивания белков и их секреции (Cantin et al., 1990).

Ядерная мембрана содержит цитохром-оксидазу и системы переноса электронов, подобные соответствующим системам ЭПР (Freeman et al., 1982). Биологические функции этих систем на данный момент четко не установлены. Возможно, генерируемые ими АФК регулируют ядерный транспорт или способствуют повреждениям ДНК (Halliwell et al., 1992).

Пероксисомы также синтезируют Н2О2 благодаря содержащимся в этих органеллах ферментам таким как гликолат оксидаза, оксидаза D-аминокислот, оксидаза L-a-гидрокси кислот и оксидаза ацетил-СоА. Генерируемая этими ферментами Н2О2 используется каталазой и пероксидазами для окисления различных субстратов (Tolbert et аі., 1981). В настоящее время нет данных об участии генрируемых пероксисомами АФК в системе внутриклеточной сигнализации.

Кроме ферментативных систем, связанных с различными
органеллами, в цитоплазме также существуют различные растворимые
ферменты, например ксантиноксидаза, альдегидоксидаза,

дигидрооротатдегидрогеназа, флавопротеиновые дегидрогеназы, которые генерируют АФК в ходе их каталитического цикла (Freeman et al., 1982). Наиболее изученным из этих ферментов является ксантиноксидаза, которая используется для генерации Ог* in vitro. В цитоплазме также присутствует SOD, которая, в отличие от митохондриальной, содержит в своем геме не Mn, a Fe или Zn.

Неферментативное самоокисление таких молекул как дофамин, эпинефрин, различные флавины и гидрохиноны также служит источником АФК (Freeman et al., 1982), в первую очередь Ог''. Генерируемые таким образом АФК участвуют скорее всего не в передаче сигнала от рецепторов цитокинов и факторов роста, а изменяют общий окислительно-восстановительный баланс.

Основным же источником лиганд-индуцируемой генерации АФК является комплекс ферментов, связанный с плазматической мембраной. Наиболее исследован NADPH-оксидазный комплекс в фагоцитирующих клетках (Segal et al., 1997), где он выполняет специфические функции, способствуя защите от микроорганизмов. Ферментативной активностью

Обладает ВХОДЯЩИЙ В ЭТОТ КОМПЛеКС ЦИТОХрОМ Ь₅58, состоящий из 2-х

субъединиц - p91^phox и p22^phox, которые катализируют восстановление Ог до Ог" за счет акцептируемых у NADPH электронов. Перенос электронов, по-видимому, осуществляет субъединица p91^phox , так как она содержит участки связывания NADPH (Doussiere et al., 1993) и

флавинадениндинуклеотида (FAD) (Segal et al., 1992), необходимого в качестве дополнительного переносчика электронов. Кроме того, в состав NADPH-оксидазы фагоцитов входят субъединицы p67^phox, p47^phox и p40^phox, которые вместе с цитохромом D558 образуют полноценный ферментативно-активныи комплекс (Babior, 1999). Для активации этого комплекса в фагоцитах необходимы белки Rac2 и RaplA - члены малых GTPa3 суперсемейства Ras.

Недавние исследования показали, что комплекс, функционально аналогичный NADPH-оксидазе фагоцитов, существует и в клетках других типов. Оказалось, что p22^phox является функциональным компонентом оксидазы, генерирующей Ог" в ответ на Ang II и TNF-cc (Zafari et al., 1998). Однако в нефагоцитирующих клетках NADPH-оксидазный коплекс, по-видимому, имеет другой состав. Например, в гладкомышечных клетках сосудов (Vascular Smooth Muscle Cells, VSMC) и в фибробластах не было обнаружено субъединицы p91^phox (Gorlach et al., 2000), хотя эти клетки способны генерировать АФК в ответ на Angll и TNF-a (Griendling et al., 1994; Meier et al., 1989). В VSMC, однако, был обнаружен ген Мох-1, кодирующий белок, гомологичный p91^phox (Suh et al., 1999).

В нефагоцитирующих клетках регуляция активности NADPH-оксидазы осуществляется СГРазой Rac1 (Joneson, Bar-Sagi, 1998). Белок Ras также осуществляет регуляцию NADPH-оксидазы через Rac1. Подавление активности Rac блокирует повышение уровня Ог", происходящее как в ответ на цитокины и факторы роста, так и при экспрессии H-Ras^v12 — конститутивно активной формы Ras (Sundaresan et al., 1996). Интересно отметить, что экспрессия в клетке различных онкогенных форм гена Ras -H-Ras или Ki-Ras - совершенно противоположным образом сказывается на уровне внутриклеточных АФК. Если H-Ras вызывает коститутивную активацию NADPH-оксидазы и повышение уровня Ог'" (Liu et al., 2001), то экспрессия Ki-Ras приводит к ERK-зависимому повышению экспрессии митохондриальной Мп-содержащей SOD и, как следствие, к понижению уровня АФК (Santillo et al., 2001). Ras необходим также для генерации Ог" в ответ на PDGF-BB, FGF-2 и TGF-p (Thannickal et al., 2000). Однако в

российская

ЇРСУДАРСТВЕКИ^ЯГ
41 БИБЛИОТЕКА

настоящий момент начинают появляться данные, указывающие на возможность существования других связанных с мембраной АФК-генерирующих систем. Эти системы активируются при стимуляции клеток такими лигандами, как TGF-p1 и продолжают генерировать АФК (в данном случае Н₂0₂) в течение нескольких часов, в то время как NADPH-оксидаза работает лишь в течение нескольких минут после стимуляции клеток. Этот новый оксидазный комплекс не зависит от активности Ras и использует в качестве донора электронов не NADPH, a NADH.

Достаточно давно было известно о существовании в нефагоцитирующих клетках оксидаз, осуществляющих метаболизм липидов. Фосфолипиды, помимо того, что обеспечивают целостность плазматической мембраны, являются также субстратами различных фосфолипаз, таких как PLC, PLD и PLA₂. Недавно было обнаружено, что при стимуляции VSMC Angll в генерации 0₂" участвует не только за счет NADPH-оксидаза, но и активная PLD. Р1_А₂ гидролизует фосфолипиды с образованием арахидоновой кислоты, которая является субстратом сиклооксигеназы (СОХ) и липооксигеназы (LOX), осуществляющих синтез четырех основных видов эйкозанойдов: простагландины, простациклины, тромбоксаны и лейкотриены. На некоторых стадиях синтеза этих веществ в качестве промежуточных продуктов образуются соединения с неспаренными электронами. В частности, катализируемые LOX ферментативные стадии синтеза лейкотриенов сопровождаются генерацией АФК, которые играют важную роль в передачи сигнала от рецепторов Angll (Wen et al., 1997), и IL-1 (Bonizzi et a!., 1999). Кроме того, стимуляция рецептора EGF в клетках PC 12 приводит к активации LOX, которая осуществляет синтез 0₂~ (Mills et al., 1998)

2.8.2. Роль внутриклеточных АФК в процессе активации рецептора ЭФР и факторов STAT.

Как отмечалось выше, активация рецептора ЭФР сопровождается повышением уровня внутриклеточных АФК. Это справедливо как для случая активации рецептора его специфическим лигандом (Bae et al.,

1997), так и при трансактивации в результате действия таких факторов, какАпдМ (Griendling et al., 1994) или TNF-oc (Meier et al., 1989).

При действии ЭФР в клетке в основном генерируется Н2О2 (Вае et al., 1997; Goldman et al., 1997). Понижение концентрации внутриклеточной Н₂Ог путем введения в клетки каталазы приводит к уменьшению лиганд-индуцированного фосфорилирования рецептора ЭФР, а также связывание с рецептором и фофорилирование сигнальных молекул, таких как PLCy. ЭФР-индуцированная генерация Н2О2 зависит от тирозинкиназы рецептора и нечувствительна к удалению тирозиновых сайтов автофосфорилирования (Вае et al., 1997). Механизм генерации АФК в ответ на ЭФР еще не установлен. Вероятно, основную роль в этом процессее играет мембранносвязанный NADPH-оксидазный комплекс, который может активироваться сигнальным каскадом рецептор ЭФР-комплекс Grb2-SOS - Ras - Rac1. Однако эта гипотеза требует подтверждения, так как возможно существование и других механизмов активации NADPH-оксидазы. Так, в случае активации рецептора PDGF, генерация АФК зависит от активности PI-3-K (Вае et al., 2000). В этом случае, по-видимому, работает РІ-3-К-путь активации NADPH-оксидазы, который запускается в результате повышения концентрации мембранных 3-фосфоинозитидов. Это приводит к транслокации на мембрану белка Vav, обладающего РН доменом. В результате Vav активируется и осуществляет обмен связанного с Rac GDP на GTP. Это вызывает активацию Rac, который и стимулирует выработку АФК NADPH-оксидазой.

Основным источником Angll-зависимой генерации АФК, как хорошо установлено, является NADPH-оксидаза (Griendling et al., 1994). Активность этого ферментативного комплекса необходима как для Angll-индуцированной гипертрофии сосудов (Zafari et al., 1998), так и для активации различных киназ (Frank et al., 2001). Выше уже упоминалось, что стимуляция Angll клеток VSMC приводит к трансактивации рецептора ЭФР. При этом из пяти сайтов автофосфорилирования на цитоплазматическом конце рецептора ЭФР фосфорилируются преимущественно тирозины 1068 и 1173. Это фосфорилирование

подавляется как в результате обработки клеток антиоксидантом NAC так и при уменьшении активности NADPH-оксидазы ингибитором флавопротеинов дифениленйодонием (DPI). Интересно, что при действии Angll происходит также активация тирозинкиназы Src, которая зависит от генерации АФК (Ushio-Fukai et al., 2001). При этом подавление активности Src фармакологическими ингибиторами или за счет сверхэкспрессии мутантной формы c-Src, обладающей неактивной тирозинкиназой, приводит к значительному снижению уровня трансактивации рецептора ЭФР. Таким образом, стимуляция клеток Angll является примером АФК-зависимой трансактивации рецептора ЭФР, осуществляемой за счет активности нерецепторной тирозинкиназы c-Src. Стоит отметить, что механизм Angll-зависимой трансактивации рецептора ЭФР исследован гораздо лучше, чем все остальные случаи его лиганд-зависимой трансактивации.

TNF-a также вызывает трансактивацию рецептора ЭФР (Hirota et al., 2001). При стимуляции фибробластов и эндотелиальных клеток TNF-a генерация АФК осуществляется NADPH-оксидазным комплексом (Murphy et al., 1992; Meier et al., 1989), которому в случае эндотелиальных клеток для полной активности требуется субъединица p47^phox (Li et al., 2002).

Роль генерируемах АФК в процессе лиганд-зависимой активации факторов STAT1 и STAT3 еще недостаточно исследована. Существует лишь несколько экспериментальных работ, посвященных данной проблеме (Simon et al., 1998; Carballo et al., 1999; Kim et al., 2001; Madamanchi et al., 2001). При этом степень вовлеченности АФК в процесс ЭФР-зависимого фосфорилирования факторов STAT до сих пор не изучалась.

Ранее было исследовано влияние агентов, изменяющих окислительно-восстановительные свойства цитоплазмы клеток, на уровень PDGF-индуцируемой активации факторов STAT1 и STAT3 (Simon et al., 1998). Оказалось, что ДНК-связывающая активность факторов STAT снижается в результате обработки клеток антиоксидантами или DPI. Кроме того, агенты, понижающие уровень внутриклеточного глутатиона,

оказывали активирующее действие на STAT1 и STAT3. Это означает, что повышение уровня АФК и истощение пула внутриклеточных антиоксидантов в значительной степени способствуют активации факторов STAT, инициируемой факторами роста. В другой работе исследовалась редокс зависимость активации факторов STAT в ответ на действие Ang II в клетках VSMC (Schieffer et al., 2000). При действии этого лиганда факторы STAT1 и STAT3 активируются тирозинкиназой JAK2. Оказалось, что нгибирование NADPH-оксидазного комплекса при помощи DPI или путем введения в клетку антител, специфичных к субъединице p47^phox, подавляло активацию JAK2 и, как следствие, блокировало фосфорилирование STAT1 и STAT3. В результате полностью подавлялся Angll-индуцируемый синтез IL-6, который запускался каскадом JAK-STAT. Это указывает на зависимость функциональной активности факторов STAT от способности клеток генерировать АФК. Другая группа авторов показала, что в тех же клетках активация факторов STAT1 и STAT3 под действием тромбина осуществляется киназой JAK2 и зависит от генерации АФК (Madamanchi et al., 2001).

IFN-y также запускает генерацию АФК в различных типах клеток. В фагоцитах IFN-y активирует NADPH-оксидазный комплекс (Babior et al., 1973), а в гепатоцитах стимулирует выработку Н2О2 за счет активности циклооксигеназы (Lajarin et al., 1999). Неудивительно, что процесс активации STAT1 и STAT3 под действием IFN-y оказался АФК-зависимым (Kim et al., 2001). Обработка тироидных клеток метимазолом понижала уровень IFN-y-индуцированного фосфорилирования STAT1 и STAT3 благодаря способности этого соединения осуществлять перенос электронов от глутатиона и тиоредоксина на различные клеточные окислители (Kim et al., 2001). Таким образом, метимазол обладает свойствами антиоксиданта, что и является причиной его давно известного иммуномодуляторного действия.

Каков же механизм действия АФК? В частности, каким образом генерация АФК способствует повышению уровня активации рецепторных и нерецепторныхтирозинкиназ?

Активация рецептора ЭФР и рецептор-опосредованная активация других сигнальных белков определяется балансом активности тирозинкиназы рецептора и клеточных фосфатаз. Для максимальной активации рецептора ЭФР и фосфорилируемых им белков, в том числе и факторов семейства STAT, необходимо временно инактивировать клеточные протеинтирозинфосфатазы (Haque et al., 1995; Caselli et al., 1998; Lee et al., 1998). В настоящее время полагают, что инактивация фосфатаз, под негативным контролем которых находится в нестимулированных клетках рецептор ЭФР, может служить первоначальным импульсом для активации рецептора. Особенно важную роль инактивация фосфатаз может играть в клетках, экспрессирующих высокий уровень рецептора ЭФР, таких как А431. В этих клетках некоторая часть рецептора находится в виде димеров даже в отсутствие стимуляции (Gadella, Jovin, 1995), поэтому кратковременной инактивации фосфатаз, вероятно, будет достаточно для инициации процесса взаимного фосфорилирования рецепторных субъединиц. Все фосфатазы содержат в своем активном центре мотивы, состоящие из цистеина и аргинина, разделенных пятью остатками аминокислот (CXXXXXR). Сульфгидрильные группы цистеина, входящие в эти последовательности, чувствительны к окислению под действием внутриклеточных АФК (Stone, Dixon, 1994). Такое окисление приводит к ингибированию ферментативной активности фосфатаз и является обратимым процессом. Окисленные цистеиновые остатки могут восстанавливаться в результате действия тиоредоксина или глутатиона (Lee et al., 1998). Следовательно, активность фосфатаз регулируется АФК, с одной стороны, и антиоксидантами, с другой. Антиоксиданты, повышающие восстановительные способности клетки за счет увеличения концентрации глутатиона, могут модулировать степень активации фосфатаз и пути передачи сигнала от различных физиологических лигандов. С другой стороны, лиганд-опосредованная активация рецептора ЭФР приводит к генерации различных видов АФК (Bae et al., 1997; Гамалей и др., 1999), в результате чего концентрация внутриклеточных восстановителей может понижаться, и, как следствие,

происходит как инактивация фосфатаз, так и активация сигнальных молекул за счет их окисления.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что исследование зависимости активации рецептора ЭФР и факторов STAT от уровня внутриклеточных АФК необходимо для лучшего понимания процесса регуляции сигнального каскада с участием транскрипционных факторов STAT.

2.8.3. Активация рецептора ЭФР и факторов STAT под действием

экзогенных АФК.

Открытие важной роли АФК в процессе активации рецептора ЭФР под действием различных лигандов или факторов окружающей среды стимулировало интерес к изучению модуляции активности компонентов сигнальных каскадов под действием внеклеточных АФК.

Как оказалось, АФК могут изменять активность различных сигнальных молекул, что чаще всего приводит к активации последних. АФК активируют МАР-киназы ERK1/2, ERK5 и JNK (Stevenson et al., 1994; Guyton et al., 1996; Abe et al., 1997; Chen et al., 2001), киназы Scr- и JAK-семейств (Nakamura et al., 1993; Brummel et al., 1996; Simon et al., 1998), транскрипционные факторы AP-1 (Nikitovic et al., 1998), NF-kB (Schreck et al., 1991) и Hif-1 (Wang et al., 1995). Плазматические рецепторы, в том числе и рецептор ЭФР, вероятно, первыми подвергаются действию внеклеточных АФК, так как имеют экстраклеточный домен. Поэтому активация рецепторов ростовых факторов часто является необходимой стадией, предшествующей АФК-индуцируемому запуску различных сигнальных путей.

Как уже говорилось, АФК вазывают преимущественно тирозиновое фосфорилирование рецептора ЭФР (Goldkom et al., 1998). Например, при действии Н2О2 на клетки кожной карциномы NA значительно повышается уровень фосфорилирования тирозина 1173 и лишь немного усиливается фосфорилирование серина в положениях 671, 1046 и 1047 и треонина 669, в то время как ЭФР стимулирует фосфорилирование всех

перечисленных АО в одинаковой степени (Gamou, Shimizu, 1995). Общий уровень НгОг-индуцированного фосфорилирования рецептора ниже того, которое наблюдается при действии ЭФР (Gamou, Shimizu, 1995; Goldkorn et al., 1998). Вероятно, среди тирозиновых сайтов автофосфорилирования рецептора ЭФР существуют более чувствительные к действию экзогенных АФК. Например, при действии Н₂0₂ наблюдается лишь незначительное повышение уровня фосфорилирования тирозина 1045, который является основным сайтом связывания убиквитин лигазы рецептора ЭФР - белка СЫ (Ravid et al., 2002). В результате скорость интернализации и деградации такого рецептора уменьшается по сравнению с рецептором, активированным в ответ на действие ЭФР. Недостаточное убиквитинилирование рецептора ЭФР может быть связано с тем, что в условиях окислительного стресса понижается уровень восстановленного клеточного глутатиона, и, как следствие, уменьшается содержание необходимых для ферментативной активности убиквитин-лигаз SH групп (Wit etal, 2001).

Активированный экзогенными АФК рецептор ЭФР запускает некоторые сигнальные пути, которые активируются в ответ на ЭФР. В результате действия Н2О2 с рецептором связывается и активируется PLC-Y (Rao et al., 1996; Goldkorn et al., 1998), которая играет важную роль в обеспечении выживания клетки в условиях окислительного стресса (Wang et al., 2001). Белок She и комплекс Grb2-SOS также могут ассоциировать с НгОг-активированным рецептором ЭФР (Rao et al., 1996; Kamata et al., 2000), что приводит к активации MAP киназы ERK и запуску пролиферации. Однако не на все клеточные линии АФК оказывают митогенное действие. Например, в клетках легочной аденокарциномы в результате лиганд-независимой активации рецептора ЭФР не происходит активации МАР-киназы ERK, и понижается активность серин-треониновой киназы РКС-а (Goldkorn et al., 1998). Как известно, РКС осуществляет негативную регуляцию тирозинкиназной активности рецептора ЭФР за счет активации каскада МЕК - ERK (Morrison et al., 1996). Поэтому в клетках аденокарциномы НгОг-зависимое фосфорилирование рецептора

сохраняется гораздо дольше, чем ЭФР-индуцированное (Goldkorn et al., 1998).

Лиганд-независимая активация рецептора ЭФР приводит также и к активации каскада PI-3-K - Akt в таких клеточных линиях, как NIH3T3, HeLa, А549 и MCF-7 (Wang et al., 2000). Pl-З-К, обладающая высокой антиапоптотической активностью, способствует выживанию клеток в условиях окислительного стресса (Wang et al., 2000; Goldshmit et al., 2001). Подавление активности Pl-З-К или киназы Akt значительно увеличивает уровень апоптотической гибели клеток линии HeLa от Н₂0₂ (Wang et al., 2000). В клетках PC12-ErbB4 активация каскада Pl-З-К - Akt через рецептор ЕгЬВ4 предотвращает вызванное экзогенной Н2О2 повышение уровня внутриклеточных АФК. Благодаря этому уровень гибели клеток в условиях окислительного стресса понижается (Goldshmit et al., 2001).

Изучение процесса АФК-индуцированной передачи сигнала через рецептор ЭФР на факторы STAT до сих пор не проводилось. Активация STAT1 и STAT3 в условиях окислительного стресса изучалась лишь в нескольких работах на таких клеточных линиях как фибробласты, лимфоциты, VSMC и тироидные клетки. Было показано, что в фибробластах Н₂0₂ стимулирует ДНК-связывающую активность факторов STAT1 и STAT3, чему предшествует активация тирозинкиназы JAK2 (Simon et al., 1998). Это наводит на мысль о возможном участии данной тирозинкиназы в лиганд-независимой активации STAT-факторов. Данная гипотеза была подтверждена в ходе исследований VSMC, в которых НгОг-индуцированная активация STAT1 и STAT3 зависела от активности киназы JAK2 (Madamanchi et al., 2001). В лимфоцитах Н₂Ог вызывает тирозиновое фосфорилирование, транслокацию в ядро и связывание STAT3, и в меньшей степени STAT1 и STAT5, с ДНК (Carballo et al., 1999). Причем активирующий эффект Н₂0₂усиливается в присутствие ионов Fe⁺² и Zn⁺², способствующих образованию гидроксил-радикала по механизму реакции Фентона.

Несмотря на многочисленные исследования, механизм фосфорилирования факторов STAT1 и STAT3, запускаемый АФК-

индуцированной активацией рецептора ЭФР, до конца неясен. Это может показаться странным, так как первые исследования пострецепторных сигнальных путей, инициированных АФК, появились в середине 90-х годов. В тот период STAT-путь еще рассматривался как однокаскадный и наиболее простой из запускаемых рецептором ЭФР. Поэтому и можно было бы ожидать, что активация этих факторов под действием внеклеточных АФК будет исследована одной из первых. Однако факт остается фактом, и данная проблема остается белым пятном в области изучения функционирования сигнальных каскадов в условиях окислительного стресса.

2.9. Активация нерецепторных тирозинкиназ под действием

АФК.

Как известно, первоначальные исследования процесса активации факторов STAT1 и STAT3 показали, что эти факторы фосфорилируются тирозинкиназой рецептора ЭФР. В последние годы в это были внесены существенные коррективы. Было установлено, что важную роль в этом процессе играют нерецепторные тирозинкиназы семейств Src и JAK. Поэтому понимание механизма лиганд-независимой активации факторов STAT невозможно без изучения роли этих киназ. Далее мы рассмотрим имеющиеся на настоящее время данные об участии этих киназ в активации рецептора ЭФР и факторов STAT, а также коснемся вопроса об активации этих киназ в условиях окислительного стресса.

В одной из работ было продемонстрировано, что подавление активности киназы c-Src при помощи сверхэкспрессии доминант-негативной конструкции, кодирующей неактивный мутант c-Src, ингибировало ЭФР-индуцированную активацию факторов STAT. Оказалось также, что в нестимулированных клетках рецептор ЭФР образует комплекс с факторами STAT и киназой JAK2. Киназа c-Src взаимодействует с этим комплексом после действия ЭФР, фосфорилирует киназу JAK2 и участвует в активации факторов STAT (Olayioye et al., 1999). Это свидетельствует о сложном характере процесса

активации факторов STAT, в который, помимо рецептора, вовлечены также нерецепторные тирозинкиназы семейств Src и JAK.

Киназы этих семейств в настоящее время рассматриваются в качестве основных киназ, регулирующих активность факторов STAT. Так, конститутивная активация киназ семейства Src - Src или Lck - вызывает активацию фактора STAT3 в различных типах клеток (Cao et al, 1996; Lund et al., 1999) которая сопровождается также повышением активности киназ JAK1 и JAK2, что говорит о возможном существовании каскада Src - JAK -STAT (Campbell et al., 1997; Yu et al., 1997). Активация факторов STAT киназами семейств JAK и Src была также продемонстрирована в различных экспрессионных системах (Lund et al., 1999; Park et al., 1996; Zhang et al., 2000). В некоторых клетках активность JAK-киназ является необходимым условием для Src-опосредованной активации факторов STAT (Zhang et al., 2000). Также было показано, что Angll вызывает образование комплекса между JAK2 и c-Src, в котором взаимодействие между этими киназами присходило за счет фосфорилированного по остаткам тирозина N-концевого участка JAK2 и SH2 домена c-Src (Sayeski et al., 1999).

Киназы семейств Src и JAK принимают активное участие в процессе трансактивации рецептора ЭФР. Например, митогенное действие гормона роста осуществляется за счет того, что активированная киназа JAK2 фосфорилирует рецептор ЭФР по тирозину 1068, с которым затем связывается комплекс Grb2-SOS (Yamauchi et al., 1998). Трансфекция c-Src в клетки, экспрессирующие высокий уровень рецептора ЭФР, приводит к фосфорилированию последнего по тирозиновым остаткам 845 и 1101 (Biscardi et al., 1999) и к усилению пролиферации в ответ на различные митогенные факторы (Tice et al., 1999). Вероятно, оба этих остатка тирозина фосфорилируются именно c-Src, так как они обнаружены даже в случае, когда рецептор ЭФР не обладает тирозинкиназной активностью (Wu et al., 2002). Кроме того установлено, что участок c-Src с 413 по 431 АО отвечает за специфическое связывание с рецептором ЭФР (Satoetal., 1995).

Важным свойством киназ семейств JAK и Src, позволяющим рассматривать их в качестве основных участников в процессе АФК-зависимой активации факторов STAT, является их чувствительность к действию экстраклеточных окислителей. Так, Н2О2 вызывает активацию Src в кардиомиоцитах (Aikawa et al., 1997), фибробластах (Abe et al., 1997), VSMC (Yoshizumi et al., 2000) и эндотелиальных клетках (Chen et al., 2001). В гематопоэтических клетках АФК активируют такие киназы семейства Src, как Hck, Lyn, Lck (Hardwick, Sefton, 1995; Lund et al., 1999; Malozzi et al., 2001). Киназы семейства JAK активируются в ответ на Н2О2 в VSMC и затем фосфорилируют факторы STAT1 и STAT3 (Madamanchi et al., 2001). Обработка Н2О2 фибробластов, лимфоцитов и эндотелиальных клеткок также приводила к активации киназы JAK2 (Simon et al., 1998; Abe et al., 1999). Интересно, что в некоторых случаях активированная JAK-киназа фосфорилировала киназу Src-семейства Fyn, которая далее стимулировала Ras-MAP-киназный каскад (Abe et al., 1999). Это означает, что помимо отмеченной нами ранее возможности активации JAK-киназ членами семейства Src, может существовать и обратная регуляция активности Src-киназ киназами JAK-семейства. Все вышесказанное позволяет рассматривать киназы семейств Src и JAK как основных кандидатов на роль посредников в передаче сигнала от рецептора ЭФР к факторам STAT в условиях окислительного стресса.

В заключение отметим, что исследования последних лет все больше и больше убеждают нас в том, что для передачи внутриклеточного сигнала пока нельзя установить однозначной, четкой и последовательной схемы функционирования какого-либо определенного каскада, универсальной для клеток разных типов. По мере накопления экспериментальных данных картина регуляции активности того или иного сигнального пути становится все более и более сложной, включающей петли положительных и отрицательных обратных связей, разобраться в которых подчас очень трудно. В полной мере это относится и к каскадам, по которым Src-киназы, киназы JAK и факторы STAT передают сигнал от различных мембранных рецепторов на геном клетки. Однако подобного

рода сложности являются интригующими и лишь подогревают интерес исследуемой проблеме.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Клеточные линии.

В работе использовались следующие клеточные линии:
клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431,
полученные из Российской коллекции клеточных культур Института
цитологии РАН (Санкт-Петербург); клетки линий HER14 (мышиные
фибробласты NIH3T3, трансфицированные полноразмерным
человеческим рецептором ЭФР), CD126 (NIH3T3,

трансфицированные мутантным рецептором ЭФР с делецией 126 С-концевых АО) и К721А (NIH3T3, трансфицированные рецептором ЭФР с неактивной тирозинкиназой) любезно предоставленные д-ром Дж. Шлессинджером (New York University, США); клетки линии PURO (мышиные фибробласты с нокаутом по гену c-src), а в качестве контроля к ним - клетки линии WT (те же фибробласты с обратной трансфекцией гена c-src), любезно предоставленные д-ром Н. Хайнес (N. Hynes, Институт им. Ф. Мишера, Швейцария). Все клетки культивировали в среде ДМЕМ с глутамином (Биолот, Санкт-Петербург), содержащей 10 % эмбриональной сыворотки (Gibco, США) и 40 мкг/мл гентамицина. Для экспериментов использовали культуры, достигшие субконфлюэнтного состояния, за 1 сут до начала эксперимента клетки переводили на среду ДМЕМ, содержащую 0.5 % эмбриональной сыворотки.

3.2. Обработка клеток ингибиторами.

Ингибитор тирозинкиназы рецептора ЭФР AG1478 добавляли в культуральную среду в концетрации 5 мкМ на 60 мин.

Ингибитор киназ Src-семейства CGP77675 добавляли к клеткам в концентрации 1 мкМ при 37С в среде ДМЕМ за 90 минут до стимуляции. Для подавления активности киназы c-Src клетки обрабатывали различными концентрациями (0,1-5 мкг/мл) ингибитора радицикола (radicicol) в течение 60 мин при 37С в среде ДМЕМ. Специфический ингибитор тирозинкиназы JAK2 добавляли к клеткам в концентрации 50 мкМ при 37С на 45 мин в среде ДМЕМ. Все дальнейшие инкубации проводили с постоянным присутствием ингибиторов в рабочей среде.

Антиоксидант N-ацетилцистеин (NAC) в различных концкентрациях добавляли к клеткам на 4 ч при 37С в среде ДМЕМ. Первоначальный раствор 1 М NAC в воде готовили непосредственно перед экспериментом и титровали до рН 7,0 при помощи NaOH. Ингибитор флавопротеинов дифениленйодоний (DPI) вносили в культуральную среду в требуемой концентрации на 30 мин.

3.3. Стимуляция клеток и приготовление тотальных клеточных лизатов.

Стимуляцию клеток ЭФР (100 нг/мл) проводили в течение 10 мин в среде ДМЕМ при 37 С в атмосфере 5 % СОг. Ингибиторы киназ добавляли в культуральную среду за 1 ч до стимуляции, и клетки инкубировали при 37 С в атмосфере 5 % СОг. Окислительный стресс вызывали сменой культуральной среды на среду ДМЕМ, содержащую НгОг в разных концентрациях (от 0.1 до 5 мМ) с последующей инкубацией в течение определенного времени при 37 С в атмосфере 5 % С0₂.

После окончания инкубации клетки помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при +4 С. Клетки промывали

один раз холодным фосфатно-солевым буфером (PBS, 8 мМ Na₂HP0₄, 150 мМ NaCI, 1.5 мМ КН₂Р0₄, 3 мМ KCI, рН 7.4) и два раза раствором PBS, содержащим 5 мМ NaF, 1 мМ Na3V0₄. Тотальный лизат получали добавлением в чашки 0.1 мл лизирующего буфера, содержащего 50 мМ Трис-НСІ (рН 7.5), 150 мМ NaCI, 1 мМ Na₃V0₄, 1 мМ NaF, 1 мМ ЭДТА, 0.5 мМ PMSF, по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина, 10% глицерина, 1% Тритона Х-100. Клетки соскребали с чашек и инкубировали в течение 10 мин при +4 С. Клеточный лизат затем пропускали несколько раз через иглу 26G. Затем клеточный лизат центрифугировали 15 мин при ЮОООд. К супернатанту добавляли 1/4 часть буфера для электрофоретических проб (40 мМ Трис (рН 6.8), 10 % SDS, 20 % 2-меркаптоэтанола и 40 % глицерина) и инкубировали в течение 5 мин при 100 С. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976), используя овальбумин для построения калибровочной кривой.

3.4. Иммунопреципитация

Для иммунопреципитации клетки после стимуляции суспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Триса (рН 7.5), 50 мМ NaCI, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3V04, 1 мМ ЭГТА, 0.5 мМ PMSF, по 1

мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина, 1% нонидета Р-40 и инкубировали в течение 10 мин, после чего центрифугировали 15 мин при ЮОООд. Полученный лизат инкубировали с соответствующими антителами в течение 1 ч при 4С при постоянном перемешивании. Затем добавляли 20 мкл 50% протеин А-сефарозы и инкубировали пробы в течение 30 мин при 4С. Иммунные комплексы промывали трижды лизирующим буфером, после чего суспендировали в 2-х кратном буфере Лэммли. Белки преципитатов разделяли с помощью электрофореза и детектировали методом иммуноблоттинга.

3.5. Электрофорез и иммуноблоттинг

Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS в модификации Лэммли (Laemmli, 1970). Концентрирующий гель (рН 6,8) содержал 4 % полиакриламида, разделяющий (рН 8,8) - 8 %. Разделение белков проводили в блоках геля 90x60x1 мм при силе тока 30 мА на пластину в течение 2 ч.

Фосфорилирование рецептора ЭФР и его тирозинкиназная активность

После димеризации рецептора ЭФР происходит активация его ТК домена, который осуществляет автофосфорилирование рецепторных субъединиц по межмолекулярному механизму (Carpenter et al., 1978; Schlessinger, Ullrich, 1992), а также фосфорилирует различные сигнальные белки. ТК домен имеет высокую гомологию с аналогичным доменом тирозинкиназы c-Src (Downward et al., 1984). Наиболее важную роль для стимуляции ТК активности рецептора ЭФР играет лизин 721. Было показано, что при замене лизина 721 на фенилаланин наблюдалось полное нарушение ТК активности рецептора как in vitro, так и in vivo (Chen et al., 1987; Honneger et al., 1987). На концевом участке цитоплазматического домена рецептора ЭФР расположены пять сайтов ЭФР-зависимого автофосфорилирования по тирозину: три основных (Y1068, Y1148 и Y1173) и два минорных (Y992 и Y1086). Этот участок имеет молекулярный вес около 20 кДа и легко отщепляется под действием протеаз (Margolis et al., 1989). По-видимому, в результате автофосфорилирования рецептор приобретает особую конформацию, при которой облегчается его взаимодействие с внутриклеточными субстратами. В цитоплазматическом домене рецептора были обнаружены еще два функциональных участка. Один, состоящий из 164 АО (1022-1186), можно охарактеризовать как ингибиторный домен, поскольку его делеция приводит к увеличению ЭФР-зависимого фосфорилирования внутриклеточных субстратов рецептора ЭФР (рис. 1). Этот домен взаимодействует с ТК рецептора, маскируя при этом последовательность с 973 по 1022 АО, составляющих второй домен - "домен интернализации". Автофосфорилирование трех тирозинов на ингибиторном домене приводит к конформационным изменениям, при которых освобождается ТК домен и домен интернализации. Кроме того, в домене интернализации была обнаружена последовательность из 18 АО (973 - 991), необходимая как для интернализации, так и для увеличения концентрации цитозольного кальция.

Авторы назвали этот участок "Cain", подчеркивая его связь с регуляцией потоков кальция и интернализацией (Chen et al., 1989).Из внутриклеточных белковых мишеней, которые фосфорилирует протеинтирозинкиназа рецептора ЭФР, в настоящее время известны GAP (GTP-аза активирующий белок) - регулятор активности продукта протоонкогена c-ras, фосфолипаза Су1 (PLCyl), PI-3-K и некоторые другие (Boonstra et al., 1995). Как уже упоминалось выше, кроме автофосфорилирования по остаткам тирозина, рецептор ЭФР может фосфорилироваться другими протеинкиназами по остаткам треонина и серина. Например, треонин 654, локализованный в подмембранным участке, является сайтом » фосфорилирования РКС, что в конечном счете приводит к ингибированию собственной киназной активности рецептора и потере им способности связывать ЭФР (Davis, 1988). Всего сейчас известно семь сериновых остатков и один остаток треонина, по которым может фосфорилироваться рецептор ЭФР (Nesterov et al., 1994). Считается, что они регулируют протеинкиназную активность рецептора ЭФР. В подмембранной части рецептора ЭФР был идентифицирован сайт связывания актина (Boonstra et al., 1995). Возможно, взаимодействие с подмембранным актином помогает в отшнуровывании ранних эндосом от плазматической мембраны в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза (Lamazeetal., 1997). В проведении сигнала с рецепторов ростовых факторов участвует , множество разнообразных белков, организованных в сложные цепочки, каскады и даже сети. Сигнальные белки, непосредственно активируемые данной группой рецепторов, имеют специальные домены.

Среди них охарактеризованы SH2 и SH3, а также РН, РТВ и PDZ домены (Kuriyan, Kowburn, 1997), которые не имеют ферментативной активности, а опосредуют специфические белок-белковые взаимодействия. Эти домены обеспечивают одновременную активацию разных систем в одной точке, например, на рецепторе ЭФР. Практически все белки, непосредственно связывающиеся с рецептором ЭФР, содержат SH2 и SH3 домены, гомологичные второму и третьему домену белка Src, соответственно. SH2 домен, состоящий примерно из 100 АО, связывается с участками, содержащими фосфотирозин. Именно за счет этого домена сигнальные белки ассоциируют с определенными фосфотирозиновыми сайтами на активированном рецепторе ЭФР. Исключением является лишь белок She, который взаимодействует с рецептором через домен РТВ. Домен SH3 содержит 50-70 аминокислот и обладает сродством к участкам белка, богатым пролином. Этот домен опосредует взаимодействие различных сигнальных белков, хотя и не нужен для посадки последних на рецептор ЭФР. Некоторые из связывающихся с рецептором ЭФР белков практически полностью состоят из SH2 и SH3 доменов и являются адаптерами или регуляторными субъединицами специфических ферментов. К ним относятся Grb2, Nek, c-Crk и регуляторная субъединица Pl-З-К р85. Другие белки, помимо того, что содержат SH2 и SH3 домены, обладают еще и ферментативной активностью. В их число входят фосфолипаза Су1, белок-активатор СТРазной активности онкогена Ras (Ras-GAP), тирозинкиназа c-Src, тирозинфосфатаза SH-PTP2 и белок СЫ (убиквитин-лигаза рецептора ЭФР). Эти ферменты активируются после ассоциации с рецептором ЭФР. Позже других были открыты факторы семейства STAT - еще один класс белков, связывающихся с рецептори ЭФР. Они содержат SH2 и SH3 домены и, не являясь ферментами или адаптерными белками, инициируют транскрипцию ряда генов. Следует отметить, что в клетках разных типов с рецептором ЭФР связываются не все вышеперечисленные белки, а лишь некоторые из них. Физиологический эффект ЭФР как раз и определяется набором белков, связавшихся с рецептором в процессе его активации. Эти белки запускают различные сигнальные пути, основные из которых мы вкратце рассмотрим. Одним из белков-мишеней, непосредственно активируемых рецептором ЭФР, является фосфолипаза Су1 (PLCy1) (Singer et al., 1997).

Она обладает повышенным сродством к фосфорилированным тирозинам рецептора в положениях 992 и 1068. Связавшись с этими сайтами через свои SH2 домены, Р1_Су1 фосфорилируется тирозинкиназой рецептора, что приводит к активации ее ферментативной активности. Расщепляя фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат, PLCyi образует два вторичных мессенжера - инозитолтрифосфат, запускающий высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо, и диацилглицерол, активирующий Са2+ -зависимую РКС. Она, в свою очередь, фосфорилирует множество разнообразных белков, в том числе Na+/H+ обменник плазматической мембраны, ERK1.2 и рецептор ЭФР. Другой путь передачи сигнала с рецептора ЭФР в клетку заключается в активации PI-3-K (Fruman et al., 1998). РІ-З-К состоит из двух субъединиц: регуляторнои (р85) и каталитической (р110). р85 через свой SH2 домен взаимодействует с фосфорилированным рецептором ЭФР, что приводит к активации р110 с последующим фосфорилированием фосфатидилинозитолов по D-3 позиции. Это приводит к появлению целой группы вторичных посредников, оказывающих многостороннее воздействие на клетку. Например, эти посредники регулируют переход поздних эндосом в лизосомы в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза и активируют серин-треониновую киназу АКТ/РКВ, способствующую предотвращению апоптоза и выживанию клетки. Есть данные о важной роли РІ-З-К в реорганизации актинового цитоскелета, хотя не ясно, каким образом осуществляется это влияние. Предполагают, что РІ-3-К действуют на малые GTPa3bi, такие как Rac и члены ARF-семейства, через факторы обмена гуанозинин-нуклеотидов (GEFs) и белки, активирующие вТРазу (GAPs). Еще одним путем реализации действия ЭФР в клетке является активация каскада серии - треониновых протеинкиназ с участием продукта протоонкогена c-ras. Эта цепочка взаимодействий начинается с присоединения адапторного белка Grb2 через свой SH2 домен к фосфорилированному тирозину 1068 рецептора ЭФР (McCormick, 1993). Взаимодействие Grb2 с рецептором ЭФР может происходить также и

Роль АФК в активации рецептора ЭФР и факторов STAT

Как следует из предыдущей главы, для лучшего понимания механизма регуляции активности рецептора ЭФР и факторов STAT1 и STAT3, присходящей как в ответ на физиологический лиганд, так и лиганд-независимо, необходимо рассмотреть природу АФК и способы их образования в клетке. В следующем разделе мы затронем проблему биогенеза АФК, и более подробно остановимся на тех системах генерации АФК, которые играют важную роль в активации сигнальных путей от рецепторов ростовых факторов и цитокинов.

Активные формы кислорода (промежуточные продукты одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода) могут быстро вызывать окислительные повреждения липидов, ДНК, белков и боковых цепей ключевых аминокислот, что приводит к образованию связей между белками, нарушению структуры полипептидной цепи и фрагментации белка. Полагают, что это может приводить к дегенеративным процессам, которые лежат в основе старения, канцерогенеза и многих болезней, в частности, ишемии, болезни Паркинсона, атеро- и кардиосклероза (Janssen et al., 1993).

Однако в клетке постоянно синтезируются различные АФК как побочные продукты окислительно-восстановительных реакций. Уровень этих внутриклеточных АФК в норме очень низок благодаря тому, что в цитоплазме клетки существует восстановительный буфер, устраняющий опасные окислители и свободные радикалы. Основным компонентом этого буфера является глутатион - трипептид у-глутамилцистеинилглицин, содержащий в своем составе цистеин, имеющий сульфгидрильную группу, которая выступает в качестве донора электронов. Глутатион является основным внутриклеточным антиоксидантом. Благодаря активности глутатионпероксидазы осуществляются сопряженные процессы окисления глутатиона и переноса электронов с его сульфгидрильной группы на различные электрофильные соединения, к которым относятся и АФК. Помимо глутатиона в клетке также присутствуют такие антиоксиданты, как ферритин, которые хелатируют ионы переходных металлов, не позволяя им катализировать генерацию АФК.

Полное восстановление молекулы Ог происходит в митохондрях за счет осуществляемого цитохромоксидазой четырехэлектронного переноса. Однако в результате неполного восстановления Ог могут образовываться различные реакционноспособные соединения. При переносе одного электрона на Ог образуется супероксид анион (Ог "). который затем очень быстро превращается в НгОг. В присутствии ионов переходных металлов (Fe2+, Cu2+, Zn2+) НгОг по реакции Фентона превращается в более реакционноспособный гидроксил радикал (ОН). Для защиты от повреждающего действия этих АФК существуют такие ферменты, как супероксиддисмутаза (SOD) (восстанавливает Ог" до H2O2), каталаза и глутатионпероксидаза. Состояние клетки, при котором скорость генерации АФК превышает скорость их восстановления ферментативными системами, или истощается пул внутриклеточных антиоксидантов, характеризуют как окислительный стресс.

АФК могут генерироваться как ферментативными системами, так и без участия ферментов. Образование свободных радикалов может сопровождать практически любую реакцию, осуществляемую электрон-переносящим ферментативным комплексом. В физиологических условиях митохондрии являются основным источником АФК в клетке. Например, 1-2% Ог, потребляемого митохондриями, превращается не в НгО, а в различные АФК, в первую очередь в Ог". Из-за высокого уровня митохондриальной SOD внутриклеточная концентрация 02" поддерживается на очень низком уровне, и этот анион, скорее всего, не проникает в цитоплазму (в отличие от НгОг). В последние годы было обнаружено, что митохондриальные АФК играют важную роль в запуске апоптоза (Banki et al., 1999).

Другим источником АФК являются системы ферментов, связанные с мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭПР), в основном гладкого ЭПР. Наиболее хорошо изучена система цитохрома Р-450 и семейство ферментов Ьб. Они катализируют окисление ненасыщенных жирных кислот, жирорастворимых лекарственных веществ и токсинов, отнимая у них электроны, которые восстанавливают 02 до Ог" или H202 (Capdevila et al., 1981). Генерируемые таким образом АФК, вероятно, не участвуют в регуляции сигнальных путей, активируемых рецепторами ростовых факторов, а выполняют важную роль в процессе сворачивания белков и их секреции (Cantin et al., 1990).

Ядерная мембрана содержит цитохром-оксидазу и системы переноса электронов, подобные соответствующим системам ЭПР (Freeman et al., 1982). Биологические функции этих систем на данный момент четко не установлены. Возможно, генерируемые ими АФК регулируют ядерный транспорт или способствуют повреждениям ДНК (Halliwell et al., 1992).

Стимуляция клеток и приготовление тотальных клеточных лизатов

Стимуляцию клеток ЭФР (100 нг/мл) проводили в течение 10 мин в среде ДМЕМ при 37 С в атмосфере 5 % СОг. Ингибиторы киназ добавляли в культуральную среду за 1 ч до стимуляции, и клетки инкубировали при 37 С в атмосфере 5 % СОг. Окислительный стресс вызывали сменой культуральной среды на среду ДМЕМ, содержащую НгОг в разных концентрациях (от 0.1 до 5 мМ) с последующей инкубацией в течение определенного времени при 37 С в атмосфере 5 % С02. После окончания инкубации клетки помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при +4 С. Клетки промывали один раз холодным фосфатно-солевым буфером (PBS, 8 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCI, 1.5 мМ КН2Р04, 3 мМ KCI, рН 7.4) и два раза раствором PBS, содержащим 5 мМ NaF, 1 мМ Na3V04. Тотальный лизат получали добавлением в чашки 0.1 мл лизирующего буфера, содержащего 50 мМ Трис-НСІ (рН 7.5), 150 мМ NaCI, 1 мМ Na3V04, 1 мМ NaF, 1 мМ ЭДТА, 0.5 мМ PMSF, по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина, 10% глицерина, 1% Тритона Х-100. Клетки соскребали с чашек и инкубировали в течение 10 мин при +4 С. Клеточный лизат затем пропускали несколько раз через иглу 26G. Затем клеточный лизат центрифугировали 15 мин при ЮОООд. К супернатанту добавляли 1/4 часть буфера для электрофоретических проб (40 мМ Трис (рН 6.8), 10 % SDS, 20 % 2-меркаптоэтанола и 40 % глицерина) и инкубировали в течение 5 мин при 100 С. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976), используя овальбумин для построения калибровочной кривой. Для иммунопреципитации клетки после стимуляции суспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Триса (рН 7.5), 50 мМ NaCI, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3V04, 1 мМ ЭГТА, 0.5 мМ PMSF, по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина, 1% нонидета Р-40 и инкубировали в течение 10 мин, после чего центрифугировали 15 мин при ЮОООд.

Полученный лизат инкубировали с соответствующими антителами в течение 1 ч при 4С при постоянном перемешивании. Затем добавляли 20 мкл 50% протеин А-сефарозы и инкубировали пробы в течение 30 мин при 4С. Иммунные комплексы промывали трижды лизирующим буфером, после чего суспендировали в 2-х кратном буфере Лэммли. Белки преципитатов разделяли с помощью электрофореза и детектировали методом иммуноблоттинга. Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS в модификации Лэммли (Laemmli, 1970). Концентрирующий гель (рН 6,8) содержал 4 % полиакриламида, разделяющий (рН 8,8) - 8 %. Разделение белков проводили в блоках геля 90x60x1 мм при силе тока 30 мА на пластину в течение 2 ч. Разделённые в полиакриламидном геле белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). Электроперенос проводили при силе тока 0.8 мА на 1 см2 геля в течение 1 ч в буфере для полусухого переноса (48 мМ Трис, 39 мМ глицин, 0,037 % SDS, 3 % метанола). Для визуализации белковых полос использовали Ponceau S ( Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL Western blotting protocols (Amersham). Инкубацию с антителами против фосфорилированных по тирозину 701 STAT1 и по тирозину 705 STAT3 проводили при +4 С. Все остальные процедуры осуществляли при комнатной температуре. Мембрану промывали TTBS (20 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 150 мМ NaCI, 0,1 % Tween-20), после чего инкубировали последовательно в 5 % растворе сухого обезжиренного молока в TTBS в течение 1 ч и в растворе первичных антител в 1-3 % растворе BSA в TTBS в течение 1 ч, после чего промывали TTBS (3 раза по 5 мин). Далее мембрану помещали на 1 ч в раствор вторичных антител в 5 % растворе молока в TTBS, после чего промывали TTBS (3 раза по 5 мин). Белки, связавшиеся с антителами, выявляли с помощью метода усиленной хемилюминесценции (ECL).

Для этого нитроцеллюлозную мембрану промывали 5 раз по 5 мин в буфере TBS, затем один раз водой, после чего инкубировали в растворе ECL в течение 1 мин. Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую плёнку СЕА RP NEW (СЕА АВ, Швеция). Для удаления связавшихся с нитроцеллюлозной мембраной антител и повторной окраски ее другими антителами мембрану инкубировали в растворе, содержащем 60 мМ Трис-НСІ (рН 6.8), 2 % SDS и 100 мМ 2-меркаптоэтанола. Стрипинг проводили в течение 30 мин при 50 С. Для специфического выявления белков использовали моноклональные мышиные антитела против N-концевых участков STAT1 и STAT3 (Transduction Laboratories, США) в разведении 1:500, поликлональные кроличьи антитела против рецептора ЭФР (от д-ра Карпентера) в разведении 1:5000, моноклональные антитела против фосфотирозина (Cell Signaling Technology, США) в разведении 1:1000, и поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированных по тирозину STAT1 (Туг701) и STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, США) в разведении 1:1000. Антитела против рецептора ЭФР использовались также и для иммунопреципитации. В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США) в разведении 1:15000; козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой (GAM-HRP, Sigma, CIF) в разведении 1:40000. В работе использовали неорганические соли производства "Вектон" (Санкт-Петербург) и прочие реактивы фирмы Sigma (США). ЭФР выделяли из подчелюстных желёз самцов мыши по известной методике (Соркин и др., 1989).

Участие тирозинкиназ семейства Src в процессе активации рецептора ЭФР и факторов STAT1 и STAT3

Для изучения роли тирозинкиназ Src-семейства мы использовали ингибитор CGP77675, блокирующий активность всех киназ этого семейства. Хотя в соответствии с нашими данными рецептор ЭФР фосфорилируется в ответ на перекись водорода в клетках А431 и HER14, неясно, будет ли Н2О2 непосредственно активировать собственную киназу рецептора или модулировать сигнальные молекулы, которые, в свою очередь, трансактивируют рецептор. Такими сигнальными молекулами могут быть представители семейства Src-киназ, которые активируются под действием Н2О2 и затем включаются в передачу различных сигналов (Hardwick, Sefton, 1995; Abe et al., 1997; Aikawa et al., 1997; Wang et al., 2001). Кроме того, киназа c-Src может участвовать в трансактивации рецептора ЭФР как в ответ на Н2О2 (Chen et al., 2001) так и в результате действия других лигандов, таких как Ang II (Ushio-Fukai et al., 2001). Поэтому сначала изучали возможность участия киназ семейства Src в активации рецептора ЭФР. Для блокирования активности тирозинкииаз этого семейства (c-Src, c-Yes и c-Fyn), экспрессируемых в клетках А431 и HER14, мы использовали ингибитор CGP77675, подавляющий активность всех Src-киназ. Для этого мы обработкой клети CGP77675 в концентрации 1 мкМ в течение 1,5 часов непосредственно перед стимуляцией. Ингибирование киназ семейства Src в клетках А431 приводило к полному подавлению Н202-индуцированного фосфорилирования рецептора, тогда как ЭФР-зависимое фосфорилирование подавлялось лишь отчасти (рис 13).

В клетках HER14 картина была несколько иной. Ингибитор CGP77675 снижал ЭФР-зависимую активацию рецептора и оказывал лишь небольшой эффект на НгОг-индуцированную активацию (рис. 14). Это указывает на возможность участия киназ семейства Src в ЭФР-индуцируемой активации рецептора в клетках обоих типов. В клетках А431 Src-киназы вовлечены еще и в процесс трансактивации рецептора под действием Н2Ог. По данным литературы киназа c-Src опосредует ЭФР-зависимую активацию рецептора ЭФР (Biscardi et al., 1999) и факторов STAT (Olayioye et al., 1999). Учитывая эти факты, именно киназу c-Src мы рассматривали в качестве основного кандидата на участие в НгОг-опосредованной активации рецептора ЭФР и факторов STAT. Для исследования роли этой киназы мы использовали ингибитор радицикол, который обладает гораздо большей специфичночтью к киназе c-Src, чем к другим киназам Src-семейства. Как следует из данных на рис. 13, блокирование киназы c-Src не приводит к ингибированию Н2О2-индуцированного фосфорилирования рецептора ЭФР в клетках А431. Этот ингибитор не оказывал также никакого влияния и на активацию рецептора в ответ на ЭФР в клетках А431. Таким образом, учитывая эффект обоих типов ингибиторов, можно заключить, что лиганд-зависимое и лиганд-независимое фосфорилирование рецептора ЭФР в клетках эпидермоидной карциномы А431 осуществляется его собственной тирозинкиназой, в активации которой могут участвовать другие члены Src-семейства, а именно - киназы c-Yes и c-Fyn.

Для выяснения их роли необходимы дополнительные исследования. На следующем этапе мы исследовали роль тирозинкиназ семейства Src в активации факторов STAT1 и STAT3. Как следует из данных на рис. 15, в клетках HER14 ингибитор тирозинкиназ Src-семейства практически не оказывал никакого эффекта на НгОг-индуцированную активацию факторов STAT, что свидетельствует о неучастии киназ этого семейства в лиганд-независимой активации STAT в данной клеточной линии. Заметим, что обработка клеток HER14 ингибитором CGP77675 подавляла ЭФР-зависимую активацию STAT1 и STAT3, что вполне согласуется с результатами других исследователей, установивших важную роль тирозинкиназы Src в лиганд-зависимой активации факторов STAT, инициируемой в результатке активации рецептора ЗФР(ОІауіоуе et al., 1999). Поэтому в дальнейшем мы сконцентрировали усилия на выяснении роли киназ Src-семейства в лиганд-независимой активации STAT-белков в клетках А431. Интересно отметить, что уровень базального фосфорилирования STAT1 и STAT3 в клетках А431 практически не детектировался на иммуноблоте, (рис. 16) хотя, как известно, в клетках данной линии уровень активности киназ Src-семейства высок даже в отсутствие факторов роста. Предварительная обработка клеток А431 ингибитором CGP77675 полностью предотвращала последующее НгОг-индуцированное фосфорилирование факторов STAT1 и STAT3, что свидетельствует об участии киназ семейства Src в данном процессе. Далее нам представлялось логичным показать вовлеченность одного из членов этого семейства - киназы Src - в активацию транскрипционных факторов STAT при действии Н2О2. Зависимость НгОг-опосредованной активации STAT-белков от тирозинкиназы c-Src была продемонстрирована нами на фибробластах линии PURO, нокаутированных по гену c-src. В качестве контроля к ним брали те же клетки, но с обратной трансфекцией гена c-src (Wild Туре). В клетках обеих линий Н202 в концентрациях 0,1-5 мМ вызывала зависимое от концентрации фосфорилирование STAT1 и STAT3 (рис. 17), причем уровень фосфорилирования STAT3 в клетках PURO был гораздо ниже, чем в клетках WT. Это свидетельствует о возможности участия киназы c-Src в процессе активации STAT3 в фибробластах. Отметим, что отсутствие c-Src не приводит к полному подавлению Н202-зависимой

Похожие диссертации на Активация транскрипционных факторов STAT, индуцированная активными формами кислорода

Активные формы кислорода и их источники в программированной гибели клеток растений и цианобактерии Anabaena variabilisШестак, Анна Александровна

Снижение уровня митохондриальных активных форм кислорода приводит к фенотипической нормализации клеток карциномы шейки матки человекаШагиева, Галина Сергеевна

Активация сигнального каскада Jak-Stat под действием секретируемого нишей стволовых клеток сигнального фактора определяет статус стволовых клеток в семенниках DrosophilaТулина Наталья Михайловна

Активные формы кислорода и антиокислительные системы во взаимодействии фитопатогенного гриба и высшего растенияАверьянов, Андрей Александрович

Влияние активных форм кислорода на структурно-функциональное состояние мембран мышечных клеток и их антиоксидантная защитаДятлов, Роман Викторович

Активные формы кислорода и антиоксидантные ферменты на начальных стадиях взаимодействия гороха с клубеньковыми бактериями (Rhizobium leguminosarum) Васильева Галина Геннадьевна

Роль цитоскелета в механизмах действия активных форм кислорода на сократительные свойств гладких мышцМельник Оксана Сергеевна

Взаимодействие цитохрома C и активных форм кислорода Переверзев Михаил Олегович

Регуляторные функции активных форм кислорода в модельных водных системах и в кровиВоейков Владимир Леонидович

Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуолаНауменко Екатерина Анатольевна