Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные представления о роли и механизмах действия дегидроэпиандростерона и дегидроэпиандростерон-сулъфата 13
1.2. Значение дегидроэпиандростерона и дегидроэпиандростерон-сульфата в тревожности и депрессии 31
1.3. Участие опиоидных систем в регуляции стресс-реакции организма и стресс-индуцированного тревожного поведения 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы 50
2.1. Экспериментальные животные 50
2.2. Методы стрессорного воздействия 50
2.2.1. Модель сенсорного контакта 50
2.2.2. Модель стрессорного воздействия встряхиванием 51
2.3. Поведенческие тесты для оценки тревожности 52
2.3.1. Тест «крестообразный лабиринт» 52
2.3.2. Тест «перегородка» 53
2.4. Биохимические методы 54
2.4.1. Определение кортикостерона методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии 55
2.4.2. Радиоиммунное определение АКТГ 57
2.4.3. Радиоиммунное определение ДЭАС 58
2.5. Фармакологические тесты 59
2.6. Статистическая обработка результатов 60
ГЛАВА 3. Результаты собственного исследования 61
3.1. Действие дегидроэпиандростерон-сульфата на тревожность мышей 62
3.2. Оценка участия ц-опиоидных рецепторов в анксполитическом эффекте дегидроэпиандростерон-сульфата 70
3.3. Действие дегидроэпиандростерон-сульфата на стресс-реактивность у крыс 76
3.3.1. Особенности влияния дегидроэпиандростерон-сульфата на стресс-реактивность у крыс при однократном и многократно повторяющемся стрес-сорных воздействиях 77
3.3.2. Пролонгированный эффект дегидроэпиандростерон-сульфата 81
3.4. Оценка участия ц-опиоидных рецепторов в лимитирующем стресс-реактивность эффекте дегидроэпиандростерон-сульфата у крыс 83
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 87
Заключение 110
Выводы 112
Список литературы 114
- Современные представления о роли и механизмах действия дегидроэпиандростерона и дегидроэпиандростерон-сулъфата
- Определение кортикостерона методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии
- Действие дегидроэпиандростерон-сульфата на тревожность мышей
- Оценка участия ц-опиоидных рецепторов в лимитирующем стресс-реактивность эффекте дегидроэпиандростерон-сульфата у крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Проблема повышения резистентности организма к действию экстремальных факторов внешней среды и тесно связанные с ней аспекты профилактики патологических последствий тяжелого стресса всегда остаются актуальными. Ухудшение экологических условий, усложнение профессиональной деятельности, ускорение темпа жизни, социальное напряжение привели к резкому росту числа стрессорных ситуаций и психоэмоциональных нагрузок, с которыми сталкивается человек в современном обществе. Стресс-реакция, которая является необходимым звеном индивидуальной адаптации организма к неблагоприятным факторам, сама может стать причиной развития различных патологий при чрезмерно интенсивных или неадекватно длительных воздействиях. Известно, что стрессы могут оказывать отрицательное влияние, как на психическое, так и на физическое здоровье человека (Newbury-Birch, Kamali, 2001; Korte, 2005). Они приводят к разнообразным психоэмоциональным нарушениям, таким как тревожность, депрессия, неврозы, которые в свою очередь являются факторами риска развития сердечно-сосудистых патологий (Denollet, Brutsaert, 1998; Shah et al., 2004), заболеваний желудочно-кишечного тракта (Addolorato et al., 1998), снижения иммунитета (Leonard, Song, 1996). По данным официальной статистики в России только от сердечно-сосудистых заболеваний страдает около 16,2 млн. человек, а смертность от таких заболеваний составляет 55,3% от общей смертности населения (Онищенко, 2002). Поэтому исследования, направленные на изучение адаптивных механизмов организма, противодействующих повреждающему действию стресса, представляют существенную ценность для медицины.
Дегидроэпиандростерон (ДЭА) и ДЭА-сульфат (ДЭАС) являются основными гормонами, секретируемыми сетчатой зоной коры надпочечников. Причем 99% этих андрогенов, по крайней мере у человека, циркулирует в крови в виде ДЭАС и лишь 1% в виде десульфатированной формы - ДЭА (Zumoff et al., 1980). То есть сульфатированная фракция гормона является основной, количественно превалирующей и, видимо, функционально более значимой. Кроме того, ДЭА и ДЭАС в большом количестве присутствуют в мозге и могут синтезироваться там de novo без участия переферических источников, за что они получили название нейростероиды (Baulieu, 1997). В настоящее время установлено, что ДЭА и ДЭАС способны оказывать многочисленные терапевтические эффекты в организме: антионкогенный (Williams, 2000), гипотензивный (Обут и соавт., 1999), антивирусный (Danenberg et al., 1995), иммуномо-дулиругощий (Ledochwski et al., 2001), антиатерогенный (Gordon et al., 1988), a также могут улучшать состояние депрессивных больных (Wolkowitz et al., 1999). Выявлена зависимость продолжительности жизни человека и устойчивости к сердечно-сосудистым заболеваниям от уровней ДЭА и ДЭАС (Barrett-Connor et al., 1986; Feldman et al., 2001). Но роль ДЭА и ДЭАС в организме при стрессорных воздействиях еще не изучена.
В литературе есть единичные свидетельства о возможном антистрессорном эффекте ДЭА и ДЭАС, но в основном они касаются их так называемого анти-глюкокортикоидного действия. Под этим термином имеется в виду, что ДЭА и ДЭАС противодействуют эффектам глюкокортикоидов при их введении или в ситуации стресса. В основном эти данные получены в иммунологических исследованиях и свидетельствуют о том, что инъекция ДЭА или ДЭАС снижает повреждающее действие стресса или введения глюкокортикоидов на иммунную систему (Kalimi et al., 1994). Показано, что ДЭАС может противодействовать негативным эффектам глюкокортикоидов и на процессы памяти (Du-brovsky, 2000).
Работ, направленных на изучение влияния ДЭА или ДЭАС на уровень основных стрессорных гормонов АКТГ и кортикостерона как при острых, так и при хронических стрессорных воздействиях в литературе практически нет. Нам удалось найти только одну статью, посвященную исследованию этих вопросов при хроническом стрессорном воздействии. Однако авторы не изучали эффект гормона на стресс-реактивность, а измеряли только базальный уровень кортикостерона через сутки после многократно повторяющегося стрес-сорного воздействия (Ни et al., 2000). Таким образом, вопрос о влиянии ДЭАС на стресс-реактивность еще, не ставился и не решен в мировой литературе.
Не изучена роль ДЭА и ДЭАС в регуляции эмоциональных и поведенческих реакций животных при хронических стрессорных воздействиях, в частности в проявлении тревожности, как последствия стрессогенных воздействий. Есть несколько исследований, свидетельствующих о влиянии ДЭА и ДЭАС на тревожность интактных животных, но данные противоречивы. Показан как анксиолитический (Melchior, Ritzmann, 1994; Prasad et al., 1997), так и анксиогенный (Reddy et al., 1998) эффект этих гормонов. Относительно механизмов анксиолитического эффекта ДЭА и ДЭАС пока существуют только предположения (Broekhoven, Verkes, 2003), но нет экспериментальных свидетельств. В основном они касаются действия этих гормонов на ГАМКергиче-скую систему, с рецепторами которой они могут взаимодействовать (Broekhoven, Verkes, 2003). Но здесь существуют некоторые сложности, т.к. ДЭА и ДЭАС являются негативными модуляторами ГАМК-рецепторов (Majewska, 1992, Baulieu, 1997).
Известно, что как в регуляции тревожного поведения (Agmo, Belzung, 1998; Vaccarino et al., 1999), так и гормональных звеньев стрессорной реакции значительную роль играют опиоидные системы (Janssens et al., 1995; Dumont et al., 2000). Однако о роли определенных типов опиоидных рецепторов в данной регуляции пока нет однозначного мнения, но есть свидетельства, что при многократных стрессорных воздействиях в ней могут участвовать ц-опиоидные рецепторы (Drolet et al., 2001). Изучение взаимодействий ДЭА и ДЭАС с опиоидными системами представляет собой новую область исследований и такие данные пока единичны. Есть работы, указывающие на то, что ДЭА и ДЭАС могут оказывать влияние на данные системы (Schwarz, Pohl, 1994; Reddy, Kulkarni, 1997; Inagaki et al., 1999; Stomati et al., 1999). Взаимодействие ДЭА(С) с конкретными опиоидными рецепторами, если не брать в расчет а-рецепторы (Monnet et al., 1995; Urani et al., 2001), которые долгое время относили к опиоидным, но сейчас предлагают выделять в самостоятельную группу (Маслов и соавт., 2002), еще мало изучены.
Поэтому, исследование влияния ДЭАС на стресс-реактивность и стресс-индуцированную тревожность, как патогенное последствие стрессорного воздействия, а также возможных биологических механизмов его эффектов в организме (в частности, взаимодействия с опиоидной системой) представляется весьма актуальным.
Цель и задачи исследования.
Целью работы было изучить влияние ДЭАС на стресс-реактивность и стресс-индуцированную тревожность у животных при многократно повторяющихся стрессорных воздействиях, а также возможность участия цгопиоидных рецепторов в этих эффектах ДЭАС.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Изучить влияние ДЭАС на стресс-реактивность, оцениваемую по уровням кортикостерона и АКТГ в плазме крови, при многократно повторяющемся (19 суток) стрессорном воздействии и сравнить с таковым при однократном воздействии у самцов крыс Wistar;
Оценить изменение эффекта ДЭАС на стресс-реактивность у самцов крыс Wistar при однократном и многократно повторяющемся (19 суток) стрессорных воздействиях под влиянием антагониста опиоидных рецепторов налтрексона, применяемого в малой дозе (0,1 мг/кг), в которой он селективно блокирует д-опиоидные рецепторы;
Оценить продолжительность действия однократного введения ДЭАС на стресс-реактивность у самцов крыс Wistar в пределах 4-х суток;
Сравнить эффективность действия разных доз ДЭАС (1; 5; 30 и 60 мг/кг) на стресс-реактивность у самцов крыс Wistar;
Изучить влияние ДЭАС на поведенческие показатели, характеризующие тревожность, у самцов мышей линии CBA/Lac с 20-дневным опытом зоо- социальных поражений в стрессогенной ситуации межсамцовых агонисти- ческих конфронтации;
6. Оценить изменение эффекта ДЭАС на тревожность у самцов мышей линии CBA/Lac под влиянием антагониста опиоидных рецепторов на-лтрексона, применяемого в малой дозе (0,25 мг/кг), селективно блокирующей ц-опиоидные рецепторы.
Основные положения, выносимые на защиту.
ДЭАС оказывает лимитирующий стресс-реактивность эффект при многократно (19 суток) повторяющемся, но не однократном, стрессор ном воздействии у самцов крыс Wistar. Опосредование такого влияния через АКТГ указывает на наличие центрального компонента лимитирующего стресс-реактивность эффекта ДЭАС.
ДЭАС обладает анксиолитическим действием, купирует тревожность, развивающуюся как последствие 20-дневного негативного опыта поражений в стрессогенной ситуации зоосоциальных агонистических конфронтации у самцов мышей линии CBA/Lac.
Анксиолитический и лимитирующий стресс-реактивность эффекты ДЭАС осуществляются при участии ц-опиоидных рецепторов, но двумя различающимися по времени вовлечения вариантами.
Научная новизна.
Впервые показано, что ДЭАС оказывает лимитирующий стресс-реактивность эффект, снижая стресс-индуцируемые уровни АКТГ и корти-костерона, при многократно повторяющемся стрессорном воздействии и не оказывает такого эффекта при однократном стрессорном воздействии.
Впервые выявлено, что в дозах 1; 5 и 30 мг/кг ДЭАС оказывает статистически равнозначные лимитирующие стресс-реактивность эффекты, но в дозе 60 мг/кг этот эффект не проявляется.
Впервые установлено, что ДЭАС снижает проявление тревожности, индуцированной 20-дневным опытом поражений в межсамцовых конфронтаци-ях у животных, восстанавливая ее до состояния нормы.
Впервые показано, что как анксиолитический, так и лимитирующий стресс-реактивность эффекты ДЭАС осуществляются с участием опиоидных систем и, в частности, ц-опиоидных рецепторов.
Впервые установлено, что однократное введение водного раствора ДЭАС животным оказывает пролонгированный эффект на стресс-реактивность на протяжении, по крайней мере, 4-х суток и на тревожность до 28 часов, который не связан с длительным сохранением ДЭАС в циркулирующей крови.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Настоящая работа является комплексным исследованием роли ДЭАС в регуляции ответа организма на стрессор и включает рассмотрение его участия как в регуляции гормональной, так и поведенческой составляющей стрессор-ной реакции. Теоретическое значение работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о механизмах регуляции стрессорного ответа организма при многократных стрессорных воздействиях. Принципиальную теоретическую значимость имеет также установление одного из механизмов реализации выявленных нами эффектов ДЭАС при стрессорных воздействиях. Показано, что лимитирующий стресс-реактивность и анксиолитический эффекты ДЭАС осуществляются с участием ц-опиоидных рецепторов.
Полученные результаты могут рассматриваться в практическом отношении, как основа для разработки способов применения ДЭАС в клинике в качестве лимитирующего стресс-реактивность и анксиолитического фармакологического агента. Результаты данного исследования могут быть положены в основу разработки новой группы стресс-лимитирующих препаратов (аналогов надпочечниковых андрогенов) полезных при хронических стрессорных воз- действиях для предупреждения развития дизадаптивных последствий и, в частности, психоэмоциональных нарушений. Установленный в работе пролонгированный эффект ДЭАС может быть использован для разработки новых методик введения данного препарата в экспериментальной и клинической практике. Возможно, это позволит избежать ежедневного введения ДЭАС пациентам в течение многих месяцев, как это принято зарубежными исследователями и врачами в настоящее время, и сократить инъекции препарата до одного раза в 4 дня. Кроме того, заблаговременное введение ДЭАС позволит исключить проявления стресса от инъекции у животных к моменту исследования, что важно в экспериментальной практике.
Результаты исследования используются в качестве материала для курса лекций проф. Тернера А.Я. «Эндокринная система и здоровье» на кафедре физиологии человека в НГПУ и в учебнике «Физиологические основы здоровья» (ред. проф. Р.И. Айзман, А.Я. Тернер) НГПУ, Новосибирск, Лада, 2001, с.296.
Апробация материалов диссертации.
Основные результаты работы были представлены и обсуждены на: IV Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), I Международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, Феодосия, Крым, Украина, 2002), II Научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М.Г, Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), Научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы здраво-хранения регионов Сибири» (Красноярск, 2003), Чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения А.Д. Слонима «Организм и среда» (Новосибирск, 2004), II Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), официальной апробации ГУ НИИ физиологии СО РАМН (Новосибирск, 2005).
По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 10 статей (2 статьи переведены в Bulletin of Experimental Biology and Medicine) и 12 тезисов.
Объем работы.
Материал диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста и включает 8 рисунков и 12 таблиц. Список использованной литературы состоит из 324 источников, в том числе 288 иностранных.
Благодарности.
Автор приносит свою благодарность Н.Н. Кудрявцевой и А.В. Амикишие-вой за помощь в проведении экспериментов по изучению анксиолитического эффекта ДЭАС и интерпретации результатов, О.П. Черкасовой за помощь в определении кортикостерона методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Современные представления о роли и механизмах действия дегидроэпиандростерона и дегидроэпиандростерон-сулъфата
Изучение различных терапевтических эффектов ДЭА и ДЭАС, а также биологических механизмов, с помощью которых они осуществляются, в настоящее время привлекает пристальное внимание зарубежных ученых. Однако практически нет работ, посвященных исследованию роли данных гормонов в обеспечении устойчивости организма к хроническим стрессорным воздействиям и к развитию патологий, вызываемых длительным действием стресси-рующих факторов, в частности повышенной тревожности. Вопрос о влиянии ДЭАС на стресс-реактивность еще не ставился в мировой литературе, и остаются совсем неизученными механизмы такого эффекта данного гормона. В литературе в основном обсуждается так называемое антиглюкокортикоидное действие ДЭАС (Kalimi et al., 1994; Robinzon, Cutolo, 1999; Wolf, Kirschbaum, 1999; Dubrovsky, 2000), но практически нет исследований, касающихся возможной роли данного феномена при стрессорных воздействиях. Кроме того, и механизм антагонизма между эффектами ДЭА (ДЭАС) и глюкокортикоидов пока еще не выяснен.
Одним из последствий действия стрессоров на человека и животных является развитие тревожности и депрессии (Gregus et al., 2005; Korte, 2005). В литературе имеются единичные работы о влиянии ДЭА и ДЭАС на эти эмоциональные состояния у животных, свидетельствующие об их анксиолитическом и антидепрессивном эффектах, но все они проведены на интактных животных (Melchior, Ritzmann, 1994; Prasad et al., 1997; Reddy et al., 1998). Исследования противотревожного эффекта ДЭА и ДЭАС у животных, подвергавшихся хроническому стрессорному воздействию, еще не проводились. Механизм анксиолитического эффекта ДЭА и ДЭАС исследователи пытаются связать с их влиянием на ГАМКергическую систему (Broekhoven, Verkes, 2003), с рецепторами которой они могут взаимодействовать (Majewska, 1992; Baulieu, 1997; Broekhoven, Verkes, 2003). Но, поскольку эти гормоны являются негативными модуляторами ГАМКА-рецепторов, то реализация их ан ксиолитического эффекта через эту систему имеет мало оснований.
В литературе имеется несколько исследований, свидетельствующих о возможной функциональной связи ДЭАС и опиоидных систем (Reddy, Kulkarni, 1997а; Inagaki et al,, 1999; Stomati et al., 1999). На настоящий момент достоверно установлено, что ДЭАС может оказывать влияние на а-рецепторы (Monnet et al., 1995; Bastianetto, Quirion, 1997; Wolf, Kirschbaum, 1999; Urani et al., 2001), которые долгое время относили к опиоидным, но сейчас предлагают выделять в самостоятельную группу (Маслов и соавт., 2002). Поскольку мы предполагаем, что исследуемые нами эффекты ДЭАС реализуется с участием опиоидных рецепторов, то целесообразно рассмотреть в главе «обзор литературы» роль опиоидных систем в регуляции стресс-реакции организма и тревожного поведения.
Достаточно подробно в литературе освещается участие опиоидных систем в регуляции активности медиаторных, эндокринных систем и поведенческих реакций организма при стрессорных воздействиях (Лишманов, Маслов, 1994; Olson et al., 1996; Vaccarino et al., 1999; Drolet et al., 2001). Однако следует заметить, что в основном, все приводимые в этих работах данные получены при острых стрессорных воздействиях. Относительно роли опиоидных систем при хронических или повторяющихся стрессорных воздействиях сведений очень мало. Пока нет определенного мнения об участии различных типов опиоидных рецепторов в регуляции гормональной стрессорной реакции и тревожного поведения при повторяющихся стрессорных воздействиях, а имеющиеся данные весьма противоречивы.
Таким образом, в связи с вышесказанным, первая часть обзора литературы будет посвящена обзору современных представлений о ДЭА и ДЭАС, их роли в организме и механизмах действия, а вторая часть - сведениям о роли опио-идных систем в проявлении стресс-реакции и тревожного поведения.
ДЭА и ДЭАС - основные гормоны, секретируемые сетчатой зоной коры надпочечников. ДЭА был впервые выделен из мочи в 1934 году Butenandt А. и Tscherning К, и охарактеризован как соединение, обладающее слабой андро-генной активностью (в 10 раз меньшей, чем у тестостерона, который был получен позднее в 1935 году) (Юдаев и соавт., 1976). ДЭАС впервые идентифицирован в моче в 1944, а в плазме крови в 1954 году (Labrie et al., 1997а). В 1965 Baulieu Е.Е. с коллегами показали, что ДЭА секретируется надпочечниками преимущественно в виде сульфатированного эфира. Только 1% гормона циркулирует в крови в виде ДЭА, а остальные 99% в виде ДЭАС (Zumoff et al., 1980). Концентрация ДЭАС в крови приблизительно в 250 и 500 раз выше концентрации ДЭА у женщин и у мужчин, соответственно (Kroboth et al., 1999). ДЭА имеет более короткий полупериод существования - 0,5 - 3 часа, тогда как ДЭАС - 7-20 часов (Haning et al., 1989; Longcope, 1996; Kroboth et al., 1999). Возможно, эта разница обусловлена тем, что ДЭАС более прочно связывается с альбуминами крови, чем ДЭА. 60-80% ежедневно продуцируемого ДЭАС превращается в ДЭА в циркуляторном русле и тканях, тогда как только 5-13% ДЭА метаболизируется обратно в ДЭАС (Kroboth et al., 1999; Wolf, Kir-schbaum, 1999). Стероиды, которые секретируются эндокринными органами, легко проникают через гематоэнцефалический барьер, ДЭА, в силу своей жирорастворимой природы, в большей степени, чем ДЭАС. Проникновение ДЭАС через гематоэнцефалический барьер может осуществляться с вовлечением полипептида, транспортирующего органические анионы (Asaba et al., 2000). Однако ДЭА и ДЭАС могут синтезироваться и в мозге (Corpechot et al., 1981; Baulieu, Robel, 1998; Rupprecht, Holsboer, 1999).
В 1980 году было впервые показано, что ДЭА и ДЭАС в значительных количествах присутствуют в мозге. С этим открытием был связан новый всплеск интереса к изучению данных гормонов. Было установлено, что концентрация ДЭАС в мозге грызунов значительно превосходит его низкую концентрацию на периферии: у интактных самцов крыс - 0,26±0ДЗ нг/мл в плазме крови и 1,58+0,14 и 4,89±1,06 нг/мл в переднем и заднем мозге, соответственно (Сог-pechot et al., 1981). В связи с этим для ДЭА(С) и других стероидных гормонов, в значительных количествах содержащихся в мозге и обладающих способностью синтезироваться de novo в нервной системе из холестерина, учеными был введен термин - нейростероиды (Corpechot et al., 1981; Baulieu, 1997; Baulieu, Robel, 1998). Авторы выше приведенных исследований полагают, что образование и накопление ДЭАС в мозге и на периферии регулируются различными механизмами и могут изменяться независимо. Было показано, что введение АКТГ или дексаметазона вызывало изменение уровня ДЭАС в плазме крови, но не влияло на его концентрацию в мозге. Уровень ДЭАС в мозге не изменялся через сутки после кастрации, в то время как тестостерон полностью исчезал из мозга (Corpechot et al., 1981; Baulieu, Robel, 1998). Позже было установлено наличие в центральной нервной системе основных ферментов синтеза и метаболизма данных нейростероидов (Mensah-Nyagan et al., 1999; Zwain, Yen, 1999a,b; Stoffel-Wagner, 2001).
Определение кортикостерона методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии
Содержание кортикостерона в плазме крови крыс определяли методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Черкасова и соавт., 1991; Черкасова, Федоров, 2001). Реактивы. В работе использовали следующие реактивы: гексан, этиловый спирт, метиловый спирт, хлороформ (все дважды перегнанные), ацетонитрил и метиленхлорид. Стандартный раствор кортикостерона (фирмы Koch-Light Laboratories, Великобритания) готовили на этиловом спирте в концентрации 1 мг/мл и хранили при -20С. Рабочие растворы кортикостерона в концентра ции от 2,5 до 20 нг/мкл готовили из стандартов соответствующим разведением этиловым спиртом. Условия хроматографирования. В работе использовали хроматограф «Ми-лихром-1» (НПО «Научприбор», г. Орел), оснащенный хроматографической колонкой из нержавеющей стали размером 2x62 мм, упакованной сорбентом Силасорб С18 (сф, 5 мкм). Число теоретических тарелок по антрацену составило 3000 т.т. В качестве элюента использовали смеси ацетонитрил-вода различного состава. Перед введением в хроматографическую систему элюент фильтровали через пористый фильтр из нержавеющей стали с размером пор 2 мкм и дегазировали под вакуумом или насыщали гелием во избежание появ ления пузырьков воздуха на выходе хроматографической колонки. Скорость подачи элюента составила 100 мкл/мин, длина волны детектирования - 240 нм. Вычисление площадей хроматографических пиков. Площадь вычисляли по формуле S=h х Wi(2, где h- высота хроматографического пика, Wip- ширина пика на половине его высоты. Измерение времени удерживания. Время удерживания анализируемого вещества вычисляли следующим образом: по диаграмной ленте регистратора измеряли расстояние от начала хроматограммы до вершины хроматографического пика в миллиметрах (мм) и делили полученное значение на скорость движения диаграммной ленты (в мм/мин). Экстракция кортикостерона из плазмы крови. В стеклянные пробирки объемом 15 мл помещали 0,5 мл плазмы крови; 0,5 мл бидистиллированной воды; 20 мкл раствора внутреннего стандарта с концентацией 10 нг/мкл. Затем приливали 4 мл гексана, встряхивали в течение 3 минут, органический слой отсасывали водоструйным насосом. К водной фазе приливали 9 мл хлороформа и проводили экстракцию в течение 5 минут. Водный слой отсасывали водоструйным насосом, а органический слой, упаривали порциями в конических пластиковых пробирках, в токе азота при 40С. Остаток растворяли в 24 мкл раствора ацетонитрила в воде (45:55) (дозировали насосом прибора «Мили-хром») и тщательно перемешивали. Для хроматографического анализа брали 8-12 мкл экстракта. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетат кортизона. Определение кортикостерона по калибровочным графикам. Измеряли площадь хроматографических пиков кортикостерона и внутреннего стандарта. Затем вычисляли отношение площади пика кортикостерона к площади пика внутреннего стандарта и по калибровочным графикам определяли количество кортикостерона в нг на 1 мл плазмы крови. Для построения калибровочных графиков использовали плазму крови крысы, бидистиллированную воду и рабочие растворы кортикостерона. Рабочие растворы готовили непосредственно перед работой (с концентрацией 2,5 нг/мл). Брали четыре параллельные пробы плазмы по 0,5 мл, добавляли в каждую пробирку 0,5 мл бидистиллированной воды и 20 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта (с концентрацией 10 нг/мл). Экстракцию и хромато-графирование проводили, как описано выше. По хроматограмме вычисляли отношение площади пика кортикостерона к площади пика внутреннего стандарта, таким образом, получали начальную точку отсчета. Затем брали еще 4 параллельные пробы по 0,5 мл плазмы и добавляли по 5 мкл рабочего раствора кортикостерона и 20 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта. Далее аналогично добавляли каждый раз в 4 параллельные пробы 10, 20, 30, 40, 50, 60 мкл рабочего раствора кортикостерона. Калибровочные графики строили следующим образом: по оси ординат откладывали разность значений для каждой концентрации и начальной точки, по оси абцисс - значения концентраций вводимых в пробу (12,5; 25, 50, 75, 11, 125,150 нг). По оси абцисс, построенной калибровочной кривой, определяли количество гормона в каждой пробе в нг/мл. Для определения концентрации АКТГ в плазме крови использовали стандартизированный набор ELSA-ACTH (Франция). У человека АКТГ представляет собой полипептид, состоящий из 39 аминокислотных остатков. Установлено, что N-концевой пептид 1-24 совершенно одинаков у всех изученных видов позвоночных и его эффекты полностью идентичны эффектам АКТГ, как по биологической активности, так и по продолжительности действия в организме. В связи с этим в настоящее время в клинической и экспериментальной практике предпочитают использовать синтетический полипептид, представляющий собой 1-24 фрагмент АКТГ (синак-тен). В данном наборе используются антитела к 1 -24 фрагменту. Состав набора: 1). 96 пробирок, покрытых моноклональными антителами к N-концевому участку АКТГ; 2). 1251-меченные моноклональные антитела к С-концевому участку АКТГ; 3). 6 стандартов: 0, 20, 50, 300, 800, 2000 пкг/мл. 4). контрольная сыворотка 5) твин 20. В стандартные пробирки, покрытые моноклональными антителами, помещали 200 мкл стандарта, контрольной сыворотки или пробы и добавляли 100 мкл ,251-меченных моноклональных антител к АКТГ. Инкубировали в течение 20±2 часов. После инкубации содержимое пробирок сливали и промывали три раза водным раствором твина. Радиоактивность измеряли с помощью гамма счетчика (Гамма-12) по 1 минуте.
Калибровочную кривую строили, откладывая по вертикальной оси средние значения стандартов, по горизонтальной оси - их концентрации. По построенной калибровочной кривой определяли количество АКТГ в каждой пробе, выраженное в пкг/мл.
Действие дегидроэпиандростерон-сульфата на тревожность мышей
Повторный опыт зоосоциальных поражений в агонистических взаимодействиях и длительное проживание в условиях ежедневной угрозы нападения со стороны агрессивного партнера приводят к развитию выраженной тревожности у жертв социальных конфликтов (Кудрявцева, 1999; Kudryavtseva, 1994; Avgustinovich et al., 1997). В нашем эксперименте у особей после 20-дневного опыта поражений (субмиссивные, жертвы) также наблюдалось значительное снижение поведенческой активности в тестах «перегород „ ка» и «КЛ», что свидетельствовало о повышенной тревожности этих живот ных.
У субмиссивных мышей в тесте «перегородка» (табл. 4 и 5) были значительно снижены: общее время, проведенное у перегородки в реакции на знакомого (U=5,5; р 0,001) и незнакомого (U=26; р 0,05) партнеров; среднее время, проведенное у перегородки за один подход (U=23; р 0,05) и число подходов к перегородке в реакции на знакомого партнера (U=7; р 0,001) по сравнению с контрольными самцами.
В тесте «КЛ», также как и в тесте «перегородка» у субмиссивных животных были выявлены существенные различия в поведении по основным показателям теста, характеризующим уровень тревожности, по сравнению с кон » трольными мышами (табл. 6). У субмиссивных мышей были снижены пара метры: % числа выходов в открытые рукава (U=23,5; р 0,05); % времени, про-веденного в центре лабиринта (U=21; р 0,05); общее число входов/выходов в открытые и закрытые рукава (U=20; р 0,05) и число заглядываний под лабиринт (U=15; р 0,01). При этом % времени, проведенного в закрытых рукавах (U=19; р 0,05), у субмиссивных мышей был существенно выше, чем у контрольных животных.
Таким образом, в тесте «перегородка», характеризующем уровень коммуникативности животных по их реакции на партнера в соседнем отсеке клетки, у субмиссивных мышей, по всем регистрируемым показателям, наблюдалось снижение стремления к социальным контактам (коммуникативности), что, как принято считать, свидетельствует о повышенной тревожности (File, 1985). В тесте «КЛ», который оценивает поведение в новых аверсивных условиях (Lister, 1987), такие животные также демонстрировали высокий уровень тревожности; они меньше времени проводили в центре лабиринта и выходили в открытые рукава по сравнению с контрольными самцами, но больше времени проводили в закрытых рукавах. Возможно, тревожность у жертв 20-дневных социальных конфронтации носит генерализованный характер, т.к. проявляется в различных тестовых ситуациях. Кроме того, снижение у субмиссивных мышей таких показателей как общее число входов/выходов в тесте «КЛ» и число подходов в тесте «перегородка» указывает на снижение двигательной активности у животных вследствие хронического опыта социальных поражений.
Однократное введение ДЭАС субмиссивным мышам привело к увеличению их поведенческой активности в реакции на знакомого партнера за перегородкой, как в первый, так и во второй день после инъекции препарата (табл. 4). По сравнению с субмиссивными животными, которым вводили физиологический раствор, у них в первый день возросли следующие параметры поведения: общее (U=4; р 0,001) и среднее (U=23; р 0,05) время, проведенное у перегородки, и число подходов к ней (U=6,5; р 0,001). Во второй день были выше общее (U=13,5; р 0,01) время, проведенное у перегородки и число подходов к ней (U=12; р 0,01). Причем поведение субмиссивных мышей после введения ДЭАС по всем исследуемым параметрам не отличалось (р 0,05) от поведения контрольных животных, которым вводили физиологический раствор.
В характере поведения мышей с опытом социальных поражений, в реакции на незнакомого партнера за перегородкой, после однократного введения ДЭАС не наблюдалось статистически значимого изменения по сравнению с субмиссивными животными, которым вводили физиологический раствор ни в первый, ни во второй день после инъекции препарата (табл. 5). Однако общее время пребывания у перегородки у субмиссивных мышей в первый день после введения гормона, в отличие от жертв социальных конфронтации, которым вводили физиологический раствор, не отличалось (р 0,05) от поведения кон-трольных животных. Сравнение поведения субмиссивных животных после введения ДЭАС с поведением жертв, которым вводили физиологический раствор, в тесте «КЛ» показало повышение их поведенческой активности по основным параметрам теста, характеризующим тревожность (табл. 6). У них изменились следующие из регистрируемых показателей: увеличились % числа выходов в открытые рукава (U=26; р 0,05) и % времени, проведенного в центре (U=23; р 0,05) ла биринта, а % времени, проведенного в закрытых рукавах, наоборот, умень шился (U=23; р 0,05). В результате по всем исследуемым параметрам поведе ние жертв после введения ДЭАС не отличалось от поведения контрольных животных, которым вводили физиологический раствор.
Оценка участия ц-опиоидных рецепторов в лимитирующем стресс-реактивность эффекте дегидроэпиандростерон-сульфата у крыс
Следует отметить, что, несмотря на многочисленные данные литературы, свидетельствующие о различных терапевтических эффектах ДЭА и ДЭАС, в том числе при лечении патологий, которые, как известно, могут развиваться и вследствие длительного или чрезмерного действия на организм стрессирую-щих факторов, их роль при хронических стрессорных воздействиях остается практически неизученной. В литературе есть только одно исследование, направленное на изучение антистрессорного эффекта ДЭА при многократно повторяющемся стрессорном воздействии (Ни et al., 2000). Однако эта работа не позволяет сделать какой-либо вывод о влиянии ДЭА(С) на стресс-реактивность организма, поскольку в данном исследовании у животных измерялся только базальный уровень кортикостерона перед последним стрессор-ным воздействием, но не регистрировалось его изменение в ответ на стрес сорное воздействие. Кроме того, гормон вводился животным ежедневно в те чение 2-х месяцев, на протяжении которых крысы подвергались ежедневному 2-х часовому рестрикционному стрессу. Такой способ введения может приводить к подавлению собственной эндогенной системы синтеза ДЭА и ДЭАС в надпочечниках и нервной системе, а также нарушению функционирования гонад, т.к. ДЭА является предшественником половых гормонов (Allolio, Arlt, 2002).
Задачей же нашего исследования было установить характер влияния ДЭАС именно на стресс-реактивность организма при многократно повторяющемся и однократном стрессорных воздействиях. Поэтому уровень АКТГ и кортикостерона у животных мы измеряли непосредственно сразу после стрессорного воздействия. Кроме того, многократно повторяющееся стрессорное воздейст вие встряхиванием животных на лабораторном встряхивателе, используемое в нашем эксперименте, приводило к снижению реакции ГГАКС на повторно применяемые воздействия. А именно, стресс-индуцируемые уровни АКТГ и кортикостерона у крыс после такого воздействия были значительно ниже, чем после однократного стрессирования. Ранее в нашей лаборатории было показано снижение у самцов крыс реактивности ГТАКС на многократно повторяемые водные и родоновые процедуры (Обут, 1994b). Снижение у самцов животных стресс-реактивности при различных повторных стрессорных воздействиях отмечено и другими авторами (Mikulaj et al., 1974; Keim, Sigg, 1976; Giralt, Armarie, 1989).
Меерсон Ф.З. (1986) выделяет, по крайней мере, три характерных процесса, развивающихся в организме при адаптации к повторным стрессорным воздействиям: 1) адаптивное увеличение мощности стресс-реализующих систем; 2) регуляторное снижение мобилизуемости таких систем, проявляющееся угасанием стресс-реакции; 3) десенситизация нервных центров и исполнительных органов. Под увеличением активности стресс-реализующих систем при повторных стрессорных воздействиях подразумевается, например, увеличение активности тирозингидроксилазы - ключевого фермента синтеза катехолами нов и повышение содержания катехоламинов в надпочечниках и мозге. Каза лось бы, это явление при стрессорной ситуации должно привести к возникновению повышенной стрессорной реакции. Однако увеличение мощности стресс-реализующих систем сопровождается торможением мобилизации этих систем и угасанием стресс-реакции в ответ на стрессирующую ситуацию, о чем свидетельствует снижение стресс-индуцируемого уровня кортикостерона и АКТГ. Причем такое снижение не связано с истощением функциональных возможностей надпочечников. Также при адаптации к повторным стрессорным воздействиям продемонстрировано явление десенситизации в виде снижения количества адренорецепторов в мозге и их сродства к катехоламинам, и снижения количества рецепторов к кортикостерону. Эти данные позволяют предполагать, что в основе адаптации организма к многократно повторяюще муся воздействию стрессорной ситуации лежит активация механизмов, кото-рые тормозят возбуждение высших адренергических центров, выход рели зинг-факторов, АКТГ и, таким образом, предотвращает подъем уровня кате-холаминов и кортикостерона в крови при повторном стрессорном воздействии.
Обнаруженное в наших экспериментах снижение реактивности ГГАКС при многократно повторяющемся стрессорном воздействии также не связано с истощением функциональных возможностей надпочечников или ГТАКС в целом. Ранее Обутом Т.А. было показано, что подкожное введение самцам крыс экзогенного АКТГ вызывало одинаковое повышение 11-ОКС в плазме крови у контрольных крыс и у крыс после многократно повторяющегося стрессорного воздействия встряхиванием (Обут, 1994Ъ). Размеры клеточных ядер пучковой зоны надпочечников, секретирующей глюкокортикоиды, тоже свидетельствовали скорее об активации, а не истощении зоны. На повышение функциональных возможностей ГТАКС указывало и то, что восстановительный период данной системы после ее активации многократно повторяющимся стрессор-ным воздействием сокращался вдвое (со 120 до 60 минут), по сравнению с однократным воздействием. Кроме того, у животных после многократно повторяющегося воздействия встряхиванием было отмечено снижение реактивности ГТАКС на активирующее влияние агониста р-адренорецепторов. Снижение стресс-реактивности, отсутствие истощения ГГАКС, а также повышение ее функциональных возможностей, согласно Меерсону Ф.З., является одним из звеньев адаптации организма к повторным стрессорным воздействиям. Следовательно, исследование влияния введения ДЭАС на стресс-реактивность у хронически стрессированных животных в наших экспериментах осуществлялось с использованием стрессорного воздействия, приводящего к снижению у них стресс-реактивности на повторно применяемые воздействия, носящему адаптивный характер.
Изучая действие ДЭАС на стресс-реактивность, мы установили, что его введение оказывает лимитирующий стресс-реактивность эффект у самцов крыс, который выражался в снижении у них стресс-индуцируемых уровней АКТГ и кортикостерона в плазме крови. Причем данный эффект при наших » условиях был выявлен только у крыс после многократно повторяющегося стрессорного воздействия, а при остром воздействии не проявлялся. Нельзя исключать, что при однократном стрессорном воздействии отсутствие лимитирующего стресс-реактивность эффекта ДЭАС связано с недостаточной дозой вводимого препарата. Однако следует отметить, что при многократном стрессорном воздействии все используемые нами дозы ДЭАС: 1, 5, 30 мг/кг оказались одинаково эффективными для его лимитирующего стресс-реактивность влияния. Тогда как при остром воздействии даже самая высокая из этих доз была неэффективна. Введение животным более высокой дозы ДЭАС - 60 мг/кг при многократно повторяющемся воздействии не оказывало лимитирующего стресс-реактивность эффекта, как другие используемые дозы. Кроме того, в наших экспериментах не было выявлено повышения уровня эндогенного ДЭАС в плазме крови при однократном стрессорном воздействии.
