Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммуногематологические реакции при стрессорных воздействиях (обзор литературы) 9
1.1. Иммунотропные эффекты острого и хронического стресса 9
1.2. Иммунотропные эффекты стрессорных гормонов 13
1.3. Влияние глюкокортикоидов и цитокинов на соотношение между апоптозом и пролиферацией в иммунных органах 26
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Моделирование иммобилизационного стресса 33
2.2, Моделирование некогнитивного стресса путём введения рекомбинантного IL-1 (3 34
2.3,Иммунологические методы исследования 34
2.4. Гематологические методы 36
2.5. Определение уровня кортикостерона в сыворотке 38
2.6 Определение уровня циркулирующих IL-Іи IL-6 38
2.7. Статистическая обработка результатов 39
Глава 3. Лейкоцитарное звено системы крови и иммунотропные эффекты ежедневных иммобилизаций 40
3.1 Влияние ежедневных одночасовых иммобилизаций на чувствительность к антигенной стимуляции и содержание циркулирующих кортикостерона, IL-1 и IL-6 41
3.2. Влияние ежедневных одночасовых иммобилизаций на лейкоцитарные клетки крови и на цитологические показатели некоторых иммунных органов 43
3.3 Влияние ежедневных одночасовых иммобилизаций на чувствительность к IL-lfi-зависимым изменениям в лейкоцитарном звене системы крови 58
3.4 Обсуждение результатов 64
Глава 4. Влияние редко чередующихся одночасовых иммобилизаций на чувствительность к антигенной стимуляции и изменения в лейкоцитарном звене системы крови 70
4.1. Влияние редко чередующихся одночасовых иммобилизаций на чувствительность к антигенной стимуляции и содержание циркулирующих кортикостерона, IL-1 и IL-6 70
4.2. Влияние редко чередующихся одночасовых иммобилизаций на лейкоцитарные клетки крови, и на цитологические показатели некоторых иммунных органов 72
4.3. Влияние редко чередующихся одночасовых иммобилизаций на чувствительность к IL-lfi-зависимым изменениям в лейкоцитарном звене системы крови 83
4.4. Обсуждение результатов 89
Заключение 95
Выводы 106
Список литературы 107
- Иммунотропные эффекты острого и хронического стресса
- Иммунотропные эффекты стрессорных гормонов
- Моделирование некогнитивного стресса путём введения рекомбинантного IL-1
- Влияние ежедневных одночасовых иммобилизаций на чувствительность к антигенной стимуляции и содержание циркулирующих кортикостерона, IL-1 и IL-6
Введение к работе
Актуальность проблемы
В современных представлениях об иммунно-нейро-эндокринных взаимодействиях предусмотрена возможность цитокиновой регуляции нейроэндокринных, метаболических и иммунотропных эффектов стресса. Так, секретируемые лейкоцитарными клетками IL-1, IL-6, IL-2, ФНО проникают из циркулирующей крови в ЦНС вследствие увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Кроме того, поступление цитокинов из циркуляторного русла в головной мозг может проходить через фенестрированный эндотелий organicum vasculosus и lamina terminalis (Katsnura J., e. a., 1989; Strober W. e. a., 1988; Sternberg E. e. a., 1995; Kapkala L. e. a., 1995; De Souza E., 1993; Lightman A. e. a., 1993).
На уровне органов мишеней направленность эффектов IL-1 и других секреторных продуктов лейкоцитарных клеток отличается от характера эффектов, оказываемых на нейроэндокринные клетки (Волчегорский И.А. и совт., 1998). Так IL-1 обладает способностью снижать чувствительность органов-мишеней к действию глюкокортикоидов и катехоламинов (Рыбакина Е.Г., 1991, Симбирцев А.С., 1992). В частности, для этого цитокина характерна способность повышать устойчивость лимфоидной ткани к гипоплазирующему действию глюкокортикоидов (Симбирцев А.С., 1992). Аналогичным эффектом обладают и другие иммуностимуляторы. В частности выделенный из активированных нейтрофилов человека нейтрофилокин наряду с ограничением инволюции тимуса в ответ на введение экзогенного глюкокортикоида усиливал клеточное и гуморальное звено иммунного ответа (Волчегорский И.А и соавт., 1998; Колесников О.Л., 1998; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Таким образом, антикортикостероидное действие секреторных продуктов лейкоцитарных клеток можно рассматривать как один из вероятных механизмов постстрессорной иммуностимуляции.
Существует точка зрения об индукции апоптоза иммунокомпетентных
клеток как о механизме развития иммунодефицита. Действительно гипоплазирующее действие глюкокортикоидов может сопровождаться усилением апоптоза тимоцитов. Поэтому кажется правомерным предположение об антиапоптогенном действии цитокинов при глюкортикоид-зависимой гипоплазии лимфоидной ткани. Вместе с тем нельзя игнорировать факты о роли апоптоза в иммунопоэзе, заключающейся в элиминации тех клонов лимфоидных клеток, которые неэффективно распознают антигенные детерминанты (Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2002). При определённых условиях блокада апоптогенных механизмов может привести к тому же результату, что и активация апоптоза, т.е. к иммуносупрессии. В связи с этим следует обратить внимание, на следующее обстоятельство - у такого иммунстимулятора как IL-1 имеются как антиапоптогенные, так и проапоптогенные механизмы. Если трансдукция сигнала с IL-1 реализуется через митогензависимую протеинкиназу JNK-1, то тогда запускается каскад событий влекущих за собой усиление клеточной пролиферации. Напротив трансдукция сигнала через протеинкиназу JNK-2 приводит к угнетению пролиферации клеток и способствует индукции апоптоза.
Таким образом, на основании содержания глюкокортикоидов и
цитокинов не возможно однозначно предсказать характер иммунотропных
эффектов стрессорных воздействий. Поэтому представляется
целесообразным сопоставлять между собой стрессогенные изменения
иммунной реактивности с изменением чувствительности лейкоцитарного
звена системы крови к глюкокортикоидным гормонам и «эндокринным
цитокинам». Исследования, касающиеся соотношения между стресс-
индуцированными сдвигами в системе иммунобиологического надзора и
чувствительностью лейкоцитарного звена системы крови к действию
глюкокортикоидов (Волчегорский И.А. и соавт., 1998; Волчегорский И.А. и
соавт 2005). Показали, что два режима повторных иммобилизаций с
различной направленностью постстрессорных измененений
иммунореактивности характеризовались однонаправленными изменениями
чувствительности лимфоидной ткани к глюкокортикоидам. Вполне возможно, что исследованные режимы повторных иммобилизаций отличаются друг от друга по чувствительности лейкоцитарного звена системы крови к действию таких провоспалительных цитокинов как IL-ip.
Цель настоящего исследования: анализ чувствительности лейкоцитарного звена системы крови к действию рекомбинантного IL-1 (3 при стрессорных воздействиях сопровождающихся как усилением, так и угнетением иммунного ответа на аллогенный антиген.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние повторных одночасовых иммобилизаций у крыс, на
выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и
количество антителообразующих клеток (АОК) в ответ на антигенную
стимуляцию.
2. Определить влияние повторных одночасовых иммобилизаций на
чувствительность лейкоцитарного звена системы крови к введению
рекомбинантного IL-1 J3.
3. Оценить влияние повторных одночасовых иммобилизаций на соотношение
между апоптозом и пролиферацией клеток в тимусе крыс.
4. Выявить влияние повторных одночасовых иммобилизаций на
перераспределение лейкоцитарных клеток между различными
компартментами системы крови.
5. Изучить влияние повторных одночасовых иммобилизаций на вызванную
введением рекомбинантного IL-1J3 гипоплазию лимфоидной ткани.
Научная новизна: Установлено, что повторные стрессорные воздействия, сопровождающиеся усилением иммунной реактивности, характеризуются повышенной чувствительностью лейкоцитарного звена системы крови к действию рекомбинантного IL-1P; повторные стрессорные воздействия, сопровождающиеся сниженным уровнем иммунной реактивности, характеризуются десенситизацией лейкоцитарного звена системы крови к действию рекомбинантного IL-ip.
Выявлено, что при ежедневных иммобилизациях гипоплазия тимуса обусловлена индукцией апоптоза, а гипоплазия селезёнки развивается за счёт угнетения пролиферативной активности. Впервые обнаружено, что стрессорная гипоплазия костного мозга и селезёнки сопровождается снижением количества кариоцитов, содержащих одновременно экстрануклеолярные и интрануклеолярные депозиты нитрата Ag, являющиеся маркёрами экспрессии рРНК. В тимусе, костном мозге и селезёнке обнаружено постстрессорное снижение количества экстрануклеолярных и интрануклеолярных депозитов Ag , приходящихся на одну клетку.
Теоретическое и практическое значение работы:
Получены новые данные о цитокинзависимых механизмах усиления и снижения функциональной активности клеточного звена иммунитета при повторных стрессорных воздействиях.
Результаты исследования могут быть использованы для разработки новых подходов коррекции стрессорной иммуносупрессии и лабораторных тестов для определения индивидуальной чувствительности к цитокинам.
Основные положения, выносимые на защиту:
Повышенная чувствительность лейкоцитарного пула системы крови к рекомбинантному IL-1B сопряжена с постстрессорным усилением реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Сниженная чувствительность лейкоцитарного звена системы крови к рекомбинантному IL-113 сопряжена с постстрессорным угнетением реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Постстрессорная модификация лейкотропных эффектов рекомбинантного IL-1B основана на перераспределении пула лейкоцитарных клеток между циркулирующей кровью и иммунными органами.
Апробация работы Основные результаты исследования доложены на III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003) , межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003),
Всероссийской научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск.,2004), III итоговой научно-практической конференции молодых учёных Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2005) , IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005), иммунологическом форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань 2006) и 16 Европейском
конгрессе по иммунологии (Paris 2006)
Структура и объём диссертации: Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав, касающихся
результатов исследования, заключения, выводов. Список литературы состоит
из 381 источников, в том числе 194 на иностранном языке
Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста.
Иллюстрирована 23таблицами и 8 рисунками.
Иммунотропные эффекты острого и хронического стресса
Пожалуй, всё многообразие иммунных реакций, в конечном счёте, направлено на поддержание генетического гомеостаза организма. Вероятно, с этим связана высокая чувствительность иммунной системы к заведомо неантигенным стрессорным воздействиям. В современной литературе имеются данные об изменениях в иммунных органах при действии эмоционального стресса, гипокинезии, при физических нагрузках, ионизирующем излучении и при действии некоторых токсических веществ (Горизонтов П.Д. и соавт., 1983; Гольдберг Е.Д. и соавт.,1983; Шахов В.П.,1990; Волчегорский И.А. и соавт.,1998; Цейликман В.Э., 1998; Колесников О.Л., 1998; Аклеев А. В., Тряпицин Г. А., Шибкова Д. 3., 1987, 2001; Сапин М.Р., Никитюк Д.Б., 2000). Несмотря на некоторую противоречивость имеющихся по этому вопросу сведений, становится очевидным то, что иммунная система, будучи высоко лабильной, играет существенную роль в развитии общего адаптационного синдрома. Поэтому уместно обратить внимание на неоднозначный характер иммунотропных эффектов при заведомо неантигенных стрессорных воздействиях.
С одной стороны, имеются данные о подавлении клеточного и гуморального звена иммунного ответа при различных стрессорных состояниях. Известно, что стресс, вызванный длительной физической нагрузкой, приводит к снижению содержания иммуноглобулинов в крови спортсменов (Перший Б.В. и соавт., 1985). При экспериментальных воздействиях отмечено отрицательное влияние различных видов стресса на интенсивность гуморального иммунного ответа, проявляющееся в снижении уровня антител в крови и уменьшения количества клеток антитело-продуцентов при введении Vi и Н -антигенов брюшнотифозной палочки, эритроцитов барана, полимелизированного флагеллина, бычьего сывороточного альбумина и др. (Фролов Б.А., Корнева Е.А., Шхинек Э.К., 1993). Возможно, это связано со снижением содержания В-лимфоцитов в лимфоидных органах и с уменьшением их способности к кооперативному взаимодействию (Gisler R. Е.а., 1971). Имеются данные о снижении количества АОК в селезёнке после иммунизации ЭБ, осуществляемой через 72 часа после завершения стрессорного воздействия (Зимин Ю.И., 1983).
В настоящее время доказано постстрессорное угнетение реакции ГЗТ. Причём ведущая роль в наблюдаемой дисфункции клеточного звена иммунного ответа принадлежит нарушению соотношения Т-хелперов и Т-супрессоров, в сторону преобладания последних или активации их функций (Фролов Б.А., Корнева Е.А., Шхинек Э.К., 1993). Кроме того, обнаружены супрессорные механизмы, реализующиеся на уровне взаимодействия Т-клеток и макрофагов. Важно отметить существование постстрессорной недостаточности клиринговой и нарушение антиген-презентирующей функции макрофагов. Показано, что при иммобилизационном стрессе снижается цитотоксичность перитонеальных макрофагов, активированных бактериальными липополисахаридоми. Кроме того, при стрессе обнаружена супрессия нормальных или естественных киллеров (NK). Причём уровень депрессии NK определяется генетически детерминированными параметрами связывания глюкокортикоидных гормонов с рецепторами. Эти параметры являются стабильными для каждой линии животных и не зависят от их возраста и характера стрессорных воздействий (Ляшко., Сухих Г.Т., 1987). Следует отметить, что обусловленное стрессом нарушение функции NK является фактором риска развития онкопатологии. С отрицательными последствиями постстрессорного угнетения противоопухолевого иммунитета связывают и нарушение антитело зависимой клеточной цитотоксичности (Зимин Ю.И., 1985).
Среди техногенных факторов, загрязняющих окружающую среду производные диоксина обладают способностью к некогнитивной индукции стресса и к иммуносупрессивному действию. Не случайно Т. Н. Харламова их называет «химическим СПИДом». Мишенью токсического действия диоксинов являются В-лимфоциты, CD4+ лимфоциты и тимоциты (Сибиряк СВ., Вахитов В.А., Курчатова Н.Н., 2003). Диоксиновое производное 2,3,7, 8 тетрахлор-р-бенздиоксин вызывает атрофию тимуса и гипоплазию костного мозга. Существует точка зрения, что инволюция тимуса обусловлена ингибированием пролиферативных процессов, а не активацией апоптоза в органе (Silverstone А., 2000).
В условиях блокады fi-адренорецепторов отменяется депрессивное действие стресса на реакцию гиперчувствительности замедленного типа и фагоцитарный ответ макрофагов (Shilov Ju.I.e.a., 2001). Важно отметить, что наблюдаемой иммуносупрессии соответствовали и определённые морфологические сдвиги в иммунных органах. Так в тимусе у крыс, подвергнутых 5 часовой иммобилизации обнаружено, снижение лимфоцитов в корковом слое, при этом большая часть ядерного детрита в корковой части органа фагоцитирована макрофагами. В мозговом веществе тимуса отмечено увеличение числа телец Гассаля. В селезёнке отмечена гипоплазия белой пульпы и нейтрофильная инфильтрация красной пульпы (Сапин М.Р., Никитюк Д.Б.,2000).
Существует точка зрения о приуроченности постстрессорной иммуносупрессии к первой фазе стресса - реакции тревоги или стадии мобилизации. Если проводить иммунизацию в стадии резистентности, то тогда возможно изменение характера иммунотропного эффекта стресса. В настоящее время приводятся сведения об усилении иммунных реакций при некоторых видах стресса. Так, многократное использование комплекса световых и звуковых раздражителей у крыс в неонатальном периоде влечёт за собой увеличение антителопродукции в ответ на введение флагеллина (Solomon 1974) Усиление иммунного ответа у кроликов, иммунизированных вакциной палочки
Иммунотропные эффекты стрессорных гормонов
Согласно современным представлениям, развитие долговременной адаптации связано с переходом от первоначальной резистентной адаптационной стратегии к филогенетически более древней толерантной (Кулинский В.И., Ольховский И.А., 1992; Волчегорский И.А. и соавт., 2000). Соответственно постстрессорное усиление иммунного ответа рассматривается как проявление толерантной стратегии адаптации (Волчегорский И.А., 1998). В связи с этим заслуживают внимание данные о сцепленности между собой постстрессорного усиления иммунореактивности и развития стресс-толерантности системы крови (Цейликман В.Э., 1998; Волчегорский И.А. и соавт., 1998,2000). Так, на модели иммобилизационного стресса установлено, что реакция системы крови на повторные трехкратные одночасовые иммобилизации имеет фазный характер. Первоначально отмечается усиление мобилизации нейтрофилов из костного мозга и селезенки, развитие периферического нейтрофилеза и лимфопении. Вторая фаза характеризуется уменьшением стрессорной мобилизации нейтрофилов костного мозга, накоплением нейтрофилов в селезенке и уменьшением выраженности стрессорной периферической лимфопении. Наблюдаемые в этот период сдвиги были обозначены как феномен стресс-толерантности системы крови (Tseilikman V.E. е.а., 2000). Правомерность подобного термина, прежде всего обосновывается тем, что снижение чувствительности системы крови к стрессорному воздействию сопровождалось появлением типичных для толерантной стратегии адаптации сдвигов адренореактивности - угнетению PJ адренозависимого липолиза при одновременном повышении чувствительности к антилиполитическому действию аг адреномиметика. Переход от стрессорной к толерантной стратегии адаптации обуславливает повышение устойчивости к гипоксии после завершения повторных стрессорных воздействий.
Таким образом, развитие стресс-толерантности системы крови сопровождается приростом иммунореактивности, что проявляется в возрастании количества антителообразующих клеток в селезенке и увеличению интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа в ответ на иммунизацию животных гетерологичным антигеном. Причём, формирование стресс-толерантности системы крови сопровождается увеличением устойчивости лимфоидных органов (тимуса и селезенки) к гипоплазирующему действию глюкокортикоидов.
Согласно данным В.Э.Цейликмана и соавторов (1998) предварительная блокада В-адренорецепторов полностью отменяла иммуннотропные эффекты иммобилизационного стресса. Так, повторные иммобилизации на фоне фармакологической блокады Р-адренорецепторов не сопровождаются увеличением численности пула нейтрофилов. При этом наблюдалось угнетение фагоцитарной активности перитонеальных нейтрофилов в ответ на стимуляцию зимозаном, и устранялось стресс-индуцированное увеличение иммунореактивности и увеличение устойчивости к гипоксии. Скорее всего, эти данные отражают наличие адренергических механизмов регуляции иммуномодулирующих эффектов глюкокортикоидов в условиях хронического стресса (Шилов Ю.И. и соавт., 2004). Необходимо отметить, что взаимодействия между глюкокортикоид-зависимыми и адрено-зависимыми механизмами в условиях стресса весьма разнообразны и могут принимать как синнергичный, так и антагонистический характер. Это обстоятельство необходимо учитывать при анализе иммунотропных эффектов стресса.
В настоящее время расшифрованы основные механизмы стресс-регулирующей роли иммунной системы. Они основываются на способности иммунокомпетентных клеток продуцировать «эндокринные цитокины», которые, оказываясь в циркуляции, активируют гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему. Пожалуй, все имеющиеся данные о цитокинзависимой регуляции стресса хорошо согласуются с представлениями J.Blalock (1984) об иммунной системе как о сенсорном органе. В отличие от классических представлений, берущих своё начало от H.Selye, Blalock основное внимание уделяет специфическим механизмам передачи информации от стрессорных раздражителей на гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему (ГГАС). Им предложено классифицировать все стрессорные раздражители на два типа. Первый тип обозначен как «когнитивные стрессоры» Для них афферентным звеном является нервная система. Всё многообразие эмоциональных стрессов реализуется через «когнитивные механизмы». К некогнитивным по Blalock относятся те стрессоры, у которых первичная афферентация реализуется помимо нервной системы. Для таких факторов ведущей сенсорной системой является система иммунобиологического надзора. За последние 20 лет не только удалось подтвердить справедливость этого положения в концепции Blalock, но и проследить афферентные пути от первичного воздействия некогнитивного раздражителя до активации стресс-реализующих систем. Е.А.Корнева ещё в 1969 году (цитируется по Е.А.Корнева и Э.Г.Шхинек 1988) обнаружила, что иммунизация сопровождается увеличением уровня глюкокортикоидных гормонов, а следовательно и усилением стресса. Позднее Н. Besedovsky (1977) и A. Del Rey (1987) продемонстрировали ключевую роль секретируемого иммунокомпетентными клетками IL-1 в активации ГГАС. Дальнейшие исследования позволили прийти к заключению, что IL-1-зависимая активация ГГАС формируется не только при иммунизации, но и при различных вариантах воспалительной реакции, то есть имеет универсальный характер (Sternberg Е., Licinio J., 1995). Поэтому представляются вполне правомерными представления К. Gorris е. а. (1989) и Е. Sternberg е. а. (1990 -1997) о воспалительном очаге как о временной эндокринной железе. С позиций концепции Blalock, воспалительный очаг, подобно иммунизации является начальным звеном в некогнитивной активации ГГАС. Тем более и в том, и в другом случае необходимым условием для индукции стресса является поступлениецитокинов в кровоток.
Моделирование некогнитивного стресса путём введения рекомбинантного IL-1
Для воспроизведения цитокин-зависимой активации ГГАС мы применяли рекомбинантный человеческий IL-ip (беталейкин, betaleukinum, hrIL-1 Р) (ГНЦ РФ ГосНИИ особо чистых препаратов, Санкт-Петербург) с удельной биологической активностью 10 ед/мг белка разводили изотоническим раствором NaCl и вводили внутрибрюшинно (Sibiryak S.V е.а.2004). Объём вводимой жидкости составил 1 мл на 100 гр. массы животного. Контрольные группы получали эквивалентное по объёму количество хлорида натрия, (выражаем благодарность профессру А. С. Симбирцеву за любезно предоставленный препарат рекомбинантного IL-ip). Группа «IL-1» - это группа животных которой вводили препарат беталейкин. Группа «стресс+IL-l» - это группа стрессированных животных, перед введением беталейкина.
Животных иммунизировали тимусзависимым антигеном - ЭБ. Перед использованием ЭБ трижды отмывали в физиологическом растворе.
Учитывая, что доза 1x10 ЭБ является оптимальной как для подкожного, так и внутрибрюшинного введения антигена, для индукции системного и локального иммунного ответа использовали данную дозу ЭБ. В качестве разрешающей дозы для подкожной иммунизации использовали 5x107 клеток. В случае индукции гуморальной и клеточной составляющей иммунного ответа сначала проводили внутрибрюшинную иммунизацию, а через 4 дня осуществляли повторную иммунизацию, а в случае индукции клеточноопосредованного иммунного ответа антиген вводили двукратно, с интервалом в 4 дня под апоневроз стопы животных.
Оценка реакции гиперчуствительности замедленного типа (ГЗТ).
В одном случае реакцию ГЗТ индуцировали двойной иммунизацией ЭБ в объёме 0,05 мл под апоневроз стопы, в другом случае животных сначала иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в объёме 0,5мл, а через 4 дня проводили повторную иммунизацию ЭБ под апоневроз стопы. Под апоневроз контрольной стопы вводили такой же объём физиологического раствора. В о качестве сенсибилизирующей дозы использовали 1x10 ЭБ, а в качестве разрешающей - 5x10 ЭБ. Выраженность реакции ГЗТ оценивали волюмометрически через 24 часа после разрешающей иммунизации антигена.
На 5-й день после иммунизации в селезёнке определяли количество антителообразующих клеток по методу Jerne N.K., Nordin А.А. (1963).
Кроме того, с помощью монокланальных антител проводили иммунофенотипирование циркулирующих лимфоцитов (CD4+;CD8+) в соответствии с методикой С.В.Сибиряка (Сибиряк СВ. и соавт., 2003). Этот раздел включает методы исследования периферической крови, костного мозга (КМ) и лимфоидных органов (тимуса и селезёнки).
Изучение периферической крови проводилось общепринятыми методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П.1992) и заключалось в подсчете эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, определении содержания гемоглобина гемоглобинцианидным методом и определении гематокрита. Лейкоцитарную формулу изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе (проводился подсчет не менее чем 200 клеток). Функциональную активность фагоцитирующих клеток определяли с использованием НСТ теста с одновременным определением показателей фагоцитоза (Волчегорский И.А. и соавт., 2000). Мазки периферической крови, также как мазки-отпечатки КМ и селезёнки, перед окраской фиксировали метанолом. Клеточные суспензии тимуса и селезёнки получали при помощи стеклянного гомогенизатора, осторожно "выжимая" клетки пестиком. Костный мозг забирали из диафиза бедренной кости, промывая костномозговой канал 0.9% раствором NaCl после удаления эпифизов. Суспензию миелокариоцитов перемешивали пипетированием.
Кариоциты КМ и лимфоидных органов (также как и лейкоциты крови) подсчитывали в камере Горяева после ресуспендирования в 0.1% растворе метиленового синего в 3% уксусной кислоте. Содержание кариоцитов в тимусе и селезёнке рассчитывали на весь орган, на 1 мг массы органа и на 1 г массы тела (Волчегорский И.А., 1993). Количество миелокариоцитов рассчитывали на 1 бедренную кость. В мазках-отпечатках КМ, окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывали количество эритроидных клеток-прекурсоров, малодифференцированных клеток грануло-моноцитарного ряда (т.е. миелобластов, промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов), Нф, моноцитов-макрофагов и лимфоцитов. Расчет показателей миелограммы проводили не менее чем на 500 клеток. Аналогичным образом изучалась морфология клеток на мазках-отпечатках селезёнки.
Влияние ежедневных одночасовых иммобилизаций на чувствительность к антигенной стимуляции и содержание циркулирующих кортикостерона, IL-1 и IL-6
В настоящее время доказано, что реакция системы крови на стрессорные раздражители имеет стереотипный характер, который проявляется в развитии нейтрофильного лейкоцитоза, лимфопении, мобилизации костномозговых нейтрофилов, развитии «лимфоидного пика» в костном мозге (Горизонтов П.Д., Белоусова М.И., Федотова О.И.,1983; Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н., 1988; Дыгай A.M., Шахов В.П., 1989; Цейликман В.Э., 1998). Вместе с тем, характер кинетики наблюдаемых при стрессе гематологических сдвигов во многом определяется режимом стрессорных воздействий (Цейликман В.Э.,1992). Специфическое влияние режимов хронического стресса в основном касается соотношения между процессами апоптоза и пролиферации в кроветворных и лимфоидных органах, а также перераспределения лейкоцитарных клеток в пределах системы крови. Между тем, молекулярные механизмы апоптоза и пролиферации реализуются при участии, как глюкокортикоидов, так и цитокинов. И те и другие оказывают заметное воздействие на различные группы лейкоцитарных клеток, которые являются непосредственными эффекторами воспаления. В частности лейкотропное действие провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6 и т.д.) предусматривает: а) непосредственное или опосредованное усиление грануло-моноцитопоэза и лимфопоэза, которому часто сопутствует усиление эритропоэза, что позволяет постоянно обеспечивать воспалительный очаг клетками-эффекторами (Mizel S.B., 1989; Moore М., 1990; Jelkman W.E.B е.а., 1994; Fandrey J., Jelkman W.E.B., 1993; Dinarello C, 1988,1994;Gearing A.,1992;StorkJ.,1988) б) регуляцию перераспределения лейкоцитарных клеток между различными отделами системы крови (Dhabar F е.а.,1996; Потапнев М.П.,1995) в) миграцию лейкоцитарных клеток-эффекторов в воспалительный очаг (Harlan J.M., 1985; Ахматов А.Т., 2004) г) активацию фагоцитарной функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов (Маянский Д.Н.,1991; Дыгай A.M., Клименко Н.А.,1992; Щепеткин И.А., Чердынцева Н.В., Васильев Н.В., 1994; Симбирцев А.С.,2002; Rajarathnam К., Sykes В., Кау С, 1994.,). Кроме того, глюкокортикоиды и цитокины оказывают заметное влияние на чувствительность организма к антигенной стимуляции.
В связи с этим, представляется важным сопоставление между уровнем циркулирующих цитокинов и глюкокортикоидов с изменениями в лейкоцитарном звене системы крови при различных режимах хронического стресса.
Влияние ежедневных одночасовых иммобилизаций на чувствительность к антигенной стимуляции и содержание циркулирующих кортикостерона, IL-1 и IL-6
На первом этапе исследования изучались иммунотропные и лейкотропные эффекты трёхкратного одночасового иммобилизационного стресса с интервалами между иммобилизациями в 24 часа (Волчегорский И.А., и соавт. 2000). Интерес к этой модели хронического стресса, прежде всего, связан с данными, полученным ранее в нашей лаборатории, о характерном для неё постстрессорном усилении иммунного ответа в ответ на введение аллогенных эритроцитов (Волчегорский И.А., Цейликман В.Э., Колесников О.Л, 1998; Цейликман В.Э., 1998; Колесников О.Л., 1998). Причём, при иммунизации стрессированных животных эритроцитами IV группы крови человека наблюдалось увеличение выраженности ГЗТ и повышение количества АОК в селезёнке. В отличие от предыдущих исследований мы проводили иммунизацию эритроцитами барана, и применяемый алгоритм иммунизации позволял определять количество АОК и интенсивность ГЗТ у одного животного. При таком подходе у стрессированных животных удалось воспроизвести только усиление выраженности ГЗТ (контроль п=9 4,8± 0,16 см"3; опыт п=8 6,0±0,34 см"3 P=0,038WW), а по количеству АОК (контроль 14,84±7,611 103 клеток/селезёнка; опыт 12,6±6,31 10 клеток/селезёнка) отсутствовали статистически значимые изменения по сравнению с контролем. Таким образом, для трёхкратного иммобилизационного стресса только стимуляция ТЫ- зависимого иммунного ответа оказалась атрибутивным признаком. В отличие от параметров клеточного иммунитета, для показателей гуморального иммунитета на направленность постстрессорных изменений значительно влияют условия иммунизации. Вероятно, наблюдаемые иммунотропные эффекты сопряжены с действием повторных иммобилизаций на состояние лейкоцитарного звена системы крови в целом. В свою очередь, лейкотропные эффекты хронического стресса во многом определяются сложившимся балансом между уровнем циркулирующих глюкортикоидов и цитокинов. Поэтому в дальнейших исследованиях проводилось сопоставление между содержанием циркулирующих цитокинов (IL-1, IL-6), уровнем кортикостерона и изменениями в лейкоцитарном звене системы крови в условиях трёхкратного одночасового иммобилизационного стресса. Как видно из таблицы З.1., у стрессированных крыс наблюдалась тенденция к увеличению содержания кортикостерона не достигшая статистически значимых величин. Однако содержание циркулирующего IL-6 в 3 раза повысилось по сравнению с контролем при неизменном содержании циркулирующего IL-1. Таким образом, у крыс линии Вистар наблюдалось в крови повышенное содержание «цитокина второй волны», оказывающего заметное влияние на состояние лейкоцитарного звена системы крови в целом.
