Содержание к диссертации
Введение
I. Аналитический обзор литературы. роль активного кислорода в осуществлении процессов жизнедеятельности . 18
I. 1. Активные формы кислорода - переоценка традиционных представлений 18
I. 2. Парадоксы кислородного дыхания. 19
I. 3. Свойства молекулы кислорода и продуктов его превращения в связи с их биологическим действием . 21
I. 3.1. Уникальные физические и химические особенности молекулы кислорода, обеспечивающие его особые энергетические свойства и химическую активность. 21
1.3.2. Токсичность кислорода: предпосылки доминирующих представлений. 24
1.4. Участие АФК в биохимических и физиологических процессах в норме. 26
I. 4.1. Целенаправленная продукция АФК живыми клетками. 26
I. 4.2. Участие АФК в информационных процессах на клеточном и субклеточном уровнях. 28
I. 4.3. Реакции человека и животных на поступление АФК из внешней среды. 35
1.4.4. Превращения активных форм кислорода в живых системах. 38
I. 5. Проблема механизма регуляторного действия АФК. 41
1.5.1. Существующие гипотезы о механизме действия АФК. 41
1.5.2. Энергетические особенности процессов с участием АФК. 43
I. 5. 3. Проблема диссипации и миграции энергии электронного возбуждения в биологических системах. 46
I. 5 .4. Регуляторная роль энергии электронного возбуждения в биологических системах. 49
I. 5 .5. Возможные механизмы усиления действия низкоинтенсивных энергетических факторов на биологические системы. 54
I. 6. Заключение: регуляторное действие АФК в живых системах может быть связано с энергетическими особенностями реакций с их участием. 59
II. Результаты собственных исследований 62
И. 2. Свойства процессов в цельной неразведеннои крови человека, сопровождающихся генерацией электронно-возбужденных состояний . 62
II. 2.1. Сверх-слабое излучение крови и ее компонентов 62
II. 2. 2. Основные методы и материалы . 63
ІІ.2. 3. Хемилюминесценция цельной неразведеннои крови здоровых доноров: зависимость от кислорода. 65
П.2.4. Регуляция окислительно-восстановительных процессов в крови ее собственным излучением.. 72
И.2. 5. Температурный гистерезис хемилюминесценции крови. 79
ІІ.2. 6. Колебательный характер излучения крови и суспензий нейтрофилов. 81
11.2.7. Изменение хемилюминесценции неразведеннои крови у больных ишемической болезнью сердца в ходе лазеротерапии. 84
II.2. 8. Хемилюминесцентный анализ крови выявляет ее свойства как з
метаболически активной кооперативной системы. 87
II.2. 9. Заключение по разделу. 94
II. 3. Регистрация нелинейных динамических процессов в крови человека с использованием роэ-графии - нового метода изучения тонкой динамики процесса оседания эритроцитов . 96
П. 3.1. Биологическое и диагностическое значение СОЭ (РОЭ). 96
II. 3.2. Теории оседания эритроцитов. 97
П. 3.3. Фазовая модель оседания форменных элементов в красной крови. 98
П. 3.4. Предпосылки для создания нового диагностического теста - РОЭ-графии. 101
II. 3.5. РОЭ-граф - прибор для регистрации динамики оседания эритроцитов. 103
II. 3.6. Материалы и методы исследования. 105
И. 3.7. Нелинейная динамика оседания крови здоровых и больных доноров. 107
II. 3.8 Сравнение люминесцентных свойств крови и ее поведением, анализируемым методом РОЭ-графии . 118
П. 3.9. РОЭ-графия и метаболические процессы, протекающие в цельной крови. 123
И. 3.10. Применение метода РОЭ-графии в практике. 128
И. 3.10.1. Исследование влияния лекарственных препаратов на оседание крови in vivo и in vitro. 128
II. 3.10.2. Влияние геомагнитной активности на динамику седиментации красной крови. 132
II. 3.10.3. Применение принципа РОЭ-графии в тесте по выявлению «пищевой аллергии замедленного типа». 137
П. 4. Инициированное перекисью водорода или слабым уф-облучением медленное окисление аминокислот в водных растворах . 143
И. 4.1. Введение. 143
II. 4. 2. Основные методы и материалы 144
II. 4. 3. Медленное окисление аминокислот в растворах, содержащих перекись водорода. 147
И. 4. 4. Макрокинетические закономерности медленных окислительных процессов в растворах аминокислот, сопровождающихся излучением. 149
И. 4. 5. Критические (предельные) явления при развитии хемилюминесценции.. 154
II. 4.6. Температурный гистерезис при развитии реакции, инициируемой перекисью в растворах аминокислот 156
П. 4.7. Оксилительное дезаминирование и образование полимерной субстанции с активностью глицин-дезаминазы при УФ-облучении растворов аминокислот. 159
П. 4.7.1. Хемилюминесценция, сопровождающая окислительное дезаминирование в растворах аминокислот, облученных слабыми источниками УФ-фотонов.. 160
II. 4.7.2. Образование полимерной субстанции с активностью глицин-дезаминазы при УФ-облучении растворов аминокислот. 162
II. 4.8. Возможные источники энергии для возникновения излучения при медленном окислении аминокислот в водных растворах. 166
П. 4. 8. 1. Возникновение и рекомбинация свободных радикалов в жидкофазных системах. 166
II. 4. 8. 2. Возможная роль воды и водного окружения в возникновении и стабилизации ЭВС. 170
П. 4. 8. 3. Теоретические предпосылки для одновременного протекания в водном растворе аминокислоты ее окисления и синтеза полимерного продукта. 172
II. 4.9. Признаки разветвленного-цепного механизма инициированной реакции окислительного дезаминирования аминокислот в водном растворе. 174
II. 5. Процессы с участием активных форм кислорода в ходе развития амино-карбонильных реакций в водных растворах .. 176
П. 5.1. Введение. 176
И. 5.1.1. Химизм амино-карбонильной реакции в связи с генерацией активных форм кислорода. 176
II. 5.1.2. Люминесценция, сопровождающая амино-карбонильную реакцию. 179
И. 5.2. Основные материалы и методы. 181
II. 5.3. Макрокинетические закономерности хемилюминесценции, сопровождающей развитие АКР при комнатной температуре. 182
II. 5. 4. Колебательный характер амино-карбонильной реакции . 187
П. 5 .4. 1. Возникновение и характер колебательных процессов при амино-карбонильной реакции 187
И.5.4.2. Роль кислорода в развитии хемилюминесценции и возникновении колебательных режимов 190
П.5.5. Критические (предельные) явления при развитии хемилюминесцентной амино-карбонильной реакции. 194
П.5.6. Влияние ионов переходных металлов и антиоксидантов на макрокинетические параметры амино-карбонильной реакции. 197
И.5.7. Колебания окислительно-восстановительного потенциала в реакционной системе. 200
И.5.8. Влияние на хемилюминесценцию в реакционных системах слабых и сверх-слабых источников света и электромагнитных полей. 202
П.5.9. Возможные причины возникновения колебательного режима излучения при развитии амино-карбонильной реакции. 205
II.5.10. Участие электронно-возбужденных состояний в развитии колебательных процессов. 206
II.5.11. Реакции с участием АФК в водных системах, сопровождающихся генерацией ЭВС, как модели протекающих в биологических системах процессов. 209
Заключение 211
Выводы 226
Список цитированной литературы 229
- Свойства молекулы кислорода и продуктов его превращения в связи с их биологическим действием
- Основные методы и материалы
- Сравнение люминесцентных свойств крови и ее поведением, анализируемым методом РОЭ-графии
- Колебательный характер амино-карбонильной реакции
Свойства молекулы кислорода и продуктов его превращения в связи с их биологическим действием
Общепринято, что аэробный энергетический метаболизм основан на процессе окислительного фосфорилирования, при котором энергия окислительно-восстановительных реакций на пути транспорта электронов по цепи дыхательных ферментов превращается в макроэргические связи АТФ. Ог здесь выступает в роли конечного акцептора электронов для цитохром-с оксидазы - терминального компонента ми-тохондриального ферментативного комплекса, который катализирует 4-х-электронное восстановление Ог до воды. Однако выясняется, что лишь этот механизм кислородного дыхания не может полностью объяснить всего многообразия протекающих в нормально функционирующем организме окислительных процессов с участием кислорода.
До последнего времени считалось, что путь одноэлектронного восстановления молекулы кислорода, на котором и образуются так называемые активные формы кислорода (АФК), не может играть какой-либо функционально значимой роли, кроме антибиотической защитной функции при дыхательном взрыве у фагоцитов. Сложилось представление, что в норме вклад одноэлектронного восстановления кислорода в общий объем окислительных процессов пренебрежимо мал, а увеличение его интенсивности - это патология, "окислительный стресс". Последний вывод делают на основании данных о том, что если главным источником АФК в клетке считать "утечку" электронов с дыхательной цепи митохондрий [Chance, et al., 1979], то в препаратах изолированных митохондрий, действительно, всего лишь 1-2% общего электронного потока идет на одноэлектронное восстановление кислорода [Boveris, Chance, 1973]. А по оценкам, полученным на модели разрушенных клеток кишечной палочки, лишь 0,1% потребляемого кислорода восстанавливается до супероксид-анион радикала [Imlay, Fri-dovich, 1991]. Но если обратиться к тому, как используют кислород не фрагменты разрушенной живой системы, а целостные объекты, то открывается совсем другая картина. У некоторых растений при полном подавлении митохондриального дыхания потребление Ог снижается лишь на 5-30% [Лукьянова и др., 1982]. Количество перекиси водорода, образующейся в печени in situ (т. е. при сохранении ее связей с кровеносной и нервной системами организма) в 2 раза выше скорости ее образования изолированными субклеточными фракциями. Минимально поврежденные органы и ткани используют в относительном покое до 10-15% потребляемого организмом кислорода для производства его активных форм [Oshino et al., 1975; Shoaf et al., 1991]. Если же у животного искусственно стимулировать НАДФ-Н-оксидазы - ферменты, катализирующие одноэлек-тронное восстановление кислорода, то объем потребляемого кислорода быстро возрастает еще на 20% [Vlessis et al., 1995]. Естественно, такой уровень одноэлектронного восстановления кислорода ненормален, но он отражает потенциальные возможности генерации АФК у животного. Таким образом, с нарушением целостности биологического объекта все меньшая доля кислорода идет на образование АФК и, по-видимому, оценки интенсивности их образования в препаратах изолированных клеток или субклеточных фракций существенно занижены по сравнению с положением in vivo.
Известно, что нарушение кислородного дыхания особенно критично для человека. Всего несколько минут без кислорода приводят к необратимому повреждению его мозга, который составляет лишь 2% от массы тела, а потребляет около 20% получаемого организмом кислорода. Но содержание митохондрий в нервной ткани не больше, если не меньше, чем в других энергозависимых тканях [David, 1977]. Следовательно, должен существовать и другой путь утилизации Ог, который, например, в нервной ткани может быть выражен не в меньшей степени, чем классический путь окислительного фосфори-лирования.
Одна из основных функций крови - это перенос кислорода к периферическим органам и тканям. А как осуществляется дыхание в самой крови, в которой, хотя на это редко обращают внимание, также протекают аэробные процессы? Выясняется, что довольно активные эндогенные для крови потребители кислорода, такие как тромбоциты и гранулоциты (нейтрофилы и эозинофилы) очень бедны митохондриями. Гранулоциты составляют основную массу лейкоцитов крови и выполняют, особенно при активации, большой объем химической и механической работы, для чего требуются значительные затраты энергии. То, что потребление кислорода при активации этих клеток специфичными и неспецифичными факторами увеличивается в десятки раз, и практически весь он восстанавливается немитохондриальными оксидазами, известно давно [Curnutte, 1987]. Недавно, однако, было показано, что и в покое эти клетки утилизируют кислород не за счет митохондриального дыхания: митохондрии, например, эозинофилов не участвуют в их дыхании, а обеспечивают регуляцию их апоптоза [Peachman, et al., 2001]. Одновременно было показано, что цианид - ингибитор митохондриальной цитохром-с-оксидазы не блокирует дыхания и у покоящихся нейтрофилов, а также не полностью устраняет потребление кислорода даже богатыми функционально активными митохондриями моноцитов. Недавно выяснилось, что в крови есть еще один мощный источник АФК: все, присутствующие в плазме крови иммуноглобулины могут катализировать прямое окисление синглетным кислородом воды до перекиси водорода [Wentworth, et al., 2000] и способны даже продуцировать озон [Wentworth, et al., 2002].
Немитохондриальное потребление кислорода может играть существенную роль в обеспечении жизненно важных потребностей только что оплодотворенных и дробящихся яйцеклеток. Оказалось, что на стадии дробления яйцеклеток мыши лишь 30% потребляемого ими кислорода идет на обеспечение окислительного фосфорилирования, а 70% восстанавливается немитохондриальными оксидазами. И лишь на стадии бла-стоцисты митохондриальное потребление кислорода достигает 70% от общего, хотя абсолютный уровень немитохондриального дыхания при этом не снижается [Trimarchi, et al., 2000].
Итак, в живых организмах и в покое, и тем более при возбуждении на производство АФК направляется существенная доля потребляемого кислорода. Отсюда следует, что одноэлектронный путь восстановления кислорода и возникающие на этом пути АФК должны выполнять очень важные функции в процессах жизнедеятельности. Чтобы приблизиться к пониманию того, как могут реализоваться эти функции, необходимо более подробно рассмотреть особые свойства молекулы кислорода и продуктов его од-ноэлектронного восстановления.
Основные методы и материалы
Большинство из тех АФК, что представлены свободными радикалами - очень ко-роткоживущие частицы. Так, Ог"-» в водной среде, особенно в слабокислых условиях быстро (константа скорости 5x105 M"V при рН 7,0) дисмутируют (рекомбинируют) до Н2О2 с освобождением молекулы кислорода в синглетном возбужденном состоянии:
202 « + 2Н+ -» Н202 + 02 В конце 1960 гг. было открыто семейство ферментов - супероксиддисмутаз (СОД), которые ускоряют эту реакцию в тысячи раз [McCord, Fridovich, 1969]. Чрезвычайно широкая распространенность СОД, многообразие ее форм, отличающихся и по структуре апофермента и по иону металла в активном центре (Mn, Zn или Fe) [Fridovich, 1974] послужили серьезным указанием на то, что АФК образуются в живых системах не от случая к случаю, а регулярно. Собственно, с открытия СОД началась систематическая работа по изучению роли АФК в процессах жизнедеятельности. Как уже отмечалось выше, задолго до открытия СОД АФК бьши признаны чрезвычайно опасными частицами, повреждающими макромолекулы и клеточные структуры [Наг-man, 1956]. Поэтому с самого начала СОД стали рассматривать, как возникший в ходе эволюции главный инструмент защиты организма против «окислительного стресса», определяемого как разрушительные явления, сопутствующие кислородному дыханию за счет неизбежного побочного образования АФК [Fridovich, 1999]. Согласно этой точке зрения, «...кислород и его активные формы стали угрозой для всех организмов более 2 миллиардов лет назад», и что «...как прокариоты, так и эукариотические организмы в ответ на изменение внутриклеточного уровня АФК изменили свою генетическую программу для борьбы с ними» [Baeuerle et al., 1996]. Токсичность кислорода, точнее АФК, подтверждается казалось бы фактом увеличения среднего и максимального срока жизни трансгенных дрозофил, которым в геном вводили дополнительные копии СОД и ка-талазы [Orr, Sohal, 1994].
Правда, далеко не все факты согласуются с этой популярной точкой зрения. Например, гены, кодирующие СОД, есть даже у строго облигатно анаэробных микроорганизмов, в частности, архебактерий, обитающих в среде, в которой свободный кислород практически полностью отсутствует [напр., Hatchikian et al., 1977; Takao et al., 1991]. СОД, вводимая в раствор для перфузии изолированного сердца при его реоксигенации после ишемии, защищает его от окислительного стресса лишь в низких дозах. В высоких концентрациях СОД даже усиливает повреждение [Nelson, et al., 1994]. Избыточная экспрессия СОД, например, в клетках Е. coli не защищает, а, напротив, снижает их резистентность к гамма-излучению [Scott et al., 1989], а у трансгенных мышей при гиперэкспрессии Cu,Zn-COfl развивается синдром, подобный синдрому Дауна у человека [Chan, et al., 1995]. Это согласуется с тем, что у людей с этим синдромом 21-я хромосома, содержащая ген Си,Еп-СОД, представлена в 3-х копиях. Т.е. больные с синдромом Дауна исходно имеют более мощную антиоксидантную защиту, чем здоровые.
Обоснование исключительно «защитной» функций СОД основано на том, что в отличие от реакции спонтанной дисмутации Ог-», где образуется синглетный кислород, способный инициировать неконтролируемые окислительные процессы, в катализируемой СОД реакции дисмутации продуктом является триплетный кислород. Кроме того, СОД - чрезвычайно активный фермент: число ее оборотов (kcat) — одно из самых высоких для ферментов - порядка 106 с", а константа скорости (kcat /Km) 108 M V1 [Walsh, 1979], следовательно, она должна практически немедленно устранять образующийся Ог— до ничтожно низкого стационарного уровня. Действительно, стационарный уровень Ог- в клетках и тканях несмотря на наличие многих и достаточно интенсивных источников его генерации, чрезвычайно низок, по ряду имеющихся оценок -порядка 10"10 -10"11 М [Niviere, Fontecave, 1995; Imlay, Fridovich, 1991].
Вторым продуктом реакции дисмутации является Н2О2, которая также относится к АФК, причем, как часто подчеркивается в литературе посвященной патогенетическим свойствам АФК, в присутствии, например, ионов железа при разложении Н2О2 в ходе реакции типа Фентона появляются гидроксил-радикалы, гораздо более активные, чем 02 » [Koppenol, 1993]: Н202 + е- (металлп+) НО» + OFT" + металлп+1
При восстановлении органического гидропероксида, ROOH, появляются алкок-сильные радикалы, RO». В выделенных мембранных препаратах клеток и в условиях, когда в систему вносят соли переходных металлов и пероксиды или агенты, их генерирующие в достаточно больших (субмиллимолярных и миллимолярных) концентрациях, гидроксил- и алкоксил-радикалы инициируют цепные реакции перекисного окисления липидов, повреждают макромолекулы в их растворах. Поэтому в обширной литературе, посвященной негативным последствиям возникновения АФК в биологических системах, указывают именно на НО», как на главный патогенный фактор [см. напр., Marx, van Asbeck 1996]. Однако на пути неконтролируемого расщепления перекиси водорода стоит каталаза, которая с громадной скоростью (число оборотов более 107 с"1, константа скорости 4х107 M V1 [Walsh, 1979]) превращает Н2О2 в кислород и воду. Поэтому даже в пероксисомах, где перекись водорода непрерывно продуцируется в ходе ферментативных реакций, стационарный уровень Н2О2 не превышает 100 нМ, в в цитоплазме он оценивается в диапазоне 10"7 - 10"9 М [Oshino et al., 1973; Tyler, 1975]. Еще один широко распространенный фермент, который устраняет Н2О2 глутатионпероксидаза [напр., Liu et al., 1993], катализирующая реакцию окисления восстановленного глутатиона пе-роксидами, превращая последние в спирты (или воду в случае Н2О2).
Несмотря на то, что в биомедицинской литературе о металл-зависимой генерации НО» говорится, как об общепризнанном факте, все чаще высказываются сомнения в том, что этот процесс может играть хоть какую-то роль в действии АФК in vivo [Halli-well, Gutteridge, 1992; Sayer et al., 1996]. Недавно были опубликованы убедительная работа, результаты которой исключают возможность протекания в биологических системах реакций типа Фентона. Было показано, что в фосфатном и бикарбонатном буферах при их концентрациях в диапазонах, характерных для внеклеточного матрикса и цитоплазмы, происходит очень быстрое полное хелатирование Fe2+ главного кандидата на роль неспецифического катализатора разложения Н2О2 Поэтому при тех стационарных уровнях перекиси, что могут быть теоретически достигнуты во внутренней среде организма, железо не может катализировать ее распад с образованием НО [Saran et al., 2000]. В то же время хелатированное фосфатными и карбонатными ионами железо катализирует гидроксилирование (донор гидроксильного остатка пока неизвестен) целого ряда субстратов, в частности, терефталевой кислоты, и такое гидроксилирование осуществляется значительно специфичнее, чем свободным НО». Между прочим, гидроксилирование терефталевой кислоты в системах in vitro часто считали доказательством появления в них НО».
Сравнение люминесцентных свойств крови и ее поведением, анализируемым методом РОЭ-графии
Если в крови непрерывно протекают процессы, сопровождающиеся генерацией ЭВС, изучательный и безызлучательный перенос внутри крови энергии электронного возбуждения, эквивалентной энергии световых фотонов, может в принципе служить одним из факторов, способствующих корреляции метаболических процессов крови. Прямая регистрация такого переноса энергии внутри самой крови и выяснение его функциональной значимости сопряжена с техническими трудностями. Однако мы разработали экспериментальные подходы, позволяющие оценить влияние энергии электронного возбуждения на метаболические процессы, протекающие в крови.
Прямое указание на то, что фотонная эмиссия, сопровождающая реакции с участием АФК, играет важную роль в регуляции метаболических процессов в крови, было получено при изучении влияния отраженного обратно в кровь фотонного потока из крови на интенсивность протекающих в ней метаболических процессов (Рис. 2.9). Если излучаемый кровью фотонный поток возвращается обратно в кровь, то интенсивность и кинетика усиленного люминолом или люцигенином излучения из крови до и после инициации в ней ОВ зимозаном могут существенно меняться. Пробирку с кровью, к которой добавляли люцигенин или люминол вместе с зимозаном, помещали в отражающий экран из алюминиевой фольги. Через некоторое время экран снимали и сравнивали интенсивность излучения этой крови и той же крови из неэкранированного пробы. После удаления экрана кинетика дальнейшего развития излучения в подавляющем большинстве случаев отличалась от таковой в контрольных пробах, однако знак изменения зависел от того, насколько интенсивным бьшо излучение в данном образце крови. Так, экранирование фольгой образца крови с относительно низкой ЛЦЛ приводило к усилению интенсивности ЛЦЛ относительно контроля (Рис. 2.9А). Если же ЛЦЛ крови достигала высоких значений, то возвращение потока фотонов в кровь приводило к снижению ее излучательной активности по отношению к контролю (Рис. 2.9Б).
Гистохимический анализ активности нейтрофилов (НСТ-тест) подтвердил, что отражение и возвращение в кровь ее излучения влияет на их активность. На Рис. 2.9.В представлены результаты типичного эксперимента, в котором в крови индуцировали ОВ зимозаном и регистрировали ЛЦЛ, причем в данном образце крови ЛЦЛ в экранированном образце после снятия фольги бьша существенно выше, чем в контрольном без отражающего экрана. Можно видеть, что как в опыте, так и в контроле после инициации ОВ число активных нейтрофилов существенно повышается, но общее количество активных клеток в экранированном образце гораздо выше, чем в контрольном (39% относительно 30%). Особенно существенно, что число клеток, принадлежащих к высоким рангам (более 50% заполнения цитоплазмы диформазаном) в экранированном образце вдвое выше, чем в контроле (ср.столбики №№ 5 и 6 в 1, контр.и 1, эксп.). Таким образом НСТ-тест дал независимое подтверждение влияния усиления интенсивности фотонного поля в образце за счет отражения фотонного потока в кровь на развитие в крови окислительных процессов, приводящих к продукции АФК и генерации электронно-возбужденных состояний.
Данная экспериментальная методика не позволяла, однако, наблюдать за ходом развития процесса во время экранирования. Поэтому мы разработали дополнительный метод, позволяющий возвращать в образец лишь часть излученных фотонов, тогда как основной поток мог непрерывно регистрироваться ФЭУ. Для этого пробирку с кровью помещали в стеклянный флакон для сцинтилляционного счета, который был либо пуст (заполнен воздухом), либо заполнен водой (Рис. 2.10.А) . В первом случае кровь подвергалась самооблучению фотонами, которые частично отражались внутренней поверхностью стеклянного флакона, во втором самооблучение практически отсутствовало за счет иммерсионного эффекта, обусловленного близкими значениями показателя преломления воды и стекла. Интенсивность отраженного потока фотонов в заполненном воздухом флаконе составляла 15-20% от общего потока фотонов.
Из Рис. 2..10Б и В, отражающего ход ЛМЛ во время инициированного в крови зимозаном ОВ, видно, что сразу после переноса пробирки с кровью из заполненного воздухом флакона, во флакон, заполненный водой и обратно интенсивность регистрируемого ФЭУ излучения крови меняется. В заполненном водой флаконе она выше, чем в заполненном воздухом. Однако на стадии, близкой к максимуму развития ОВ, после нескольких минут пребывания во флаконе без отражения стационарный уровень ЛМЛ при переносе обратно во флакон с воздухом увеличивается относительно того, каким его следовало ожидать, если бы он оставался во флаконе с воздухом. Такой же эффект наблюдается и при последующем переносе пробирки с кровью обратно во флакон с водой. Т.е. на этой стадии любое резкое изменение режима самооблучения крови ускоряет достижение максимума развития ОВ (Рис. 2.1 ОБ). На следующей стадии - стадии затухания ЛМЛ наличие или отсутствие самооблучения крови противоположным образом влияет на ход изменения интенсивности ЛМЛ. При возвращении части потока фотонов в кровь интенсивность ЛМЛ возрастает, а при прекращении самооблучения наблюдается затухание ЛМЛ. Этот эффект повторяется в течение достаточно длительного периода времени (Рис. 2.. 10 В).
Влияние самооблучения крови на процессы, приводящие к генерации АФК и сопровождающиеся излучением из нее, наблюдались и в отсутствие индуцированного специфическими агентами ОВ, в частности на ЛЦЛ, которая развивается в неразведенной крови спонтанно. Из представленных на Рис. 2.11 данных видно, что самооблучение крови сказывается на характере изменения ЛЦЛ на самой ранней стадии ее развития, на этапе близком к максимуму интенсивности ЛЦЛ и на этапе ее спада. Наименее чувствительной к самооблучению является стадия интенсивного развития ЛЦЛ. На 77
блюдавшиеся в экспериментах этого типа закономерности близки к тем, что были продемонстрированы при полном экранировании образцов с кровью (см. вставку на Рис. 2.11), а также в экспериментах по влиянию самооблучения на стадию затухания QB при детекции ЛМЛ (ср. Рис. 2.10), где при наличии самооблучения также наблюдалось временное разгорание излучения.
Второй из использованных нами подходов заключался в выяснении возможности влияния одного образца крови на другой за счет лишь оптического за счет лишь оптического контакта между ними (Voeikov, Novikov, 1996, 1997).
Для выяснения возможности влияния одного образца крови на другой кровь, разведенную в 10 раз физиологическим раствором, заливали в пластиковый флакон для сцинтилляционного счета. В него помещали кварцевую кювету либо с той же неразве-денной кровью, либо с неразведенной кровью другого донора, либо с физраствором, либо с черной тушью (Рис. 2.12А). К крови, находящейся во флаконе, добавляли люми-нол и инициировали в ней ОВ либо зимозаном, либо форболмиристатацетатом (ФМА -- активатор протеинкиназы С, участвующей в стимуляции ОВ нейтрофилов).
Колебательный характер амино-карбонильной реакции
Результаты исследования динамического состояния крови с использованием нового метода - РОЭ-графии - позволили, во-первых, вновь обратить внимание на кровь как на сложную коллоидную систему, обладающую особыми физико-химическими свойствами. Во-вторых, они свидетельствуют, что поведение крови при оседании определяется протекающими в ней метаболическими процессами, которые должны в существенной мере зависеть от процессов энергетического обмена. На это, в первую очередь указывает корреляция между динамикой ЛЦЛ крови и седиментационное поведение той же крови в максимально сходных условиях (рис. 3.16). Поскольку ЛЦЛ отражает интенсивность продукции в крови АФК, наличие такой корреляции говорит, что «механические» свойства крови, которые отражает характер оседания форменных элементов крови зависит от энергетического потенциала крови и эффективности его использования.
Об этом же говорит и влияние внесения в кровь экзогенной АФК, перекиси водорода, и на седиментационные, и на люминесцентные ее свойства. Действие Н2О2, на первый взгляд, парадоксально. Известно, что кровь обладает высокой каталазной активностью [Goth, 1991; Masuoka, et al., 1996], в связи с чем перекись должна сразу разложиться до кислорода и воды. Количество освободившегося кислорода при этом не превышает нескольких процентов от присутствующего в эритроцитах. Поэтому трудно ожидать, что эффект перекиси обусловлен дополнительной оксигенацией крови, тем более, что он выявляется не ранее, чем через час после воздействия. Эффект добавления перекиси на ЛЦЛ крови пациентов сходен с эффектом снижения интенсивности ЛЦЛ в крови с исходно высоким ее уровнем при самооблучении крови (см. рис. 2.9) и, вероятно, объясняется сходными причинами. При разложении каталазой перекиси освобождаются порции энергии по 2 эВ на каждый реакционный акт. Весьма вероятно, что эта энергия высокой плотности оказывает в конечном итоге стабилизирующее действие на протекающие в крови процессы с участием АФК. С этим предположением согласуется вариабельность эффекта перекиси на кровь различных индивидуумов. На рис. 3.18 и 3.19. представлены типичные данные, которые были получены на крови пациентов, страдающих теми или иными хроническими заболеваниями. Если же физраствор с перекисью добавляли к свежевыделенной крови практически здоровых доноров, то заметного влияния ни на седиментационные, ни на люминесцентные характеристики это не оказывало.
Полученные нами данные о влиянии перекиси на седиментационные и люминесцентные характеристики крови согласуются с данными А.Л. Чижевского и ряда других авторов о нормализующем действии активного кислорода на кровь и ее компоненты. Чижевский [1980] установил, что инкубация крови больных с широким спектром хронических заболеваний в атмосфере с повышенным содержанием отрицательно заряженных аэроионов (гидратированных супероксидных радикалов) оказывает влияние на РОЭ. В случае повышенных значений СОЭ наблюдается снижение его часового значения на 3-7 мм/час, а при аномально низких значениях СОЭ при некоторых видах патологий наблюдается повышение его значения. В результате параметры СОЭ приближаются к норме. Недавно появилось сообщение о том, что при облучении суспензии моноцитов излучением, сопровождающим переход кислорода из синглетного в триплет-ное состояние (по выражению авторов, «энергией синглетного кислорода») индуцированная форболовым эфиром интенсивность генерации ими АФК снижается на 60% [Hulten et al., 1999]. Сходная направленность эффектов, полученных при таких различных воздействиях на кровь или клетки крови, продуцирующие АФК, которые объединяет лишь то, что во всех случаях действующим фактором являются АФК или энергия, освобождаемая в реакциях с участием АФК, показывает, что экзогенные АФК в низких дозах способствуют нормализации кислород-зависимых процессов, протекающих в крови.
По нашему мнению, выявленная нами парадоксальная зависимость начальной скорости оседания красной крови от высоты столбика крови (рис. 3.15) также отражает зависимость «макроскопического» поведения крови от протекающих в ней метаболических процессов. Эти процессы, естественно, существенно зависят от доступности кислорода, который в цельной крови практически полностью ассоциирован с гемоглобином эритроцитов, и содержание его в плазме, особенно в венозной крови очень низко.
Отсюда следует, что должны существовать тонкие и эффективные механизмы, обеспечивающие быстрое освобождение кислорода, связанного с плотно упакованным в эритроцитах гемоглобином, именно в тех местах, где организм более всего в нем нуждается. Как было показано в разделе П. 2.1, одним из таких механизмов может быть возбуждение гемоглобина за счет переноса на него энергии электронного возбуждения, генерируемого при продукции АФК лейкоцитами. Однако это, по-видимому, не единственный механизм, способствующий резкому облегчению освобождения кислорода эритроцитами. В серии работ В.М. Фока и соавт. было показано, что эритроцит способен менять свое сродство к кислороду (по интерпретации авторов - изменять проницаемость мембраны для диффузионных потоков) в зависимости от механического контакта эритроцита с поверхностями [Фок М.В. и др., 1994а; Фок М.В. и др., 19946]. Было установлено, что скорость освобождения кислорода эритроцитами резко возрастает при изменении его формы с обычной дискоидной в вытянутую при прохождении, в частности, через тонкие капилляры. Эритроциты в тонких капиллярах отдают кислород в большей мере, чем в толстых (при толщине прямого и гладкого капилляра более 10 мкм они его вовсе не отдают). Другими словами, кислород выделяется как раз там и в той мере, где это требуется организму. Недаром органы, наиболее нуждающиеся в хорошем снабжении кислородом (сердце, печень, головной мозг), снабжены наиболее тонкими и извилистыми капиллярами.
Как мы полагаем, учитывая это свойство эритроцитов, можно объяснить различия в параметрах оседания крови при различиях в высоте ее столбика. Этот феномен трудно объяснить исходя из представления о крови как о чисто физико-химической системе, пусть даже очень сложной. Действительно, при одинаковой концентрации клеток, после приведения данных к одной высоте, кривые оседания по закону физики должны совпадать до начала уплотнения оседающих клеток, когда процесс замедляется. Тем не менее, мы наблюдаем ускорение оседания в столбике крови маленькой высоты. Почему это происходит? При наполнении пипетки кровью лежащие на дне и находящиеся в нижних слоях столбика эритроциты испытывают максимальное давление. Поэтому они отдают кислород быстрее, чем эритроциты, находящихся в верхних слоях столбика с кровью. Это приводит к более быстрому спаданию нижней части клеточной сети (в де-оксигенированной крови прочность клеточного остова несколько ниже, чем в нормальной). Поскольку этот процесс обладает кооперативностью, то спадание одной части остова ведет к спаданию петель, находящихся поблизости. Отношение количества эритроцитов в верхних слоях к количеству эритроцитов, находящихся в тесном соприкос новении с дном пипетки, в коротком столбике меньше, чем в длинном (при условии, что площадь основания в двух капиллярах одинакова). Из-за этого, за счет кооперативное всего процесса оседания, спадание клеточной сети в маленьком столбике крови произойдет быстрее, чем в большом.
