Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. "Стресс-реактивность рыб, факторы, ее определяющрїе, и методы ее коррекции" 9
1.1. Особенности проявления общего адаптационного синдрома (ОАС) и стресс-реактивность рыб 9
1.2. Генетические факторы стресс-реактивности 12
1.3. Физиологические механизмы стресс-реактивности 15
1.3.1. Нейрогуморальные реакции 15
1.3.2. Механизм адаптации в системе водно-солевого равновесия 17
1.3.3. Механизм адаптации гематологических реакций 19
1.4. Иммунологические механизмы стресс-реактивности 22
1.4.1. Неспецифические гуморальные факторы иммунореактивности 23
1.4.2. Клеточные факторы иммунореактивности 30
1.5. Поведенческие реакции 31
1.6. Использование антистрессовых препаратов в аквакультуре 33
Глава 2. Материал и методы .40
2.1. Объекты исследований 40
2.2. Методы исследований 41
2.3. Постановка экспериментов 43
2.4. Характеристика антистрессового препарата "Писцин" и тестирование его активности 44
2.5. Опытно-производственные испытания писцина 46
Глава 3. Оценка стресс-реактивности рыб 50
3.1. Оценка стресс-реакции рыб в зависимости от вида и силы воздействия стресс-факторов 50
3.2. Влияние стресс-факторов на пищевую активность рыб 59
3.3. Тестирование стресс-устойчивой группы форели 62
Глава 4. Испытание антистрессового препарата "писцин" с целью коррекции негативных последствий стресса у рыб 65
4.1. Отработка условий сохранности биологической активности препарата "Писцин" 65
4.2. Отработка эффективных методов использования препарата "Писцин" на рыбе 69
4.3. Испытание писцина с целью коррекции стресса на молоди рыб 75
4.4. Испытание писцина в условиях транспортировки 78
Глава 5. Влияние писцина на общую резистентность рыб 84
5.1. Восприимчивость атлантического лосося к "некрозу спинного плавника" 84
5.2. Уровень поражения толстолобиков сапролегнеозом 86
Заключение 88
Выводы 94
Литература 97
Приложение 116
- Генетические факторы стресс-реактивности
- Иммунологические механизмы стресс-реактивности
- Характеристика антистрессового препарата "Писцин" и тестирование его активности
- Отработка эффективных методов использования препарата "Писцин" на рыбе
Введение к работе
Выращивание рыбы в условиях аквакультуры постоянно сопряжено с влиянием на нее различных факторов среды, к которым ее организм вынужден приспосабливаться. Приспосабливаемость, или способность адаптироваться к меняющейся обстановке, И.И.Шмальгаузен (1968) определил "одним из самых замечательных свойств живых существ".
Свойство адаптирования обладает универсальностью, так как присуще любой саморегулирующейся системе (Ковальский, 1982). Оно обеспечивает нормальное существование животного организма через сохранение постоянства внутренней среды, определяемой как гомеостаз (Казанский, 1977; Серавин, 1977). В процессе эволюции у животных выработалась сложная система адаптивных механизмов, реализация отдельных звеньев которой определяет физиологическую реактивность вида (Хайдарлиу, 1984).
Изучение адаптивных механизмов у рыб особенно актуально в связи с их промышленным выращиванием. Оно позволяет выяснить особенности адаптивных проявлений, определить степень пластичности вида и решать конкретные вопросы акклиматизации рыб как объектов аквакультуры и разрабатывать технологии их выращивания (Виноградов и др., 1986; Багров, 1993).
Комплекс рыбоводных воздействий на рыбу, таких, как облов, сортировка, кратковременное выдерживание на воздухе и пересадка, принято определять обобщающим термином "хендлинг" (handling) (Vedemeyer, 1976), а ответную реакцию организма - "хендлинг-стрессом" (Pickiring, 1981). Негативные последствия хендлинга особенно значимы для стресс-реактивных рыб, например, толстолобиков, потеря которых (прямая или опосредованная) от стресса может составлять от 20 до 50% (Крепис, 1989; Чертихин, 1993).
Поэтому столь важно понять и правильно оценить значение того или иного стрессора или их синергическое действие на рыбу в аквакультуре, однако этого нельзя сделать без комплексного подхода к изучению механизмов адаптации на клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях.
Диагностика стресса у рыб направлена на выявление первичных или вторичных его эффектов, которые проявляются в виде отклонений от нормы физиолого-биохимических показателей. Проведение таких исследований достаточно трудоемко и не всегда доступно практикам. Последние достижения биологической и медицинской науки направлены на разработку экспрессивных методов определения биохимических параметров биологических жидкостей. Принцип проведения таких анализов основан на полуколичественном быстро протекающем на твердой фазе методе. На рыбе они впервые были применены для определения биохимического состава слизи (Лебедева, Головкина, 1989 а). Оказалось, что этот метод достаточно прост в применении и отвечает современным требованиям к экспресс-диагностикумам.
В мировой аквакультуре в настоящее время при заболеваниях рыб наблюдается тенденция к использованию биологически активных препаратов, в том числе и в ультрамалых дозах. Универсальность функционального значения ультрамалых доз может служить примером энергетически экономного пути развития биоты (Лебедева и др., 2002, а). В живых организмах в ультрамалых концентрациях проявляют свою активность гормоны, нейромедиаторы, нейропептиды и феромоны (Бурлакова и др., 1990). Одним из таких феромонов - феромон тревоги карповых рыб - был впервые обнаружен в коже гольяна в 1941 г. Карлом фон Фришем (Karl von Frisch) и назван им "Schreck stoff", т.е. отпугивающим веществом, или веществом испуга, вызывающим стресс (Frisch, 1941). Он проявляет свое отпугивающее действие на рыб в разведении 10"6 от исходного водного экстракта кожи. Дальнейшие исследования показали, что содержащиеся в коже биологически активные соединения обладают широким спектром действия, в частности гормональным и феромональным (Лебедева, Головкина, 1989 б; Лебедева и др., 1993 a; Lebedeva, 1999). В том числе было выявлено, что стресс, вызываемый экстрактом кожи рыб в относительно высоких концентрациях, может корректироваться более низкими (Лебедева, Головкина, 1993). В связи с вышесказанным появилась возможность проверить эффект антистрессового действия одного из таких биологически активных веществ - водорастворимого препарата "Писцин", вырабатываемого по авторской технологии из кожи карпа (Томкевич и др., 1999).
Целью данной работы являлось оценить стресс-реактивность рыб — основных объектов отечественного рыборазведения с использованием принципиально нового для аквакультуры метода экспресс-диагностики стресса и отработать способ коррекции негативных последствий стресса с помощью биологически активного препарата "Писцин".
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Определить стресс-реактивность отдельных видов рыб, выращиваемых в аквакультуре России, по изменениям биохимического состава наружной слизи и крови.
2. Оценить течение общего адаптационного синдрома у рыб в зависимости от вида и силы стрессора.
3. Определить влияние стресс-факторов на пищевую активность рыб.
4. Выяснить воспроизводимость и стабильность седативной активности препарата "Писцин".
5. Испытать антистрессовое действие писцина в условиях транспортировки рыб и при хендлинге (биотехнические манипуляции с рыбой).
6. Оценить влияние писцина на резистентность рыб к некоторым заболеваниям.
7. Провести сравнение стресс-реактивности различных видов рыб на хендлинг.
Научная новизна. Впервые оценена стресс-реактивность рыб на основе использования принципиально нового для аквакультуры полуколичественного метода экспресс-диагностики стресса с помощью мульти- и глюкостиксов. На
основе полученных данных определена специфичность изменений наружной слизи у различных видов рыб и их стресс-реактивность.
Впервые получены материалы по коррекции стресс-реакции рыб -основных объектов аквакультуры биологически активным антистрессовым препаратом "Писцин", используемым в ультрамалых дозах.
Практическая значимость. Полученные данные направлены на оценку здоровья рыб в аквакультуре и могут применяться в качестве критерия их стресс-реактивности; разработаны эффективные способы использования антистрессовго препарата "Писцин" для предупреждения и коррекции стресс-реакции у рыб, выращиваемых в аквакультуре. Отработаны физиолого-биохимические параметры, которые могут служить критериями оценки стресс-устойчивости при проведении селекционно-племенных работ. Полученные данные по изменению активности питания после хендлинг-стресса следует учитывать при кормлении молоди осетровых рыб и карпа.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены и обсуждались на следующих международных конференциях: "Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб", Борок, 2003; Чтения посвященные памяти профессора В.А. Мусселиус-Богоявленской, Рыбное, 2003; "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов", Петрозаводск, 2004 и на годовых отчетных сессиях ФГУП "ВНИИПРХ".
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ и 1 в печати.
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю к.б.н. П.П. Головину, д.б.н. Н.А. Головиной, сотрудникам кафедры ихтиологии МГУ к.б.н. Н.Е. Лебедевой и научному сотруднику Т.В. Головкиной за помощь при выполнении работы и ряд ценных замечаний; сотруднику отдела НТЦ "Аквакорм" ФГУП "ВНИИПРХ" к.б.н. А.В. Линнику за совместную работу; специалистам Ардонского и Умского рыбоводных заводов и форелевого хозяйства "Сходня" за предоставленную возможность сбора материала; сотрудникам медицинского центра "Омела" за приготовление и предоставление к испытаниям препарата "Писцин" и всем сотрудникам лаборатории ихтиопатологии ФГУП "ВНИИПРХ" за всестороннюю помощь и поддержку.
Генетические факторы стресс-реактивности
Физиологические признаки рыб, включая признаки поведения, подчиняются основным законам количественного наследования и зависят от большого числа генов (Кирпичников, 1979). Хотя эффект каждого из них обычно незначителен. Существенное влияние на проявление количественного признака может оказать взаимодействие генетических факторов и условий окружающей среды (Катасонов, Черфас, 1986). Стрессовая реакция формируется в онтогенезе по принципу организации очередных функциональных систем, и, в первую очередь, на те стресс-факторы, к которым молодому организму необходимо адаптироваться в раннем периоде. В основе этого лежат изменения генетического материала, выражающиеся в модификации последовательности оснований в молекуле ДНК (Хайдарлиу, 1984). Способность к миграциям молоди рыб зависит от генетических факторов, хотя большую роль здесь играет паратипическая изменчивость (Raleigh, Champman, 1971; Refstie et al., 1977). Предпочитаемая температура наследуется полигенно. Это установлено при исследовании гибридов между озерным и речным гольцами (Кирпичников, 1979). Способность антлантических и тихоокеанских лососей к возврату в "свои" реки, ручьи и озера также наследуется полигенно. Было показано, что эта способность различна в разных линиях и инбридированных семьях (Brannon, 1967; Carlin, 1969; Bowler, 1975; Bams, 1976). Об этом И.И. Шмальгаузен писал: "Если в новой среде произошла адаптивная модификация, то тем самым и соответствующая мутация, т.е. генокопия получила адаптивное значение и может стать предметом естественного отбора, если она чем-либо выделяется в общей адаптивно модифицированной популяции" (Шмальгаузен, 1968). В основе формирования стрессовой реакции лежат такие физиологические, биохимические и структурные преобразования в организме, которые обеспечивают сохранность гомеостаза в новых условиях существования (Фурдуй, 1986). Вовлечение генома в эти преобразования может выражаться в избирательной активации отдельных генов, что позволяет синтезировать новые макромолекулы в соответствии с имеющимся кодом (Хайдарлиу, 1984).
Однако эффект вовлечения этого механизма, выражающийся в биосинтезе определенного числа макромолекул, длится от одного до нескольких часов и даже суток. Поэтому при резком изменении условий среды и необходимости в срочном ответе значительная часть реакций организма обеспечивается за счет сдвигов модуляционного типа, реализующихся путем приспособительного изменения активности синтезированных ранее макромолекул (Хайдарлиу, 1984). Стресс-реактивность организма зависит от многих причин, в том числе от генотипа. У животных имеются генетические механизмы устойчивости и предрасположенности к нарушению отдельных функциональных систем, которые проявляются в условиях острого стресса. Например, один и тот же стрессор у разных видов рыб может вызывать различное проявление стрессовых реакций (Фурдуй, 1986). На различных видах животных показано, что одной из причин выявленных различий особей по степени стресс-реактивности заключается в генетических особенностях неспецифической, стрессовой реактивности. Они выражаются в характере физиологических реакций коры надпочечников и устойчивости организма, главным образом при стрессовых воздействиях.
Следовательно, генетически обусловленные определенные физиологические состояния (стресс-реактивность и стресс-устойчивость) могут обнаруживаться в фенотипе только в условиях стрессовой ситуации (Фурдуй,1986). Индивидуальные различия в биохимической и физиологической реактивности рыб проявляются также при использовании генетически однородного материала, в одно и то же время суток и при всех прочих равных условиях эксперимента (Запруднова, 1989). В пределах каждой группы существуют вариации стрессустойчивости и стрессреактивности к одному и тому же воздействию, что проявляется в неодинаковой чувствительности и устойчивости различных особей к тому или иному фактору. Например, при изучении индивидуального реагирования особей гольяна и форели на такие стресс-факторы, как хэндлинг и перемещение в новую обстановку, выявлены особи, стабильно сохраняющие активную или пассивную тенденцию реагирования на стресс (Запруднова, 1989). В качестве показателей стресс-реактивности необходимо использовать признаки, постоянно определяемые у культивируемых видов рыб и чувствительность последних к воздействию природных и технологических факторов (Вихман, 1996). Их прежде всего следует учитывать при селективном отборе рыб, в том числе на устойчивость к заболеваниям. К.Правин с соавторами (Praveen et. al., 2001) предполагает, например, отбирать только тех особей, которые после стресса показывают низкий уровень кортизола, высокий сывороточный лизоцим и высокую внеклеточную сверхокисляемую продукцию. Е.С.Е.Хафес (Hafes, 1968), относя к генотипической адаптации наследственные характеристики животных, которые обеспечивают существование популяции в определенных условиях окружающей среды и изменяются в ходе эволюции на протяжении многих поколений (естественная селекция), добавил также приобретение специфических генетических свойств, появляющихся и закрепляющихся в результате селекции, осуществляемой человеком.
Иммунологические механизмы стресс-реактивности
Устойчивость рыб к стресс-факторам обусловлена деятельностью гомеостатических систем, в том числе и иммунной, которая рассматривается как система контроля, обеспечивающая индивидуальность и целостность организма, в первую очередь, для защиты от возбудителей болезней. Деятельность иммунной системы рыб регулируется общими физиологическими системами, причем ведущая роль принадлежит нейро-эндокринной системе и метаболическим тканевым механизмам (Лукьяненко, 1971; Поленов, 1971, 1988; Микряков, 1978; Матей, 1979; Баранникова и др., 1983). Согласно современным представлениям, регуляцию иммунологических функций при стрессе у рыб осуществляют кортикостероидные гормоны (кортизол и кортизон) или гормоны дистресса (Микряков, 2003). Способность к иммунному ответу появляется у рыб на определенных стадиях развития. Функциональная активность иммунной системы зависит от двух факторов, включающих внутренние (организменные) и внешние регуляторные воздействия (Вихман, 1996). Впервые в филогенетическом ряду у хрящевых рыб обнаруживаются все виды клеток, при кооперативном взаимодействии которых реализуются иммунологические реакции. Костистые рыбы - более высокоорганизованные гидробионты, чем хрящевые, и, соответственно, система органов иммунитета у них сложнее и обладает более развитыми структурами (Темниханов, Клименко, 2003 а). При реагировыании рыб на различные по своей природе стресс-факторы иммунофизиологическая активность их отличается по выраженности, динамике и направленности, а также по взаимосвязи показателей (Лукьяненко, 1971; Hazel, Prosser, 1974; Snegaroff, Bach, 1990; Микряков, 1991; Вихман, 1996). Хендлинг, увеличенные посадки и другие стрессовые факторы современной аквакультуры негативно отражаются на резистентности рыб и при наличии возбудителя способствуют возникновению болезни (Snieszko, 1974). Успешное выращивание рыбы в аквакультуре в конечном итоге зависит от того, насколько она адаптирована к условиям содержания.
Согласно современным представлениям о физиологической адаптации, можно полагать, что ее неспецифические компоненты базируются на механизмах резистентности (Крючков, 1998). Прежде всего, патогену необходимо преодолеть физические и химические барьеры, составляющие первую линию защиты. Особая роль здесь отводится эпителиальным покровам кожи, жабр и пищеварительного тракта, которые в норме наряду с осморегуляцией играют важную роль в качестве механических средств противомикробной и противовирусной защиты (Lamers, 1985; Лукьяненко, 1989). Кожа рыб и ее специфический секрет - наружная слизь тесно связаны с метаболизмом всего организма и вместе с тем самостоятельно выполняет многочисленные функциональные нагрузки (Lebedeva, 1999). Они служат для организма защитным барьером от механических, физических, химических, а также других - абиотических и биотических факторов окружающей среды (Лебедева, 2001). Известно, что кожа рыб принимает участие в обмене веществ всего организма. В частности, кожа пресноводных рыб участвует в процессах обмена воды, газов и солей. При этом изменяется ее проницаемость, что показано на примере перераспределения в организме ионов натрия, калия при стрессе. Интенсивный минеральный обмен в коже влияет на процессы осморегуляции целого организма (Коштоянц, 1950; Строганов, 1962).
Сдвиги метаболизма, происходящие в организме рыб, находят отражение в изменении состава наружной слизи. Так, в слизи карпа (Cyprinus carpio) и радужной форели {Oncorhynchu mykiss) при развитии синдрома стресса выявлено изменение ионного состава, а у белого толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix) появление гемоглобина (Лебедева и др., 1988). Изучение возможных изменений в составе наружной слизи рыб под воздействием различных факторов позволило предположить, что биохимические параметры слизи могут служить своеобразными индикаторами изменений в окружающей среде. Оценка совместного воздействия нескольких факторов на рыб дает возможность полнее характеризовать свойства окружающей среды для гидробионтов. Под влияние природных химических сигналов (репелентов) как у мирных (Лебедева и др., 1988), так и у хищных рыб (Лебедева и др., 1993, а) отмечаются биохимические изменения слизи, которые достигают максимума через 2 часа после начала стресса. Найденные различия изменений в количестве гемоглобина в слизи линя (в 3 раза выше) и карпа при воздействие кайромонов могут свидетельствовать о различной реактивности видов (Лебедева и др., 1998). Известно, что суммарное воздействие стресс-факторов вызывает изменение концентрации гемоглобина, отличное от вызванного одним стрессором. Например, транспортировка у линя не приводит к изменению концентрации гемоглобина в слизи, кайромон же хищника вызывает увеличение этого показателя в 5 раз, тогда как совместное воздействие этих стрессоров привело к увеличению этого параметра лишь в 3 раза (Лебедева и ДР., 1998). Изменение состава слизи под воздействием солей тяжелых металлов, таких, как свинец, цинк и медь, проявляется в виде резкого увеличения концентрации гемоглобина, возрастания удельный массы, концентрации водородных ионов и уменьшения количества белка в слизи (от 20 до 50% от нормы) (Восилене и др., 1999; Лебедева и др., 1998). Последнее может служить одним из объяснений поражающего действия тяжелых металлов - уменьшение содержания белка приводит к нарушению защитной функции секрета и способствует увеличению проникновения инфекции в организм (Лебедева, 2001). Обнаружено изменение биохимического состава слизи в различные сезоны года, что проявляется в изменениях концентрации электролитов в слизи, но это не влияет на их соотношение (Лебедева и др., 1988; 1989). Отмечена корреляция интенсивности гелиофизических факторов с динамикой биохимических параметров в слизи рыб (Лебедева и др., 1994).
Характеристика антистрессового препарата "Писцин" и тестирование его активности
Писцин является антистрессовым препаратом биологического происхождения, изготовленным по авторской гомеопатической технологии (Томкевич и др., 1999). Эффект его воздействия на рыб проявляется в ультрамалых дозах (УМД) (Лебедева и др., 1999). Это бесцветная жидкость, содержащая водный экстракт из кожи карповых рыб и 16% этилового спирта. Сырьем для изготовления препарата служит лиофилизированный экстракт кожи карпа. Для наших экспериментов препарат готовили одновременно от пяти трехгодовиков карпа. Были взяты со спины участки кожи ниже спинного плавника и выше боковой линии площадью около 8 см от каждой рыбы. Кожу измельчали и экстрагировали в десятикратном объеме воды. Экстракт лиофилизировали. Из полученного лиофилизата приготавливали маточный раствор сырца Дь который путем дробного разведения доводили до ультрамалых доз (Д"15 - Д 20), таким образом, получали активную субстанцию, то есть препарат "Писцин", в который в качестве консерванта добавляется этиловый спирт. Для тестирования было использовано пять полученных таким способом образцов, приготовленных по гомеопатической технологии (в разведении Д"15 и Д"20), которые показали наличие индивидуальных отличий эффекта их действия. Для стандартизации эффекта и устранения этих различий был приготовлен еще один образец (шестой) из смеси всех пяти полученных препаратов. В дальнейшем в основном из 6-го образца было приготовлено 5 препаратов. Первичную оценку активности препарата проводили с помощью тест-объекта ресничной инфузории спиростомы (Spirostoma ambiguum). За основу принята их спонтанная двигательная активность (СДА), свойственная донервным организмам, которых используют при изучении закономерностей эффекта воздействия ультрамалых доз на организм (Тушмалова и др., 1998).
Поведение спиростом исследовали методом "открытого поля". Критерием двигательной активности служил индекс двигательной активности - число пересечений спиростомой визира окуляра бинокуляра в единицу времени. Тестирование препарата по показателю спонтанной двигательной активности спиростом и отработку условий сохранности его биологической активности проводили на кафедре ихтиологии Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова совместно с кандитадом биологических наук Лебедевой Н.Е. и старшим научным сотрудником Головкиной Т.В. В дальнейшем на рыбах использовали только те партии препаратов, в которых седативный эффект на инфузориях достигал 60-80% от контроля. Опыты по отработке эффективных методов использования писцина проводили в аквариальных условиях на двухлетках пестрого толстолобика. Полученную рыбу из ЭПО "Якоть" рассаживали в проточные емкости из расчета 100 шт./м при температуре воды 8 С. После 14-дневной адаптации рыбу подвергали хендлингу и, составляя группы по 10 шт., пересаживали в проточные аквариумы. Писцин применяли непосредственно перед стрессированием, после, а также до и после стрессирования рыбы согласно схеме, представленной ниже в табл. 2, 3, 4. Испытание писцина с целью коррекции стресса у молоди ленского осетра проводили на производственной базе КЗТО. Интактной (1-я группа) служила исходная рыба на заводе. Две опытные (2-ю и 3-ю) группы рыб подвергали хендлингу (отлов из бассейна, осмотр, выбраковка особей с признаками миксобактериоза), а затем пересаживали в емкости с дополнительно аэрируемой водой.
Группы формировали по 15 шт. каждая. В воду третьей группы вносили писцин и выдерживали экспозицию в течение 1 ч. Испытание писцина на молоди (двухлетках средней массой 15-20 г) атлантического лосося проводили на Умбском рыбзаводе по схеме, аналогичной опытам, проводимым с ленским осетром. Опыты по испытанию писцина при транспортировке рыбы были поставлены в производственных условиях на двухгодовиках пестрого толстолобика в ЭПО "Якоть", годовиках форели на базе ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" и молоди каспийского лосося (кумже) на Ардонском лососевом заводе. Схема проведения экспериментов на всех предприятиях была аналогичной. Первую группу рыб вылавливали из рыбоводных емкостей до стресса, и она служила исходной технологической нормой. Стресс у рыб 2-й и 3-й групп (опытных) вызывали одинаковыми манипуляциями: отлов, имитация сортировки и транспортировки, пересадка рыбы в другую рыбоводную емкость. Рыбам 3-й группы писцин вносили в воду на этапе "транспортировки", а затем рыбу выдерживали еще 1 час в растворе препарата после пересадки в другой лоток или бассейн. Перед отбором крови, в эксперименте с форелью ее анестезировали в растворе пропоксата (6 мг/л). Работы проводили при температуре воды 12-14 С. Динамику изменений стресс-реакции отслеживали в опытных группах через 1 час после стрессирования, в эксперименте с двухготовиками толстолобика - через 3,5 и 24 часа и спустя 8 и 14 дней.
Отработка эффективных методов использования препарата "Писцин" на рыбе
Изучение эффективности писцина, отработку режимов его внесения (до или после стресса) и поиск оптимального времени обработки им рыбы проводили на адаптированных к условиям аквариальнои двухлетках толстолобика средней массой 350 г. Было проведено три эксперимента: в 1-м писцин добавляли в воду до стресса, во 2-м — после стресса и 3-м - до и после стресса. Схема проведения экспериментов представлена в главе "Материалы и методы" (табл. 2, 3, 4). Стресс вызывали хендлингом (имитацией сортировки и пересадки рыбы). Во всех экспериментах первые две группы (контроль и стресс) были общие. Опытные группы рыб подвергали хендлингу и пересаживали в другие аквариумы соответственно до или после использования писцина. Результаты исследования показали, что стресс, вызванный хендлингом сопровождался увеличением глюкозы в крови (в 2 раза), гемоглобина и кетонов в слизи соответственно в 5 раз и на 33,3%, но не привел к достоверным изменениям гематологических параметров у рыб (табл.10).
Использование писцина за 10-50 мин до стрессирования рыбы (3, 4, 5 и 6-я группы) показало, что такое применение препарата снижает стресс-реакцию толстолобиков. При этом минимальное изменение глюкозы от уровня контроля было отмечено у рыб в 6-й группе, а гемоглобина в слизи в 4-й (табл. 10).
Во второй серии опытов писцин вносили в воду сразу после стрессирования толстолобиков (3-я группа) и продолжали обработку еще в течение 60 мин, а затем проводили оценку физиологического состояния рыбы. Результаты показали, что использование писцина после стресса также снижало стресс-реакцию, как это имело место при внесении препарата перед стрессированием. При этом мы отметили, что уровень глюкозы в крови был на 29%, а гемоглобина в слизи на 50% ниже, чем при стрессе без применения писцина (2-я группа). Кроме этого, произошло восстановления кетонов в слизи до уровня контроля (табл. 11).
В третьей серии опытов писцин вносили до и после стрессирования рыбы в воду 3-й, 4-й, 5-й и 6-й групп соответственно за 10-50 мин до манипуляций и после еще проводили обработку препаратом в течение 60 мин. В результате было показано, что минимальные изменения глюкозы в крови от уровня контроля отмечены в 4-й и 6-й группах соответственно на 16 и 22% выше нормы, а кетонов и гемоглобина в слизи в 3-й и 5-й (табл. 12).
Полученные в экспериментах материалы были использованы для однофакторного дисперсионного анализа для того, чтобы выяснить силу влияния писцина и неучтенных факторов на процесс коррекции стресса при хендлинге. Для расчетов были использованы показатели двух наиболее меняющихся параметров — глюкозы в крови и гемоглобина в слизи. Результаты такого анализа показали (табл. 13), что коррекция стресса под действием писцина наиболее значимо отразилась на изменении концентрации глюкозы в крови и в меньшей степени на гемоглобине в слизи. При этом внесение препарата за 50 мин до стресса по первому показателю дало больший эффект. Оценивая эффективность действия препарата на восстановление обоих параметров, следует сказать, что поставленная задача максимально была решена при комбинированном внесении препарата за 20 и 50 мин до стрессирования и передержка в нем еще 30-60 мин после воздействия стресс-фактора.
Таким образом, проведенные исследования показали, что препарат эффективно работает при кратковременном стрессе небольшой силы. Наилучшей схемой его использования является внесение препарата за 20-30 мин до стрессирования, а затем еще передержка в нем рыбы после воздействия стресс-факторов в течение 30-60 мин. В этом случае писцин не дает полностью развиться стресс-реакции, сдерживая изменения таких лабильных параметров, как содержание гемоглобина в слизи, глюкозы и СГЭ в крови. Это дало возможность перейти к его производственному испытанию при пересадке, сортировке и транспортировке рыбы.
Работу проводили на сеголетках ленского осетра средней массой 140 г в производственных условиях КЗТО. Для оценки исходного физиологического состояния рыбу вылавливали из лотка и тут же отбирали слизь и кровь на анализ (1-я группа). Рыбу 2-й и 3-й групп подвергали хендлингу и рассаживали в емкости объемом 20 л, оснащенные аэрирующим устройством. Для коррекции стресс-реакции в воду 3-й группы рыб после стрессирования вносили писцин.
Результаты проведенных исследований показали отсутствие между опытной и контрольной группами достоверных различий по уровню таких гематологических показателей, как число эритроцитов и содержание гемоглобина в эритроците. Наиболее информативным показателем было содержание глюкозы в крови, которое достоверно выше у стрессированных рыб (2-я группа), чем в контроле. Обработка писцином (3-я группа) привела к нормализации уровня глюкозы (табл.14). При стрессе у рыб 2-й и 3-й групп произошло достоверное уменьшение концентрации белка в слизи. При обработке писцином этот показатель так и не восстановился (табл. 14).
